Summary
Vi beskriver en dramatisk forbedret metode til musen kloning ved hjælp af trichostatin A, vitamin C og deioniseret bovint serumalbumin. Vi viser et forenklet, reproducerbare protokol, der understøtter effektiv udvikling af klonede embryoner. Derfor kunne denne metode blive en standardiseret procedure for musen kloning.
Abstract
Kropsceller (SCNT) giver en enestående mulighed for direkte producerer en klonede dyr fra en donor celle, og det kræver brug af dygtige teknikker. Derudover er effektivitetsgevinsterne af kloning forblevet lave siden den vellykkede produktion af klonede dyr, især mus. Der har været mange forsøg på at effektivisere kloning, og trichostatin A (TSA), en Histon deacetylase hæmmer, har været meget anvendt til at øge effektiviteten af kloning. Her rapporterer vi en dramatisk forbedret kloning metode i mus. Denne somatisk overførsel af cellekerner metode indebærer brugen af Hemagglutinating virus af Japan kuvert (HVJ-E), som giver mulighed for nem manipulation. Desuden er behandling ved hjælp af to små molekyler, TSA og C-vitamin (VC), med deioniseret bovint serumalbumin (dBSA), meget effektiv til embryonale udvikling. Denne tilgang kræver hverken yderligere injektion eller genetisk manipulation, og dermed præsenterer en enkel og egnet metode til praktisk brug. Denne metode kunne blive en teknisk muligt tilgang til forskere til at producere genetisk modificerede dyr fra dyrkede celler. Derudover kan det være en nyttig måde til redning af truede dyr via kloning.
Introduction
SCNT-teknologi giver mulighed for fremstilling af klonede dyr ved hjælp af kun én somatisk celle eller en kerne skal overføres til en kerneløse oocyt. Et af formålene med SCNT teknik er afledning af overførsel af cellekerner embryonale stamceller (NT-sektorrådene) linjer fra klonede embryoner. I 1998, Wakayama mfl., rapporterede producerer en vellykket klonede mus ved navn Cumulina for første gang1. Siden da, kloning af mus har været almindeligt studerede, og mange vigtige indsigter i nukleare omprogrammering af somatiske cellekerner er opnået. På den anden side, denne teknik er ledsaget af talrige micromanipulation trin, som er ganske vanskeligt at master, som kræver intensiv træning af mere end 3 måneder2.
Fremstilling af klonede mus ved hjælp af SCNT har udviklet sig fra den oprindelige Honolulu metode1, den electrofusion metode3, at metoden celle sammensmeltning af Hemagglutinating virus af Japan (HVJ)4. Dog, den direkte indsprøjtning af en cellekerne gennem cytomembrane tendens til at negativt påvirker oocyt overlevelse. Electrofusion er lav i effektivitet, da hver celle membranen har forskellige hårdhed, hvilket gør det vanskeligt at bestemme en optimal tilstand. Håndtering af HVJ er besværlige, fordi det kræver særligt udstyr for sikkerheden for forskere og forsøgsdyr. For nylig, for at sammensmelte donor celle og oocyt cytoplasma, HVJ-E er blevet brugt5. HVJ-E har kun mulighed for at sammensmelte membraner uden at proliferativ eller smitsomme virus. Genomisk RNA'er HVJ er helt inaktiveret i HVJ-E. Brugen af HVJ-E understøtter således let håndtering af cellefusion under SCNT.
Flere rapporter har vist, at behandling af SCNT embryoner med TSA, en Histon deacetylase hæmmer, væsentligt forbedrer produktionseffektivitet af levende unger fra mindre end 1% til 6,5%6,7. TSA behandling accelererer omprogrammering gennem ændring af Histon mærker i SCNT embryoner8. For nylig, injektion af særlige mRNAs, Histon lysin demethylase underfamilie 4 (KDM4), som fjerner Histon H3 lyzin 9 (H3K9) trimethylation i SCNT embryoner, især på reprograming-resistente regioner, har vist sig at øge udviklingen af klonede musen embryoner9. I mellemtiden, har VC, der også fungerer som en Histon modifier, faldt trimethylation H3K910. Derudover forbedrer VC fosterudviklingen i svin SCNT10. Det er blevet rapporteret, at injektion af dBSA i SCNT embryoner fører til en forbedring af fosterudviklingen11.
Vi har tidligere fundet at kombinationen af små molekyler, nemlig TSA og VC, sammen med dBSA, dramatisk forbedret udviklingen af SCNT embryoner12. Her, detalje vi tidligere rapporteret SCNT metoden for mus, som repræsenterer meget effektiv og enkel kloning procedurer12. Vi beskriver også håndteringen af HVJ-E. Disse kunne hjælpe mange forskere inden for udviklingsmæssige og reproduktiv biologi at bevare plantegenetiske ressourcer eller producere genetisk modificerede dyr gennem denne SCNT metode.
Protocol
Alle dyr procedurer i overensstemmelse med retningslinjerne fra Kindai Universitet for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. forberedelse af kultur medier
- Forberede den modificerede KSOM (mKSOM) medium for embryo kultur, bestående af 95 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,35 mM KH2PO4, 0,2 mM MgSO4 · 7H2O, 1.71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM D (+)-Glucose, 0,2 mM natrium pyruvat, 1.0 mM L-glutamin, 1,0 g/L polyvinylpyrrolidon (PVP), 25.07 mM NaHCO3, 10 mM natrium DL-laktat, 0.05 g/L Penicillin og 0,05 g/L Streptomycin i sterilt vand.
- Forberede Hepes-buffered CZB (HCZB) medium for embryo manipulation, bestående af 81.5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · 2H2O, 1.18 mM MgSO4 · 7H2O, 1.18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2Na, 36,1 mM natrium DL-laktat, 5,55 mM D (+)-Glucose, 0,025 g/mL Penicillin, 0,035 g/L Streptomycin, 0.014 mM Phenol rød, 1,0 g/L polyvinylalkohol, 5.0 mM NaHCO3og 20,0 mM Hepes natriumsalt i sterilt vand.
- Forberede oocyt aktivering aktivering medium: mKSOM medium suppleret med 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 µg/mL cytochalasin B (CB) og 5 mM SrCl2.
2. forberedelse af deioniseret bovint serumalbumin (dBSA)
- 1,2 g bovint serumalbumin (BSA) opløses i 10 mL sterilt vand ved stuetemperatur (en endelig koncentration på 12%).
- Tilføje ca. 0,12 g blandet ionbyttende harpiks perler til ovenstående forberedt 12% af BSA i sterilt vand ved stuetemperatur med blid omrøring.
- Når perlerne ændre farve fra blå-grøn til guld, genoprette den supernatanten løsning ved hjælp af en pipette. Derefter erstatte perler med friske dem (figur 1).
Bemærk: Udskiftning af perler er normalt udføres kun en gang. Det kræver måske et par udskiftninger til komplet deionization. Kun som en guide, hvis farven på perler er uændret fra blå-grøn til guld, angiver det, at ionbytning er komplet. - Genskab løsningen efter bekræfter, at der er ingen farveændring i perlerne.
Bemærk: Hvis den gendannede løsning bliver overskyet, centrifugeres den for at forhindre tilstopning filter (175 x g, 5 min). - Supplere den gendannede løsning med 250 µL af 10,5% NaHCO3.
Bemærk: Denne proces er beregnet til dBSA løsning til at neutralisere pH tilstand. NaHCO3 kan dog undværes. - Sterilisere supernatanten ved hjælp af et 0,45 µm filter, og opbevares ved-20 ° C som dBSA stamopløsning.
3. oocyt samling
Bemærk: Alle mus blev opretholdt i lys-kontrollerede og airconditionerede værelser.
- Super-ægløsning hver kvindelige B6D2F1 mus (alderen 8-10 uger) ved intraperitoneal injektion af 7,5 IU af gravide mare serum gonadotropin (PMSG) og 7,5 IU af humant choriongonadotropin (hCG) 48 h efter PMSG injektion.
- Udføre eutanasi af cervikal dislokation 14-16 h efter hCG injektion. Incise maven for at få adgang til forplantningsorganerne ved hjælp af standard dissektion teknikker13. Kort, klemme huden og gøre et lille tværgående snit på midterlinjen med saks. Hold huden fast over og under indsnittet og træk huden mod hoved og hale. Skære bughinden ved hjælp af saks, skubbe bredbånd af tarmen ud af vejen og bekræfte tilstedeværelsen af to horn af livmoderen, at æggelederne og æggestokkene.
- Udrydde æggelederne med små lige saks og pincet, sted på et ark filtrerpapir ind til at tørre blod af overfladen. Angiv æggelederne i mineralsk olie. Derefter skæres op ampulla af oviduct ved hjælp af dissektion nåle, og flytte cumulus-oocyt komplekser kommer fra ampulla af ovidukten i 200 µL dråber HCZB medium med 0,1% hyaluronidase. Inkuber i 5 min på en opvarmning plade.
Forsigtig: En eksponering af længere end 10 min i HCZB medium med 0,1% hyaluronidase ville være skadeligt for oocyter. - Bekræfte, at cumulus cellerne frigives fra cumulus-oocyt komplekser under et stereomikroskop overførsel anden meiotiske metafase (MII) fase oocyter med nogle resterende cumulus celler til mKSOM medium indeholdende 0,3% dBSA. Derefter vask MII fase oocyter fire gange af pipettering op og ned (ved hjælp af en pipette af < 100 µm indre diameter) i mKSOM medium indeholdende 0,3% dBSA for at have afsendt de resterende cumulus celler.
Bemærk: Brugen af en lille pipette letter udstationering af cumulus celler. - Inkuber Mll fase oocyter i mKSOM medium som indeholder 0.3% dBSA ved 37 ° C under 5% CO2 inkubator indtil enucleation.
Bemærk: En lille pipette med en diameter, der er lidt større end oocyt anbefales.
4. forberedelse af Donor celler til overførsel
- Efter trin 3.3-3.5, er blottet oocyter isoleret fra cumulus-oocyt komplekser. Overføre en lille mængde (ca. 2 µL) af de resterende cumulus celler spredes fra cumulus-oocyt komplekser i HCZB medium med 0,1% hyaluronidase til HCZB medium med 6% dBSA ved hjælp af en pipette under et stereomikroskop.
- Placer cumulus celler i HCZB medium med 6% dBSA på opvarmning pladen ved 37 ° C indtil brug for SCNT.
Bemærk: Når fibroblastceller (fx., murine føtal fibroblastceller) er brugt som donor celler, frigør celler fra en vævskultur parabol og centrifugeres dem ind i en pellet. Resuspenderes af celler i HCZB medium som indeholder 6% dBSA.
5. enucleation af oocyter
- Forbered 9% PVP medium ved at tilføje 0,9 g PVP til 10 mL HCZB medium, holde i køleskabet natten over (4 ° C), og derefter sterilisere den ved hjælp af et 0,45 µm filter.
- Forbered CB stamopløsninger (koncentration af 1 mg/mL) ved at tilføje 5 mg af CB til 5 mL af dimethylsulfoxid (DMSO). Fortynd CB stamopløsningen med HCZB medium (en endelig koncentration på 5 µg/mL) og bruge enucleation løsning.
- Vaske Mll fase oocyter i 20 µL af HCZB medium indeholdende 5 µg/mL CB (enucleation løsning) ved indånding og udånding gennem den steriliseret pipette (indvendig diameter: 150 µm til 200 µm). Gentag proceduren for vask fem gange. Vente ca. 10 min. på opvarmning pladen i enucleation løsning før du starter enucleation processen.
- Forberede enucleation kammer, som vist i figur 2A. Overføre Mll oocytter til enucleation kammer ved indånding og udånding ved hjælp af en pipette (indvendig diameter: 150 µm til 200 µm); placere 4 µL af enucleation løsning og dække kammer med mineralsk olie.
Bemærk: I stedet for en afdeling, en coverversion af en 60 mm petriskål kan bruges. - Identificere spindler og kromosomer af MII fase oocyt under et mikroskop (400 X) ved stuetemperatur. Orientere Mll fase oocyt med udtalt første polar kroppen, således at placering af spindel og kromosom er på 3 eller 9 klokken (figur 2B) position ved hjælp af en bedrift pipette og mikropipette.
Bemærk: Mikroskop bruges har linser af 400 X forstørrelse i alt. Mål linse Nielsen er også 5 X / 0,12 og 40 X / 0,55. Piezo puls kørsel af pipetten tillader hurtig boring af zona pellucida. Laser system (f.eks.XYClone) er derudover også anvendelige til boring af zona pellucida i stedet for den piezo drivende system. - Indstil piezo puls intensitet til 3-6, og bore til zona pellucida ved hjælp af en micromanipulation pipette (7-8 µm indre diameter fladskærms-ended tip) med piezo pulsen kørsel. Når du har åbnet et hul i zona pellucida, helt enucleate spindler og kromosomer med en minimal mængde af cytoplasma (figur 2 c).
Bemærk: Under denne proces, oocyter stræbe imod stramt tillægger parabol bunden eller afpipetteres på grund af medium uden BSA14. Inden for 10 min, enucleation processen skal være afsluttet, og de kerneløse oocytter skal returneres til rugemaskine. Et passende antal oocytter, der kan manipuleres i et enucleation er mellem 10 og 20. For større partier af oocytter gentages enucleation proceduren. - Bekræfte fravær af kromosomer i cytoplasma under synligt lys (figur 2 c, midten), så vask de kerneløse oocytter grundigt i mKSOM medium som indeholder 0.3% dBSA mangler CB. Introducere skålen til inkubator ved 37 ° C under 5% CO2 indtil cellefusion.
Bemærk: Efter enucleation, cytoplasma fjernet fra ooplasm indeholder spindler og kromosomer.
6. fusion af en Donor celle og en kerneløse oocyt
-
Forberedelse af HVJ-E
- Tilføje 260 µL af iskold HVJ-E suspension løsning til frysetørret HVJ-E (fra kit, se Tabel af materialer) og pipetteres op og ned indtil fuldt suspenderet.
Bemærk: Den passende mængde af frysetørrede HVJ-E er udarbejdet i en flaske, og 260 µL HVJ-E suspension løsning er inkluderet i sættet. - Forberede 5 µL delprøver af HVJ-E løsning, og derefter opbevares ved-80 ° C indtil cellefusion.
Forsigtig: Omhyggeligt behandle HVJ-E på is, da det er temperatur-følsomme. Efter afslutningen af eksperimentet, passende autoklave HVJ-E materialer og containere til helt inaktivere virus komponenter.
- Tilføje 260 µL af iskold HVJ-E suspension løsning til frysetørret HVJ-E (fra kit, se Tabel af materialer) og pipetteres op og ned indtil fuldt suspenderet.
-
Cellefusion
- Fortynd den 5 µL af HVJ-E løsning med 20 µL af celle fusion buffer umiddelbart før brug. Sted den fortyndede HVJ-E løsning på køl indtil brug.
Bemærk: Celle fusion buffer er inkluderet i HVJ-E kit. - Forberede celle fusion kammer, som vist i figur 3A. Overføre de kerneløse oocytter til HCZB medium på celle fusion kammeret ved hjælp af en pipette (indvendig diameter: 150 µm til 200 µm); sted 4 µL af hver opløsning (HCZB medium der indeholder 6% -BSA donor celler, HVJ-E løsning, HCZB medium, 9% PVP i HCZB medium) og dække kammer med ca. 1 mL af mineralsk olie.
Bemærk: Det passende antal kerneløse oocytter, der er overført til afdeling i manipulation under én celle fusion procedure er fra 5 til 30. For større partier af oocytter gentages celle fusion proceduren. I stedet for kammer, kan en 60-mm petriskål dækning bruges, hvis den er tilgængelig. - Placer de kerneløse oocytter i HCZB medium under et mikroskop på 400 X magnificationat stuetemperatur. Opsug donor celler ved hjælp af micromanipulation pipette (6-7 µm indre diameter fladskærms-ended tip), og udvise celler i HVJ-E suspension løsning.
- Derefter Aspirér cumulus celler én efter én med HVJ-E suspension løsning til at være lige så adskilt fra hinanden, aktivering serial cellefusion. Holde de kerneløse oocytter i HCZB medium ved hjælp af en bedrift pipette. Bore zona pellucida med micromanipulation pipette med piezo puls (intensiteten af 3-6, hastighed i 2-3).
- Efter åbning hullet i zona pellucida, skal du placere en cumulus celle tæt til oocyt membran, sammen med HVJ-E suspension løsning med et bind 5 gange mængden af en cumulus celle, uden at gå gennem oocyt membran.
Bemærk: Forberede cumulus celler 6-7 µm indre diameter fladskærms-ended tips af micromanipulation pipetter. Pipetter skal vaskes jævnligt bruger 9% PVP medium for at opretholde glat celle frigivelse. Trin 6.2.3 - 6.2.5 skal være færdig inden for 10 min, eller effektiviteten af cellefusion vil være lavere. Membran fusion aktivitet af HVJ-E er inaktiveret ved autoklavering, behandling med vaskemiddel, eller 70% ethanol. Efter forsøget, skal opløsningen HVJ-E bortskaffes korrekt i. - Efter manipulation af cellefusion, omgående overføre oocytter til mKSOM medium indeholdende 0,3% dBSA, og flytte til en inkubator ved 37 ° C under 5% CO2 for 1 h.
- Fortynd den 5 µL af HVJ-E løsning med 20 µL af celle fusion buffer umiddelbart før brug. Sted den fortyndede HVJ-E løsning på køl indtil brug.
7. aktivering af rekonstrueret oocytter og behandling med Trichostatin A og C-Vitamin
-
Forberedelse af TSA
- Dispensere 5 mM TSA løsning i 3 µL delprøver, og gemme løsningen ved-20 ° C.
- Tilføje 2,5 µL af 5 mM TSA stamopløsning til 1 mL af DMSO (en koncentration af 12,5 µM).
- Fortynd 8 µL af 12,5 µM TSA stamopløsning i 2 mL af aktivering medium og mKSOM medium (en slutkoncentration på 50 nM).
-
Forberedelse af VC
- Tilføj 1 mg af VC i 1 mL sterilt endotoxin-gratis vand, og opbevares ved-20 ° C.
- Tilføje VC stamopløsningen til mKSOM medium (en slutkoncentration på 10 µg/mL).
-
Aktivering af de rekonstruerede oocyter
- En time efter cellefusion, tjekke den for tidlig kromosom kondens (PCC) i de rekonstruerede oocyter (figur 3B) ved hjælp af et mikroskop (400 X).
- Overføre de rekonstrueret oocytter til aktivering medium (Se trin 1.3) indeholdende TSA, og Inkuber i 6 timer ved 37 ° C under 5% CO2 i luft (figur 3 c). Observere dannelsen af pro-kerner i SCNT embryoner, derefter anvende 2 timer af TSA behandling i mKSOM medium som indeholder 0.3% dBSA (figur 2 c).
- Overføre de TSA-behandlede embryoner til mKSOM medium suppleret med VC og Inkuber i 7 h, som vist i figur 3D.
- Efter 7 h af VC behandling, overføre VC-behandlede embryoner til mKSOM medium indeholdende 0,3% dBSA, og der inkuberes i 4 dage ved 37 ° C under 5% CO2 i luften.
Bemærk: For at producere klonede mus, Overfør morfologisk normale 2-celle stadium embryoner til æggelederne af pseudo gravid hunmus (MCH(ICR)) på dagen når en vaginal plug er fundet (dag 0,5 i pseudopregnancy)15. Efter 19,5 dage registreres antallet af implantation websteder og nyfødte efter kejsersnit.
Representative Results
For at producere klonede mus embryoner, blev cumulus celler og føtal fibroblastceller brugt. Antallet af rekonstrueret oocytter og udvikling til de 2-celle stadium efter oocyt aktivering er vist i tabel 1. En meget høj pronuclear dannelse (89 til 100%) og udvikling til de 2-celle stadium (77-89%) blev observeret under alle forhold. Nogle af klonede embryoner, som var afledt af cumulus celler og udviklet til de 2-celle stadium, blev overført til æggelederne af pseudo drægtige hundyr. Seks klonet afkom ud af 72 overførte embryoner blev produceret fra tre drægtige hundyr af serielle behandling af TSA og VC (figur 4). Omkring 15% af klonede embryoner er blevet rapporteret til at udvikle sigt ved at følge denne SCNT procedurer12. Derudover har overførsel af klonede 2-celle embryoner på andre institutioner opnået 9-15% levende afkom, som repræsenterer bedre udvikling end enkelt TSA behandling på klonede embryoner. Desuden, behandling med TSA og VC væsentligt forbedret effektiviteten af in vitro- embryonale udvikling til blastocyststadiet (tabel 2, P < 0,05, Student's t-test). Disse in vitro- udviklingsmæssige data viser, at den positive effekt af TSA og VC er begrænsede, hverken af musen stammer eller celletyper. Disse resultater tyder på, at denne SCNT metode fremmer udviklingsmæssige evne af de klonede embryoner.
Figur 1: Forberedelse af dBSA.
Trinvise procedurer til klargøring af dBSA løsning er afbildet. Omfanget af ionbytning kan bedømmes af farveændring af perlerne. Den øverste venstre figur viser at 1,2 g af BSA opløses i 10 mL sterilt vand ved stuetemperatur. Efter BSA er opløst, er ion-udveksling resin perler tilføjet (øverst til højre). Når blandingen af BSA løsning med ion-udveksling resin perler ændrer farve fra blå-grøn til guld (nederst til højre), erstatte perlerne med friske. Figuren nederst til venstre viser, at farven på perler forbliver blå-grøn, og ionbytning er færdig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Enucleation procedurer.
(A) en illustration af enucleation afdeling. Enucleation af oocytter er udført i HCZB medium med CB. For ordningen piezo drivende bruges en plet af 9% PVP medium til at forberede enucleation glas pipette. Steder er omfattet af mineralsk olie. (B) en diagram og en Mikrograf viser placeringen af spindler og kromosomerne før enucleation. Sort pilespidser: spindler og kromosomer. Rød pilespidser: første polar kroppen. (C) en diagram og en Mikrograf vise vellykket enucleation. Sort pilespidser: spindler og kromosomer. Rød pilespids: første polar kroppen. Blå pilespids: hul i zona pellucida. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Celle fusion procedurer og kultur tilstand af SCNT embryoner.
(A) en illustration af celle fusion kammer. Cellefusion er udført i HCZB medium som indeholder 6% dBSA. En plet af 9% PVP medium bruges til at forberede cellefusion glas pipette. Steder er omfattet af mineralsk olie. (B) en diagram og en Mikrograf af for tidlig kromosom kondens dannes en time efter cellefusion (sort pilespids). (C) en diagram en Mikrograf af pronuclear struktur og dannede seks timer efter aktivering (sort pilespidser). (D) ordningens den TSA, VC og dBSA behandling af SCNT embryoner. Grøn pil repræsenterer behandling med TSA, efterfulgt af inkubation med VC (gul pil) under mKSOM medium indeholdende med 0,3% dBSA (blå pil). Pilespidser angive tidspunktet for skiftende medium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Klonet afkom stammer fra cumulus celler lige efter kejsersnit efter 19,5 dage af graviditeten.
Der er efterbyrd på den øverste række. Klonet afkom, der vises her blev genereret i en overførsel af cellekerner eksperimentere fra tre foster mødre. Moderkagen størrelse var 1,5 til 2 gange større end størrelsen på dem produceret ved in vitro- befrugtning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gruppe | Donor celletype | Musen stamme | Lol af oocytter bruges | Lol af oocytter smeltet | Lol af oocytter viser tidlig kromosom kondens | Lol af oocytter viser pronuclei dannelse (%) | Lol af pronuclei-dannet oocytter, der er udviklet til 2-celle embryoner (%) |
|
| TSA, VC | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 81 (99) | 72 (89) | |
| ubehandlet | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 82 (100) | 68 (83) | |
| TSA, VC | føtal fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 202 | 171 | 169 | 151 (89) | 124 (82) | |
| ubehandlet | føtal fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 201 | 171 | 147 | 142 (97) | 109 (77) | |
Tabel 1: effekter af TSA og VC behandling på den in vitro- udvikling af klonede mus embryoner til de 2-celle stadium.
| Gruppe | Donor celletype | Musen stamme | Lol 2-celle embryoner bruges | Lol 2-celle embryoner udviklet for enkelte livsstadier (%) | |||
| 4-celle | Morula | blastocyst | |||||
| TSA, VC | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 152 | 152 (100) | 149 (98) | 135 (89) en | |
| ubehandlet | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 83 | 47 (57) | 41 (49) | 32 (39) b | |
| TSA, VC | føtal fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 124 | 110 (89) | 101 (81) | 88 (71) c | |
| ubehandlet | føtal fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 109 | 54 (50) | 45 (41) | 29 (27) d | |
| a-b, c-d Forskellige hævet i samme donor cellerne repræsenterer betydelige forskelle (P < 0,05) | |||||||
Tabel 2: effekter af TSA og VC behandling på den in vitro- udvikling af klonede mus embryoner på blastocyststadiet.
Discussion
Afslutningsvis, tyder disse resultater på, at metoden præsenteres SCNT kunne reducere tekniske vanskeligheder, og øge effektiviteten af SCNT uden at kræve genetiske modifikationer og mRNA tilskud (tabel 1, tabel 2) og sikre stabil produktion af klonede embryoner. Denne metode gør det muligt at rekonstruere mere SCNT embryoner end konventionelle metoder på grund af bedre overlevelsesrate og forenklet protokol. I denne protokol er et kritisk skridt cellefusion. For at kunne producere klonede mus, er det afgørende at sikre, at det korrekte antal HVJ-E beskrevet i protokollen opretholdes under celle sammensmeltning proces og oocyter skal returneres til rugemaskine indenfor 10 min i skridt 6.2.3 - 6.2.5. Da 20 til 30 donor celler kan være indsugning sammen med HVJ-E ad gangen i manipulation pipette, er antallet af oocytter fremstillet ved en operation større end den eksisterende metode. I sidste ende kan vi producerer omkring 20 til 30 re konstrueret oocyter inden for 10 min. Selv når arbejder med et stort parti af oocyter (100 eller flere), celle fusion procedure bør tage en time eller mindre ved at gentage trin 6.2.3 - 6.2.5. Den metode og de teknikker præsenteret her kan fungere som effektive protokoller med forenklede tekniske krav.
På nuværende tidspunkt er de molekylære mekanismer bag udviklingen af SCNT embryoner stadig uklare. Denne forbedrede SCNT metode bidrager også til at studere sådanne omprogrammering mekanismer, da denne metode kan producere mange klonede embryoner i kun et eksperiment. Denne metode bruger somatiske celler med intakte cellemembraner for cellefusion. Således kan det være muligt at anvende denne fremgangsmåde til andre celler, såsom halespids celler16, sertoli celler17og embryonale stamceller (ES) celler18. Når konventionelle SCNT metoder bruges til indsprøjtning relativt store celler, såsom Hale spids celler, direkte ind i cytoplasmaet oocyt bliver det endnu mere teknisk krævende at få levende embryoner. Derudover er relativt hårdt celler, såsom sertoli celler, vanskeligt at bryde af pipettering til indsprøjtning. Når disse forskellige celletyper betragtes, er metoden celle fusion udnytte HVJ-E enkel og effektiv. Selv om den værdi og sikkerheden af HVJ-E har været overbevisende dokumenteret19,20, kan det være vigtigt at genoverveje muligheden for at bruge HVJ-E til fremstilling af klonede dyr til landbrugs- eller biomedicinske formål.
Desuden produceret for nylig en gruppe med succes klonede mus afledt af urin celler21. For at redde truede pattedyr arter, vil fremover SCNT ved hjælp af de celler, der opsamlet i en ikke-invasiv måde, som cellen urin være ideel. For nylig, en anden gruppe har direkte genereret klonede mus ved hjælp af antigen-specifikke CD4+ T celler22. Det ville være interessant at undersøge, om denne metode er også gældende for effektivt klon mus fra sådanne celler. Derudover er Latrunculin A blevet rapporteret som et bedre alternativ til at hæmme actin polymerisering under enucleation og parthenogenetic aktivering af SCNT oocyter23. Fremtidige undersøgelse kan afsløre, om Latrunculin A behandling, i stedet for cytochalasin B, yderligere forbedrer generation af klonet afkom. Derudover har TSA behandling held været anvendt i mus, svin24og kaniner25 ved at ændre indvirkningstid, periode og koncentration. Derudover VC ikke kun forbedrer fosterudviklingen i svin SCNT10, men også forbedrer iPS celle produktion i mennesker og mus26. Derfor er det plausibelt at spekulere at TSA og VC behandling kan også anvendes til andre pattedyr, og vi kan være nødvendigt at optimere tid, behandling af TSA og VC for hver art.
Til sidst, gør denne metode det muligt at generere klonede mus med en praktisk niveau af effektivitet med enkle procedurer. Derfor, resultaterne af denne undersøgelse kunne føre os til at anvende SCNT-teknologi for at bevare de genetiske ressourcer af sjældne dyr, og for at forstå de molekylære mekanismer af nukleare omprogrammering og tidlige embryonale udvikling.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI grant numre JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 til K.M. Sumitomo Foundation Grant for grundlæggende videnskab forskningsprojekter (150810 til K.M.). Kindai Universitet forskning tilskud (15-I-2 til K.M. og M.A.). M.O. anerkender den core støtte fra Cancer Research UK (C6946/A24843) og the Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Vi takker Ms. N. Backes-Kamimura og Mr. J. Horvat for korrekturlæsning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
References
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Kishigami, S., et al. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).
- Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).
- Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).
- Matoba, S., et al. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell. 159 (4), 884-895 (2014).
- Kishigami, S., et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).
- Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).
- Bui, H. T., et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).
- Chen, J., et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet. 45, 34-42 (2013).
- Huang, Y., et al. Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos. Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).
- Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos. J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules. Biol Open. 6, 415-424 (2017).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).
- Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. Manipulating the mouse embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).
- Ogura, A., et al. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells. Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).
- Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).
- Tachibana, M., et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).
- Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 1-8 (2016).
- Kaminuma, O., et al. Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells. EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).
- Terashita, Y., et al. Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization. Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).
- Zhao, J., et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).
- Shi, L. H., et al. Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).
- Esteban, M. A., et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).
