Summary
يصف لنا طريقة تحسنت بشكل كبير للاستنساخ الماوس باستخدام تريتشوستاتين أ، وفيتامين ج، والبومين المصل البقري منزوع. علينا إظهار بروتوكول مبسط وقابل لإعادة الإنتاج الذي يدعم تطوير كفاءة الأجنة المستنسخة. ومن ثم، يمكن أن يصبح هذا الأسلوب إجراء موحد لاستنساخ الماوس.
Abstract
نقل نواة الخلية الجسدية (سكنت) يوفر فرصة فريدة من نوعها لإنتاج مباشرة من الحيوانات مستنسخة من خلية مانحة، ويتطلب استخدام تقنيات ماهراً. بالإضافة إلى ذلك، ظلت كفاءات الاستنساخ منخفضة منذ النجاح في إنتاج الحيوانات المستنسخة، ولا سيما الفئران. كانت هناك محاولات عديدة لتحسين كفاءة الاستنساخ، وتريتشوستاتين A (TSA)، مثبط deacetylase هيستون، قد استخدمت على نطاق واسع لتعزيز كفاءة الاستنساخ. هنا، نحن تقرير أسلوب استنساخ تحسنت بشكل كبير في الفئران. ويشمل هذا الأسلوب نقل نواة الخلية الجسدية استخدام فيروس هيماجلوتيناتينج من "اليابان المغلف" (هفج-E)، التي تمكن من السهل التلاعب. وعلاوة على ذلك، العلاج باستخدام اثنين من الجزيئات الصغيرة، حساب السياحة الفرعي وفيتامين ج (VC)، مع ألبومين المصل البقري منزوع (مصرف)، فعالة للغاية للتنمية الجنينية. هذا النهج يتطلب حقن إضافية ولا التلاعب بالجينات، وهكذا يقدم طريقة بسيطة وملائمة للاستخدام العملي. يمكن أن يصبح هذا الأسلوب نهجاً ممكناً من الناحية الفنية للباحثين لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا من الخلايا المستزرعة. وعلاوة على ذلك، قد يكون وسيلة مفيدة لإنقاذ الحيوانات المهددة بالانقراض عن طريق الاستنساخ.
Introduction
تمكن تقنية سكنت إنتاج الحيوانات المستنسخة باستخدام واحد فقط من الخلية الجسمية أو نواة لنقلها إلى البويضيه enucleated. واحد لأغراض تقنية سكنت هو الاشتقاق خطوط الخلايا الجذعية الجنينية (NT-بتوليدا) النقل النووي من أجنة مستنسخة. وفي عام 1998، واكاياما et al.، والإبلاغ عن إنتاج الفأرة مستنسخة بنجاح المسمى كومولينا ل المرة الأولى1. ومنذ ذلك الحين، استنساخ الفئران قد تم دراستها على نطاق واسع، وتم الحصول على العديد من معلومات هامة بشأن إعادة برمجة النووي لنواة جسدية. من ناحية أخرى، هذا الأسلوب هو مصحوبة بالعديد من الخطوات ميكرومانيبوليشن التي يصعب جداً للأصول الرأسمالية، التي تتطلب تدريبا مكثفا لأكثر من 3 أشهر2.
إنتاج الفئران المستنسخة باستخدام سكنت تطورت من الأصلي هونولولو الأسلوب1، أسلوب الصهر الكهربائي3، إلى أسلوب الانصهار الخلية بالفيروس هيماجلوتيناتينج من اليابان (هفج)4. ومع ذلك، يميل الحقن المباشر لنواة الخلية عن طريق سيتوميمبراني ضاراً تؤثر على بقاء البويضات. الصهر الكهربائي منخفض في الكفاءة، ونظرا لكل غشاء الخلية صلابة مختلفة، مما يجعل من الصعب تحديد شرط أمثل. التعامل مع هفج شاقة لأنها تتطلب معدات خاصة لسلامة الباحثين والحيوانات المختبرية. فتيل السيتوبلازم الخلية والبويضات المانحين، هفج ه في الآونة الأخيرة تستخدم5. هفج ه فقط لديه القدرة على صهر الأغشية دون قدرة الفيروسات التكاثري أو المعدية. الكشف هفج الجينوم معطلة تماما في هفج-هاء. وهكذا يدعم استخدام هفج ه سهولة التعامل من الانصهار الخلية أثناء سكنت.
وقد أظهرت عدة تقارير أن معاملة الأجنة سكنت مع حساب السياحة الفرعي، مثبط deacetylase هيستون، تحسن كبير في كفاءة الإنتاج الجراء حية من أقل من 1% إلى 6.5%6،7. حساب السياحة الفرعي العلاج يسرع إعادة برمجة عن طريق تعديل علامات هستون في الأجنة سكنت8. في الآونة الأخيرة، حقن خاصة مرناس، الفصيلية ديميثيلاسي يسين هيستون 4 (KDM4)، التي تقوم بإزالة هيستون H3 ليزين 9 (H3K9) تريميثيليشن في الأجنة سكنت، لا سيما في مناطق ريبروجرامينج-مقاومة، لقد ثبت لزيادة تطوير المستنسخة ماوس الأجنة9. ومن ناحية أخرى، انخفض الاستثمار الرأسمالي، الذي يعمل أيضا كمعدل هستون، تريميثيليشن H3K910. وعلاوة على ذلك، يعزز الاستثمار الرأسمالي التطور الجنيني في الخنزير سكنت10. وأفيد أن حقن مصرف في الأجنة سكنت يؤدي إلى تحسين التنمية الجنينية11.
لقد وجدنا سابقا أن مجموعة الجزيئات الصغيرة، إلا وهي السياحة والاستثمار الرأسمالي، جنبا إلى جنب مع مصرف، جذريا تعزيز التنمية سكنت الأجنة12. هنا، نحن بالتفصيل طريقة سكنت سبق الإبلاغ عنها للفئران، التي تمثل إجراءات الاستنساخ كفاءة عالية وبسيطة12. ونحن أيضا وصف معالجة هفج-هاء وهذه يمكن أن تساعد العديد من الباحثين في مجال البيولوجيا الإنجابية والتنموي المحافظة على الموارد الوراثية أو إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا من خلال هذا الأسلوب سكنت.
Protocol
جميع الإجراءات الحيوان تتفق مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة كندي لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. إعداد وسائل الإعلام الثقافة
- تعد المتوسطة كسوم (مكسوم) المعدلة للثقافة الجنين، تتكون من 95 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 0.35 مم خ2ص4، 0.2 مم MgSO4 · 7 ح2س، مم 1.71 كاكل2 · 2 ح2س، 0.2 مم د (+)-الجلوكوز، 0.2 مم بيروفات صوديوم، 1.0 مم ل الجلوتامين، 1.0 غرام/لتر بوفيدون (حماية الأصناف النباتية)، مم 25.07 NaHCO3، 10 مم DL-لاكتات الصوديوم، 0.05 غرام/لتر البنسلين و 0.05 غرام/لتر ستربتوميسين في الماء المعقم.
- تعد المتوسطة مخزنة حبيس كزب (هكزب) للتلاعب بالجنين، تتكون من مم 81.5 كلوريد الصوديوم، 4.8 مم بوكل، 1.7 مم كاكل2 · 2 ح2س، 1.18 مم MgSO4 · 7 ح2س، 1.18 مم خ2ص4، 0.11 مم يدتا · 2Na، مم 36.1 الصوديوم DL-لاكتات، مم 5.55 د (+)-الجلوكوز و 0.025 غ/مل البنسلين، 0.035 غرام/لتر ستربتوميسين، 0.014 ملم الفينول الحمراء، 1.0 غرام/لتر البولي فينيل الكحول، 5.0 ملم ناكو3و 20.0 ملم حبيس ملح الصوديوم في الماء المعقم.
- تعد وسيلة تفعيل لتنشيط البويضات: مكسوم المتوسطة وتستكمل مع 50 نانومتر حساب السياحة الفرعي، 2 مم عطا، 5 ميكروغرام/مل سيتوتشالاسين ب (CB)، و 5 مم سركل2.
2-الإعداد "منزوع البقري ألبومين المصل" (مصرف)
- حل ز 1.2 من ألبومين المصل البقري (BSA) في 10 مل الماء المعقم في درجة حرارة الغرفة (تركيز نهائية من 12 في المائة).
- إضافة حوالي 0.12 ز حبات راتنج التبادل الأيوني مختلطة لما ورد أعلاه أعد 12% من جيش صرب البوسنة في الماء المعقم في درجة حرارة الغرفة مع التحريك لطيف.
- عندما الخرز بتغيير اللون من الأخضر والأزرق للذهب، واسترداد الحل طافية باستخدام ماصة. قم باستبدال الخرز الطازجة منها (الشكل 1).
ملاحظة: يتم عادة إجراء استبدال الخرز مرة واحدة فقط. ربما يتطلب بدائل قليلة لإكمال ديونيزيشن. فقط كدليل، إذا لم يتغير لون الخرز من الأخضر والأزرق للذهب، وهو يشير إلى اكتمال هذا التبادل الأيوني. - استرداد الحل بعد التأكد من أنه لم يحدث أي تغيير اللون في الخرز.
ملاحظة: إذا كان الحل المستردة يصبح غائم، الطرد المركزي لمنع انسداد عامل التصفية (175 س ز، 5 دقيقة). - الملحق المستردة الحل مع 250 ميليلتر ناكو 10.5%3.
ملاحظة: هو القصد من هذه العملية لحل مصرف لتحييد الشرط الأس الهيدروجيني. ومع ذلك، يمكن أن تكون ناكو3 يمكن الاستغناء عنها. - تعقيم المادة طافية باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر، وتخزينها في-20 درجة مئوية كحل مصرف الأسهم.
3. جمع البويضات
ملاحظة: أبقى جميع الفئران في غرف مكيفة وتسيطر عليها الضوء.
- سوبر أوفولاتي كل الماوس B6D2F1 الإناث (الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع) عن طريق الحقن داخل وحدة دولية 7.5 من تروج مصل الفرس الحامل (PMSG) ووحدة دولية 7.5 من الإنسان المشيمية تروج (قوات حرس السواحل الهايتية) 48 ساعة بعد الحقن بمسج.
- تنفيذ القتل الرحيم بخلع عنق الرحم ح 14-16 بعد قوات حرس السواحل الهايتية الحقن. جداً في البطن الوصول إلى المسالك التناسلية باستخدام التقنيات القياسية تشريح13. بإيجاز، قرصه الجلد وجعل شق جانبية صغيرة في خط الوسط مع المقص. عقد الجلد بثبات أعلى وأسفل الشق وسحب الجلد نحو الرأس والذيل. قطع الصفاق استخدام مقص ودفع الملفات من القناة الهضمية من الطريق وتأكيد وجود قرنان من أوفيدوكتس الرحم والمبايض.
- استئصال أوفيدوكتس مع مقص مستقيمة صغيرة وملاقط، ومكان على ورقة لتصفية مسح الدم الخروج من السطح. تعيين أوفيدوكتس في الزيوت المعدنية. ثم تقطيع ampulla قناة استخدام الإبر التشريح، ونقل مجمعات البويضيه الركام قادمة من أمبالا لقناة إلى 200 ميليلتر قطرات من المتوسطة هكزب مع البروتين السكري المثبط 0.1%. احتضان لمدة 5 دقائق على لوحة الاحترار.
تحذير: تعرض لفترة أطول من 10 دقائق في المتوسط هكزب مع البروتين السكري المثبط 0.1% سيكون ضاراً لبويضات. - وتؤكد أن خلايا الركام تم إصدارها من مجمعات البويضيه الركام تحت ستيريوميكروسكوبي، نقل الثانية بويضات المرحلة هو الطورية (MII) مع بعض الخلايا الركام المتبقية إلى مصرف 0.3% تحتوي على المتوسط مكسوم. ثم، يغسل بويضات المرحلة الوزارة أربع مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً (باستخدام ماصة من < 100 ميكرومتر القطر الداخلي) في المتوسط مكسوم المحتوية على مصرف 0.3% لفصل الخلايا الركام المتبقية.
ملاحظة: استخدام ماصة صغيرة يسهل المفرزة من الخلايا الركام. - احتضان Mll المرحلة بويضات في المتوسط مكسوم المحتوية على مصرف 0.3% عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 حاضنة حتى انوكلياتيون.
ملاحظة: ينصح ماصة صغيرة يبلغ قطرها أكبر قليلاً من البويضات.
4-إعداد الخلايا المانحة للنقل النووي
- بعد خطوات 3.3-3.5، معزولون بويضات المعراة من مجمعات البويضيه الركام. نقل كمية صغيرة (حوالي 2 ميليلتر) من الخلايا الركام المتبقية موزعة من مجمعات البويضيه الركام في المتوسط هكزب مع البروتين السكري المثبط 0.1% إلى المتوسطة هكزب مع مصرف 6% باستخدام ماصة تحت ستيريوميكروسكوبي.
- مكان الخلايا الركام في المتوسطة هكزب مع مصرف 6% على لوحة الاحترار في 37 درجة مئوية إلى حين الحاجة إليها سكنت.
ملاحظة: عند الخلايا تنتجها الخلايا الليفية (مثلاً.، خلايا مورين تنتجها الخلايا الليفية الجنينية) هي المستخدمة كخلايا المانحين، فصل الخلايا من طبق استنبات الأنسجة والطرد المركزي لهم في بيليه. ريسوسبيند بيليه الخلايا في المتوسط هكزب التي تحتوي على 6% مصرف.
5-انوكلييشن بويضات
- إعداد متوسطة 9% حماية الأصناف النباتية عن طريق إضافة ز 0.9 حماية الأصناف النباتية إلى 10 مل هكزب المتوسطة، الاحتفاظ في الثلاجة بين عشية وضحاها (4 درجة مئوية)، ومن ثم تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر.
- إعداد حلول الأسهم CB (تركيز 1 ملغ/مل) بإضافة 5 ملغ CB إلى 5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). تمييع الحل CB الأسهم مع هكزب المتوسطة (تركيز نهائي 5 ميكروغرام/مل) واستخدم كحل انوكلييشن.
- غسل بويضات المرحلة Mll في 20 ميليلتر من متوسطة هكزب التي تحتوي على 5 ميكروغرام/مل CB (محلول انوكلييشن) من خلال استنشاق والزفير من خلال ماصة معقمة (داخل القطر: ميكرومتر 150 إلى 200 ميكرون). كرر الإجراء الغسيل خمس مرات. انتظر حوالي 10 دقيقة على لوحة الاحترار في حل انوكلييشن قبل البدء في عملية انوكلييشن.
- إعداد قاعة انوكلييشن كما هو مبين في الشكل 2 ألف. نقل بويضات Mll إلى الدائرة انوكلييشن باستنشاق والزفير باستخدام ماصة (داخل القطر: ميكرومتر 150 إلى 200 ميكرومتر)؛ ضع 4 ميليلتر لحل انوكلييشن وتغطية الدائرة مع الزيوت المعدنية.
ملاحظة: بدلاً من دائرة، يمكن استخدام غطاء من 60 مم طبق بيتري. - تحديد مغزل والصبغيات البويضيه مرحلة صناعة المعلومات تحت مجهر (400 X) في درجة حرارة الغرفة. توجيه البويضيه المرحلة Mll مع الجسم القطبي الأول واضح، حتى لا يكون موضع عمود الدوران وكروموسوم 3 أو 09:00 ص موقف (الشكل 2) باستخدام ماصة القابضة وميكروبيبيتي.
ملاحظة: قد المجهر استخدام عدسات التكبير X 400 في المجموع. أيضا، هو العدسة الهدف N.A 5 X/0.12 و 40 ×/0.55. قيادة نبض بيزو الماصة تصاريح الحفر السريع من بيلوسيدا زونا. وبالإضافة إلى ذلك، أيضا نظام ليزر (مثلاً، زيكلون) يمكن استخدامها لحفر بيلوسيدا زونا بدلاً من نظام القيادة بيزو. - تعيين كثافة نبض بيزو إلى 3-6، وحفر بيلوسيدا زونا استخدام ماصة ميكرومانيبوليشن (7-8 ميكرومتر القطر الداخلي المنتهية في شقة نصيحة) مع نبض بيزو القيادة. بعد فتح ثقب في zona pellucida، انوكليتي تماما بمغزل والصبغيات بكمية ضئيلة من السيتوبلازم (الشكل 2).
ملاحظة: أثناء هذه العملية، تميل بويضات إرفاق إلى أسفل طبق محكم أو "الماصة؛" نظراً للمتوسط دون جيش صرب البوسنة14. ضمن 10 دقيقة، يجب إتمام عملية انوكلييشن، وبويضات انوكليتيد بحاجة إلى أن تعاد إلى الحاضنة. العدد المناسب من بويضات يمكن التلاعب في انوكلييشن واحدة من بين 10 و 20. للحصول على دفعات أكبر من بويضات، يتم تكرار الإجراء انوكلييشن. - التأكد من عدم وجود الكروموسومات في السيتوبلازم تحت الضوء المرئي (الشكل 2، الأوسط)، ثم يغسل بويضات انوكليتيد جيدا في المتوسط مكسوم يحتوي على 0.3% مصرف تفتقر إلى بناء القدرات. إدخال الطبق للحضانة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 حتى الانصهار الخلية.
ملاحظة: بعد انوكلياتيون، السيتوبلازم إزالتها من أووبلاسم يحتوي على مغزل والكروموسومات.
6-الانصهار من خلية للمانحين وبويضتها Enucleated
-
إعداد هفج-E
- إضافة 260 ميليلتر لحل تعليق هفج ه المثلج ه هفج المجففة بالتبريد (من الطقم، انظر الجدول للمواد) و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً حتى توقفت تماما.
ملاحظة: يتم إعداد المقدار المناسب من ه هفج المجففة بالتبريد في زجاجة، وهفج ه ميليلتر 260 تعليق الحل هو مضمنة في أدوات. - إعداد 5 ميليلتر مختبرين للحل هفج ه، وثم تخزينها في-80 درجة مئوية حتى الانصهار الخلية.
تنبيه: تعامل بعناية هفج الإلكترونية على الجليد، حيث أنها حساسة لدرجة الحرارة. وبعد الانتهاء من التجربة، وعلى نحو ملائم اﻷوتوكﻻف هفج ه المواد وحاويات تعطيل مكونات الفيروس تماما.
- إضافة 260 ميليلتر لحل تعليق هفج ه المثلج ه هفج المجففة بالتبريد (من الطقم، انظر الجدول للمواد) و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً حتى توقفت تماما.
-
خلية الانصهار
- تمييع ميليلتر 5 حل هفج ه مع 20 ميليلتر خلية الانصهار المخزن المؤقت فورا قبل الاستخدام. وضع الحل هفج ه المخفف على الجليد حتى الاستخدام.
ملاحظة: يتم تضمين خلية الانصهار المخزن المؤقت في الطقم هفج ه. - إعداد قاعة الانصهار خلية كما هو موضح في الشكل 3 ألف. نقل بويضات انوكلياتيد المتوسطة هكزب في الدائرة الانصهار الخلية باستخدام ماصة (داخل القطر: ميكرومتر 150 إلى 200 ميكرومتر)؛ مكان 4 ميليلتر لكل حل (المتوسطة هكزب التي تحتوي على 6%-جيش صرب البوسنة للخلايا المانحة، حل هفج ه، هكزب المتوسطة، 9% حماية الأصناف النباتية في المتوسط هكزب) وتغطي الدائرة مع حوالي 1 مل الزيوت المعدنية.
ملاحظة: العدد المناسب من بويضات انوكليتيد التي يتم نقلها إلى الدائرة للتلاعب أثناء إجراء الانصهار خلية واحدة من 5 إلى 30. للحصول على دفعات أكبر من بويضات، يتم تكرار الإجراء الانصهار الخلية. بدلاً من دائرة، يمكن استخدام غطاء صحن بيتري 60 ملم، إذا كانت متوفرة. - وضع بويضات انوكليتيد في المتوسط هكزب تحت مجهر في درجة حرارة الغرفة X magnificationat 400. نضح الخلايا المانحة باستخدام ماصة ميكرومانيبوليشن (6-7 ميكرومتر القطر الداخلي المنتهية في شقة نصيحة)، وطرد الخلايا في حل تعليق هفج ه.
- ثم نضح خلايا الركام واحداً تلو الآخر مع الحل تعليق هفج ه نفس القدر يمكن فصلها عن بعضها البعض، تمكين الخلية المسلسل الانصهار. تبقى بويضات انوكليتيد في المتوسط هكزب باستخدام ماصة عقد. حفر بيلوسيدا زونا مع ماصة ميكرومانيبوليشن مع نبض بيزو (كثافة سرعة 3-6، 2-3).
- بعد فتح الثقب في بيلوسيدا زونا، مكان خلية الركام محكم للأغشية البويضيه، جنبا إلى جنب مع ه هفج تعليق الحل بحجم 5 مرات حجم خلية الركام، دون المرور عبر غشاء البويضيه.
ملاحظة: إعداد 6-7 ميكرومتر القطر الداخلي المنتهية في شقة نصائح من الماصات ميكرومانيبوليشن للخلايا الركام. يجب غسل الممصات بانتظام باستخدام متوسط 9% حماية الأصناف النباتية للحفاظ على الإفراج عن الخلية السلس. يجب أن يتم الانتهاء من خطوات 6.2.3-6.2.5 داخل 10 دقيقة، أو ستكون أقل الكفاءة من خلية الانصهار. هو إبطال نشاط الانصهار غشاء هفج ه بالتعقيم، المعاملة مع المنظفات، أو الإيثانول 70%. بعد التجربة، يجب التخلص هفج ه الحل الأنسب من. - بعد التلاعب بخلية الانصهار، على الفور نقل بويضات لمصرف 0.3% تحتوي على المتوسط مكسوم، والانتقال إلى حاضنة في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 لح 1.
- تمييع ميليلتر 5 حل هفج ه مع 20 ميليلتر خلية الانصهار المخزن المؤقت فورا قبل الاستخدام. وضع الحل هفج ه المخفف على الجليد حتى الاستخدام.
7-تنشيط بويضات أعيد بناؤها والمعاملة مع Trichostatin A وفيتامين ج
-
إعداد حساب السياحة الفرعي
- الاستغناء عن حل حساب السياحة الفرعي 5 مم إلى 3 ميليلتر مختبرين، وتخزين الحل عند-20 درجة مئوية.
- إضافة ميليلتر 2.5 مم 5 تسا حل الأسهم إلى 1 مل من [دمس] (بتركيز 12.5 ميكرون).
- تمييع ميليلتر 8 من 12.5 ميكرون تسا حل الأسهم في 2 مل التنشيط المتوسطة والمتوسطة مكسوم (تركيز نهائي من 50 نانومتر).
-
إعداد VC
- إضافة 1 مغ من الاستثمار الرأسمالي في 1 مل الماء المعقم خالية من الذيفان، وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إضافة حل المخزون الرأسمالي إلى مكسوم المتوسطة (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل).
-
تنشيط بويضات أعيد بناؤها
- ساعة واحدة بعد خلية الانصهار، تحقق التكثيف كروموسوم سابقا لأوانه (PCC) في بويضات أعيد بناؤها (الشكل 3B) باستخدام مجهر (400 X).
- نقل بويضات أعيد بناؤها إلى المتوسطة التنشيط (راجع الخطوة 1.3) التي تحتوي على حساب السياحة الفرعي، واحتضان ح 6 في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 في الهواء (الشكل 3). الاحتفال بتشكيل نواة للمحترفين في الأجنة سكنت، ثم تطبيق 2 ساعات أكثر من معاملة حساب السياحة الفرعي في مكسوم المتوسطة المحتوية على مصرف 0.3% (الشكل 2).
- نقل الأجنة المعالجة بحساب السياحة الفرعي إلى المتوسطة مكسوم تكملة مع الرأسمالي واحتضانها ح 7، كما هو مبين في الشكل 3D.
- بعد 7 ح معاملة الاستثمار الرأسمالي، نقل الأجنة يعامل الرأسمالي إلى مكسوم المتوسط يحتوي على 0.3% مصرف، واحتضان لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية تحت 5%2 من أول أكسيد الكربون في الهواء.
ملاحظة: لإنتاج الفئران المستنسخة، نقل الأجنة شكلياً عادي 2-خلية المرحلة إلى أوفيدوكتس الفئران الإناث الحوامل الزائفة (MCH(ICR)) في اليوم عندما يتم العثور على المكونات مهبلية (يوم 0.5 بسيودوبريجنانسي)15. وبعد أيام 19.5، تسجل عدد المواقع غرس وحديثي الولادة بعد العملية القيصرية.
Representative Results
واستخدمت لإنتاج أجنة مستنسخة من الماوس، خلايا الركام والخلايا الجنينية تنتجها الخلايا الليفية. وترد في الجدول 1عدد بويضات أعيد بناؤها والتنمية إلى مرحلة 2-خلية بعد تنشيط البويضات. ولوحظت نسبة عالية جداً من تشكيل برونوكليار (89 إلى 100 ٪) والتنمية إلى مرحلة 2-خلية (77 إلى 89 في المائة) تحت كل الظروف. بعض الأجنة المستنسخة، المستمدة من الخلايا الركام والبلدان المتقدمة النمو إلى مرحلة 2-الخلية، نقلوا إلى أوفيدوكتس إناث الحوامل الزائفة. أنتجت ذرية المستنسخة الستة من أصل 72 نقل الأجنة من الإناث الحوامل الثلاثة بمعالجة المسلسل للسياحة والاستثمار الرأسمالي (الشكل 4). أبلغ حوالي 15% أجنة المستنسخة لتطوير للمصطلح باتباع هذه الإجراءات سكنت12. وبالإضافة إلى ذلك، حققت نقل الأجنة المستنسخة 2-خلية في مؤسسات أخرى ذرية يعيش 9 إلى 15 في المائة، الذي يمثل تطورا أفضل من معاملة حساب السياحة الفرعي واحد على الأجنة المستنسخة. وعلاوة على ذلك، المعاملة مع حساب السياحة الفرعي والرأسمالي تحسن كبير في الكفاءة في المختبر التطور الجنيني لمرحلة الكيسة (الجدول 2، ف < 0.05، اختبار t للطالب). هذه في المختبر التنموية البيانات تبين أن التأثير الإيجابي للسياحة والاستثمار الرأسمالي محدودة بسلالات الماوس ولا بأنواع الخلايا. هذه النتائج تشير إلى أن هذا الأسلوب سكنت يسهل القدرة الإنمائية للأجنة المستنسخة.
الشكل 1: إعداد مصرف.
وصفت إجراءات خطوة بخطوة لإعداد حل مصرف. يمكن الحكم على مدى التبادل الأيوني بتغير لون الخرز. يظهر الشكل الأيسر العلوي أن ز 1.2 من جيش صرب البوسنة يحل في 10 مل الماء المعقم في درجة حرارة الغرفة. بعد حل جيش صرب البوسنة، تتم إضافة الخرز راتنج التبادل الأيوني (أعلى اليمين). عندما خليط حل جيش صرب البوسنة مع حبات راتنج التبادل الأيوني بتغيير اللون من الأخضر والأزرق للذهب (أسفل اليمين)، واستبدال الخرز مع المنتجات الطازجة. ويوضح الشكل أسفل اليسار أن يبقى لون الخرز الأزرق والأخضر، والانتهاء من التبادل الأيوني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الإجراءات انوكلياتيون.
(أ) مثال على الدائرة انوكلياتيون. يتم انوكلييشن بويضات في المتوسط هكزب مع بناء القدرات. لنظام القيادة بيزو، يستخدم بقعة من 9% حماية الأصناف النباتية المتوسطة لإعداد ماصة زجاجية انوكلييشن. تغطيها بقع الزيت المعدني. (ب) الرسم التخطيطي وصورة مجهرية إظهار موضع مغزل والكروموسومات قبل انوكلييشن. أسود رؤوس الأسهم: مغزل والكروموسومات. رؤوس الأسهم الحمراء: الجسم القطبي الأول. (ج) رسم تخطيطي وصورة مجهرية لإظهار انوكلييشن ناجحة. أسود رؤوس الأسهم: مغزل والكروموسومات. السهم الأحمر: الجسم القطبي الأول. السهم الأزرق: الثقب في zona pellucida. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: خلية الانصهار الإجراءات والثقافة حالة الأجنة سكنت.
(أ) مثال على دائرة الانصهار الخلية. خلية الانصهار يتم في المتوسط هكزب التي تحتوي على مصرف 6%. بقعة متوسط 9% حماية الأصناف النباتية يستخدم لإعداد ماصة زجاجية لخلية الانصهار. تغطيها بقع الزيت المعدني. (ب) الرسم التخطيطي وصورة مجهرية من التكثيف كروموسوم سابق لأوانه شكلت ساعة واحدة بعد خلية الانصهار (السهم الأسود). (ج) رسم تخطيطي وصورة مجهرية لهيكل pronuclear شكلت ست ساعات بعد التنشيط (رؤوس سوداء). (د) خطة لعلاج الأجنة سكنت السياحة، والاستثمار الرأسمالي، ومصرف. ويمثل السهم الأخضر في المعاملة مع حساب السياحة الفرعي، تليها الحضانة مع الرأسمالي (السهم الأصفر) تحت المتوسطة مكسوم المتضمن مع مصرف 0.3% (السهم الأزرق). رؤساء الأسهم تشير إلى التوقيت لتغيير المتوسطة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: ذرية المستنسخة المستمدة من الخلايا الركام فقط بعد عملية قيصرية بعد أيام 19.5 من الحمل.
وهناك مترافق في الصف العلوي. ذرية المستنسخة هو موضح هنا تم إنشاؤها في أحد التجربة النووية نقل من الأمهات الحاضنة الثلاثة. وكان حجم المشيمة 1.5 إلى 2 مرات أكبر من حجم تلك التي تنتجها الإخصاب في الأنابيب . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المجموعة | نوع الخلية المانحة | ضغط الماوس | لا. من بويضات المستخدمة | لا. من بويضات تنصهر | لا. من بويضات عرض التكثيف كروموسوم سابق لأوانه | لا. من بويضات عرض تشكيل برونوكلي (%) | لا. من بويضات شكلت pronuclei أن البلدان المتقدمة النمو إلى 2-خلايا الأجنة (%) |
|
| حساب السياحة الفرعي، VC | الركام | × C57BL/6 ديسيبل/2 | 84 | 82 | 82 | 81 (99) | 72 (89) | |
| غير المعالجة | الركام | × C57BL/6 ديسيبل/2 | 84 | 82 | 82 | 82 (100) | 68 (83) | |
| حساب السياحة الفرعي، VC | الجنين تنتجها الخلايا الليفية | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 202 | 171 | 169 | 151 (89) | 124 (82) | |
| غير المعالجة | الجنين تنتجها الخلايا الليفية | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 201 | 171 | 147 | 142 (97) | 109 (77) | |
الجدول 1: آثار المعاملة السياحة والاستثمار الرأسمالي في في المختبر تنمية الأجنة المستنسخة الماوس إلى مرحلة 2-خلية-
| المجموعة | نوع الخلية المانحة | ضغط الماوس | لا. 2-خلايا الأجنة المستخدمة | لا. 2-خلايا الأجنة المتقدمة لكل المراحل (%) | |||
| 4-الخلية | morula | الكيسة | |||||
| حساب السياحة الفرعي، VC | الركام | × C57BL/6 ديسيبل/2 | 152 | 152 (100) | 149 (98) | 135 (89) | |
| غير المعالجة | الركام | × C57BL/6 ديسيبل/2 | 83 | 47 (57) | 41 (49) | 32 (39) ب | |
| حساب السياحة الفرعي، VC | الجنين تنتجها الخلايا الليفية | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 124 | 110 (89) | 101 (81) | 88 (71) ج | |
| غير المعالجة | الجنين تنتجها الخلايا الليفية | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 109 | 54 (50) | 45 (41) | 29 (27) د | |
| أ-ب، ج-د مرتفع مختلفة داخل نفس الخلايا المانحة تمثل اختلافات كبيرة (ف < 0.05) | |||||||
الجدول 2: آثار المعاملة السياحة والاستثمار الرأسمالي في في المختبر تنمية الأجنة المستنسخة الماوس إلى مرحلة الكيسة.
Discussion
وفي الختام، هذه النتائج تشير إلى أن الطريقة التي سكنت قدم يمكن تقليل الصعوبات التقنية، وزيادة كفاءة سكنت دون الحاجة إلى التعديلات الوراثية ومكملات مرناً (الجدول 1و الجدول 2)، وضمان استقرار إنتاج أجنة مستنسخة. هذا الأسلوب يتيح لنا إعادة إعمار الأجنة سكنت أكثر من الأساليب التقليدية نظراً لمعدل البقاء على قيد الحياة أفضل وبروتوكول مبسط. في هذا البروتوكول، وهو خطوة حاسمة واحدة خلية الانصهار. لإنتاج الفئران المستنسخة بنجاح، أنها حيوية لضمان أن يتم الاحتفاظ بكمية مناسبة من هفج الإلكترونية المبينة في البروتوكول أثناء عملية الانصهار الخلية وبويضات بحاجة إلى أن تعاد إلى الحاضنة داخل 10 دقيقة خلال الخطوات 6.2.3-6.2.5. حيث يمكن أن يستنشق الخلايا المانحة 20 إلى 30 جنبا إلى جنب مع هفج ه في وقت واحد في ماصة التلاعب، أكبر من الأسلوب الحالي عدد بويضات تم الحصول عليها خلال عملية واحدة. وفي النهاية، نحن يمكن أن تنتج بويضات أعيد بناؤها حوالي 20 إلى 30 في 10 دقيقة. حتى عندما تعمل مع مجموعة كبيرة من بويضات (100 أو أكثر)، خلية الانصهار الإجراء ينبغي أن تأخذ ساعة أو أقل بتكرار الخطوات 6.2.3-6.2.5. بالأسلوب والتقنيات المعروضة هنا يمكن اعتبارها البروتوكولات الكفء مع المتطلبات التقنية المبسطة.
وفي الوقت الحاضر، أن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير الأجنة سكنت لا تزال غير واضحة. كما يساهم هذا الأسلوب سكنت تحسين دراسة آليات إعادة برمجة هذه، وبهذه الطريقة يمكن أن تنتج العديد من الأجنة المستنسخة في تجربة واحدة فقط. يستخدم هذا الأسلوب خلايا جسدية مع أغشية سالمة من خلية لخلية الانصهار. وهكذا، قد يكون من الممكن لتطبيق هذا النهج إلى خلايا أخرى مثل الخلايا نصيحة ذيل16، خلايا سيرتولي17، والخلايا الجذعية الجنينية (ES)18. عندما تستخدم الأساليب التقليدية سكنت لحقن الخلايا الكبيرة نسبيا، مثل الخلايا نصيحة الذيل، مباشرة في السيتوبلازم البويضات، يصبح حتى من الناحية الفنية أكثر تطلبا للحصول على الأجنة الحية. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا الثابتة نسبيا، مثل خلايا سيرتولي، يصعب على الخروج من بيبيتينج للحقن. عند النظر في هذه الأنواع المختلفة من الخلية، أسلوب الانصهار الخلية استخدام هفج ه بسيطة وفعالة. على الرغم من أن قيمة وسلامة هفج ه قد تم إثبات مقنع19،20، قد يكون هاما إعادة النظر في جدوى استخدام هفج ه لإنتاج الحيوانات المستنسخة للأغراض الزراعية أو الطبية.
وعلاوة على ذلك، أنتجت مجموعة واحدة مؤخرا بنجاح الفئران المستنسخة المستمدة من الخلايا البول21. لإنقاذ أنواع الثدييات المهددة بالانقراض، من الآن فصاعدا سكنت استخدام الخلايا التي يتم جمعها بطريقة غير الغازية، مثل الخلية البول، سوف تكون مثالية. في الآونة الأخيرة، مجموعة أخرى مباشرة قد ولدت الفئران المستنسخة باستخدام خلايا CD4 محددة مستضد الخلايا+ ر22. سيكون من المثير للاهتمام أن تفحص إذا كان هذا الأسلوب ينطبق أيضا على كفاءة استنساخ الفئران من هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، أبلغ A لاترونكولين كبديل أفضل لتثبيط بلمرة الأكتين أثناء انوكلييشن والتنشيط بارثينوجينيتيك سكنت بويضات23. دراسة في المستقبل قد تكشف عما إذا كانت معاملة A لاترونكولين، بدلاً من سيتوتشالاسين ب، يحسن كذلك جيل نسل المستنسخة. بالإضافة إلى ذلك، معاملة حساب السياحة الفرعي قد استخدمت بنجاح في الفئران والأرانب25 الخنازير24بتغيير وقت العلاج والفترة والتركيز. وعلاوة على ذلك، الرأسمالي يعزز من التنمية الجنينية في الخنزير سكنت10، بل أيضا يحسن إنتاج خلايا iPS في البشر والفئران26. وبالتالي، فمن المعقول التكهن بأن معاملة حساب السياحة الفرعي والرأسمالي يمكن أن تطبق أيضا على سائر أنواع الثدييات، وإننا قد نحتاج إلى تحسين وقت المعالجة للسياحة والاستثمار الرأسمالي لكل نوع من الأنواع.
وفي الختام، هذا الأسلوب سيجعل من الممكن توليد الفئران المستنسخة بمستوى عملي من الكفاءة مع إجراءات بسيطة. ولذلك، نتائج هذه الدراسة يمكن أن تؤدي بنا إلى استخدام التكنولوجيا سكنت للحفاظ على الموارد الوراثية للحيوانات النادرة، وفهم الآليات الجزيئية لإعادة برمجة النووي والتنمية الجنينية المبكرة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل كاكينهي JSPS منحة أرقام JP15H06753، JP16H01321، JP16H01222، JP17H05045 على منحة من مؤسسة سوميتومو ك. م. "مشاريع بحوث العلوم الأساسية" (150810 إلى ك. م.). منحة بحثية في جامعة كينداي (15-I-2 ك. م. وشهادة الماجستير). مو تقر بالدعم الأساسية المقدمة من المملكة المتحدة "لأبحاث السرطان" (C6946/A24843) ومؤسسة ويلكوم ترست (203144/Z/16/Z). ونشكر السيدة أ. باك-كاميمورا، والسيد J. هورفات لدليل على القراءة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
References
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Kishigami, S., et al. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).
- Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).
- Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).
- Matoba, S., et al. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell. 159 (4), 884-895 (2014).
- Kishigami, S., et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).
- Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).
- Bui, H. T., et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).
- Chen, J., et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet. 45, 34-42 (2013).
- Huang, Y., et al. Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos. Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).
- Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos. J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules. Biol Open. 6, 415-424 (2017).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).
- Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. Manipulating the mouse embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).
- Ogura, A., et al. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells. Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).
- Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).
- Tachibana, M., et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).
- Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 1-8 (2016).
- Kaminuma, O., et al. Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells. EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).
- Terashita, Y., et al. Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization. Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).
- Zhao, J., et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).
- Shi, L. H., et al. Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).
- Esteban, M. A., et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).
