Summary
Vi beskriver en dramatiskt förbättrad metod för mus kloning med trichostatin A, C-vitamin och avjoniserat bovint serum albumin. Vi visar ett förenklat, reproducerbara protokoll som stöder effektiv utveckling av klonade embryon. Denna metod kan därför bli ett standardiserat förfarande för mus kloning.
Abstract
Somatisk kärnöverföring (SCNT) ger en unik möjlighet att direkt producera ett klonat djur från en donator-cell, och det kräver användning av skickliga tekniker. Dessutom har effektivitetsvinsterna av kloning förblivit låg sedan den framgångsrika tillverkningen av klonade djur, särskilt möss. Det har gjorts många försök att förbättra kloningens effektivitet och trichostatin A (TSA), en Histon histondeacetylas hämmare, har använts i stor utsträckning att effektivisera av kloning. Här rapporterar vi en dramatiskt förbättrad kloning metod hos möss. Somatisk kärnöverföring metoden innebär användning av Hemagglutinating virus av Japan kuvert (HVJ-E), som möjliggör lätt manipulation. Behandling med två små molekyler, TSA och C-vitamin (VC), med avjoniserat bovint serumalbumin (dBSA), är dessutom mycket effektivt för embryonal utveckling. Detta tillvägagångssätt kräver varken ytterligare injektion eller genetisk manipulation, och således presenterar en enkel, lämplig metod för praktisk användning. Denna metod skulle kunna bli en tekniskt genomförbar strategi för forskare att producera genetiskt modifierade djur från odlade celler. Dessutom kan det vara ett användbart sätt för att rädda utrotningshotade djur via kloning.
Introduction
Den SCNT-tekniken möjliggör produktion av klonade djur med hjälp av endast en somatisk cell eller en kärna ska överföras till en utan äggcell. Ett av syftena med SCNT tekniken är härledningen av kärnöverföring embryonala stamceller (NT-ESCs) linjer från klonade embryon. 1998, Wakayama et al., rapporterade producerar en framgångsrikt klonade mus som heter Cumulina för första tid1. Sedan dess har kloning av möss Allmänt har undersökts, och många viktiga insikter i nukleära omprogrammering av somatiska kärnor har erhållits. Å andra sidan, denna teknik åtföljs av talrika mikromanipulation steg som är ganska svåra att master, som kräver intensiv utbildning på mer än 3 månader2.
Produktion av klonade möss använda SCNT har utvecklats från den ursprungliga Honolulu metod1, elektrosvets metod3, till metoden cell fusion av Hemagglutinating virus av Japan (HVJ)4. Dock tenderar direkt injektion av en cellkärna genom cytomembrane att negativt påverka äggcellen överlevnad. Elektrosvets är låg i effektivitet, eftersom varje cellmembranet har olika hårdhet, vilket gör det svårt att fastställa en optimal kondition. Hantering av HVJ är arbetskrävande eftersom det kräver särskild utrustning för säkerheten för forskare och försöksdjur. Nyligen för att säkring givare cell och äggcell cytoplasman, har HVJ-E varit används5. HVJ-E har endast möjlighet att säkring membran utan virus proliferativ eller infektiösa förmåga. Genomisk RNAs av HVJ är helt inaktiverade i HVJ-E. Användningen av HVJ-E stöder således enkel hantering av Cellfusion under SCNT.
Flera rapporter har visat att behandling av SCNT embryon med TSA, en Histon histondeacetylas hämmare, betydligt effektiviserar produktionen av levande ungar från mindre än 1% till 6,5%6,7. TSA behandling accelererar omprogrammering via ändra Histon märken i SCNT embryon8. Nyligen, injektion av viss mRNA, Histon lysin demethylase underfamiljen 4 (KDM4), som tar bort Histon H3 lysin 9 (H3K9) trimethylation i SCNT embryon, särskilt vid reprograming-resistenta regioner, har visats öka utvecklingen av klonade mus embryon9. Under tiden, VC, som även fungerar som en Histon modifierare, minskat trimethylation H3K910. Dessutom förbättrar VC embryonal utveckling i svin SCNT10. Det har rapporterats att en injektion av dBSA i SCNT embryon leder till förbättring av embryonal utveckling11.
Vi har tidigare funnit att kombinationen av små molekyler, nämligen TSA och VC, tillsammans med dBSA, dramatiskt förbättrad utveckling av SCNT embryon12. Här, detalj vi tidigare rapporterade SCNT metoden för möss, som representerar mycket effektiv och enkel kloning förfaranden12. Vi beskriver också hanteringen av HVJ-E. Dessa skulle kunna hjälpa många forskare inom utvecklings- och reproduktiva biologi att bevara genetiska resurser eller producera genetiskt modifierade djur genom denna SCNT-metod.
Protocol
Alla djur förfaranden följer riktlinjerna i Kindai universitet för skötsel och användning av försöksdjur.
1. beredning av kultur Media
- Förbereda det modifierade KSOM (mKSOM) mediet för embryo kultur, bestående av 95 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0.35 mM KH2PO4, 0,2 mM MgSO4 · 7H2O, 1.71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM D (+)-glukos, 0,2 mM natrium pyruvat, 1,0 mM L-glutamin, 1,0 g/L polyvinylpyrrolidon (PVP), 25.07 mM NaHCO3, 10 mM natrium DL-laktat, 0,05 g/L Penicillin och 0,05 g/L Streptomycin i sterilt vatten.
- Förbereda Hepes-buffrat CZB (HCZB) medium för embryo manipulation, bestående av 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2na, 36,1 mM natrium DL-laktat, 5,55 mM D (+)-glukos, 0,025 g/mL Penicillin, 0,035 g/L Streptomycin, 0,014 mM fenolrött, 1,0 g/L polyvinylalkohol, 5,0 mM NaHCO3och 20.0 mM Hepes natriumsalt i sterilt vatten.
- Förbereda aktiveringen medium för äggcell aktivering: mKSOM medium kompletteras med 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 µg/mL cytochalasin B (CB) och 5 mM SrCl2.
2. upprättande av avjoniserat bovint serumalbumin (dBSA)
- Lös 1,2 g bovint serumalbumin (BSA) i 10 mL sterilt vatten vid rumstemperatur (en slutlig koncentration på 12%).
- Lägga till cirka 0,12 g blandade jonbyte harts pärlor till ovanstående beredd 12% av BSA i sterilt vatten i rumstemperatur med skonsam omrörning.
- När pärlorna ändrar färg från blå-gröna guld, återställa supernatanten med pipett. Sedan ersätta pärlorna med färska sådana (figur 1).
Obs: Byte av pärlor utförs normalt endast en gång. Det kräver eventuellt några ersättare till komplett avjonisering. Endast som en guide, om färgen på pärlorna är oförändrad från blå-grön till guld, det indikerar att jonbyte är klar. - Återställa lösningen efter bekräftar att det finns ingen färgförändring i pärlorna.
Obs: Om återvunna lösningen blir grumlig, centrifugeras för att förhindra igensättning filter (175 x g, 5 min). - Komplettera den återvunna lösningen med 250 µL av 10,5% NaHCO3.
Obs: Denna process är avsedd för den dBSA lösningen att neutralisera pH skick. NaHCO3 kan dock dispensable. - Sterilisera supernatanten med 0,45 µm filter och förvaras vid-20 ° C som dBSA stamlösning.
3. äggcellen samling
Obs: Alla möss upprätthölls i ljus-kontrollerade och luftkonditionerade rum.
- Super-ägglossning varje kvinnlig B6D2F1 mus (år 8-10 veckor) av intraperitoneal injektion 7,5 IE av gravida mare serum gonadotropin (PMSG) och 7,5 IE av humant koriongonadotropin (hCG) 48 h efter PMSG injektionen.
- Utföra eutanasi av cervikal dislokation 14-16 h efter hCG-injektionen. Incisionsfilm buken för att komma åt fortplantningsorganen använder standard dissektion tekniker13. Kortfattat, nyp ihop huden och göra ett litet laterala snitt vid mittlinjen med sax. Håll huden ordentligt ovanför och nedanför snittet och dra huden mot huvud och svans. Skär bukhinnan med sax, push spolarna i tarmen ur vägen och bekräfta förekomsten av de två hornen av livmodern, oviducts och äggstockarna.
- Utrota oviducts med liten rak sax och pincett, plats på ett ark filtrerpapper att torka blodet av ytan. Ange oviducts i mineralolja. Sedan skär upp ampulla av den äggledaren med dissektion nålar och flytta de cumulus-äggcell komplex kommer från ampulla av äggledaren till 200 µL droppar HCZB medium med 0,1% hyaluronidas. Inkubera i 5 min på en värmande tallrik.
Varning: En exponering på längre än 10 min i HCZB medium med 0,1% hyaluronidas skulle vara skadlig för oocyterna. - Bekräfta att cumulus celler frigörs från de cumulus-äggcell komplex under ett stereomikroskop, överföring andra meiotiska metafas (MII) scenen oocyter med vissa återstående cumulus celler till mKSOM medium innehållande 0,3% dBSA. Sedan tvätta MII scenen oocyterna fyra gånger genom pipettering upp och ner (med hjälp av en pipett av < 100 µm innerdiameter) i mKSOM medium innehållande 0,3% dBSA för demontering återstående cumulus cellerna.
Obs: Användning av en liten pipett underlättar avlossning av cumulus cellerna. - Inkubera Mll scenen oocyter i mKSOM medium innehållande 0,3% dBSA vid 37 ° C under 5% CO2 inkubator tills enucleation.
Obs: En liten pipett med en diameter som är något större än äggcellen rekommenderas.
4. beredning av donatorcellerna för kärnöverföring
- Efter steg 3,3-3,5, är utblottad oocyter isolerade från de cumulus-äggcell komplex. Överföra en liten mängd (ungefär 2 µL) av de återstående cumulus celler skingrade från cumulus-äggcellen komplexen i HCZB medium med 0,1% hyaluronidas HCZB medium med 6% dBSA med hjälp av en pipett under ett stereomikroskop.
- Placera cumulus cellerna i HCZB medium med 6% dBSA på värmande plattan vid 37 ° C tills den behövs för SCNT.
Obs: När fibroblast celler (t.ex., murina fostrets fibroblast celler) är används som donatorcellerna, lossa cellerna från en vävnadskultur maträtt och centrifugera dem in i en pellet. Återsuspendera pelleten i celler i HCZB medium som innehåller 6% dBSA.
5. enucleation oocyter
- Förbereda 9% PVP medium genom att lägga till 0.9 g PVP 10 mL HCZB medium, hålla i kylskåp över natten (4 ° C) och sedan sterilisera den med ett 0,45 µm filter.
- Förbereda CB stamlösningar (koncentration av 1 mg/mL) genom att lägga till 5 mg av CB 5 mL av dimetyl sulfoxid (DMSO). Späd stamlösningen CB med HCZB medium (en slutkoncentration på 5 µg/mL) och använda som enucleation lösning.
- Tvätta de Mll scenen oocyterna i 20 µL av HCZB medium innehållande 5 µg/mL CB (enucleation lösning) genom inandning och utandning genom steriliserade pipetten (innerdiameter: 150 µm till 200 µm). Upprepa förfarandet för tvätt fem gånger. Vänta cirka 10 minuter på värmande plattan i enucleation lösning innan du börjar enucleation.
- Förbered enucleation kammaren som visas i figur 2A. Överföra Mll oocyterna till enucleation kammaren genom inandning och utandning använder pipetten (innerdiameter: 150 µm till 200 µm); Placera 4 µL enucleation lösning och täck kammaren med mineralolja.
Obs: I stället för en kammare, en cover på en 60 mm petriskål kan användas. - Identifiera spindlar och kromosomer av den MII scenen äggcellen i Mikroskop (X 400) vid rumstemperatur. Rikta den Mll scenen äggcellen med uttalad första polar kroppen, så att placeringen av spindeln och kromosom är på 3 eller klockan 9 (figur 2B) position med hjälp av en anläggning pipett och mikropipett.
Obs: Mikroskopet används har linser av 400 X förstoring. Objektivet Nordström är också 5 X / 0,12 och 40 X / 0,55. Piezo puls köra av pipetten tillåter snabb borrning av zona pellucida. Dessutom är en laser-system (t.ex., XYClone) också användbara för borrning av zona pellucida i stället för piezo drivande systemet. - Ange piezo puls intensitet till 3-6, och borra att zona pellucida med mikromanipulation pipett (7-8 µm inre diameter platt-slutade spets) med piezo pulsen körning. Efter öppnandet en hål i zona pellucida, helt enucleate de spindlar och kromosomer med en minimal mängd av cytoplasman (figur 2 c).
Obs: Under denna process, oocyter tenderar att ordentligt fästa längst maträtt eller Pipettera på grund av mediet utan BSA14. Inom 10 min, enucleation processen måste slutföras, och utan oocyterna behöver returneras till inkubatorn. Lämpligt antal oocyter som kan manipuleras i ett enucleation är mellan 10 och 20. För större partier av oocyter upprepas enucleation proceduren. - Bekräfta avsaknaden av kromosomer i cytoplasman under synligt ljus (figur 2 c, mitten) och tvätta utan oocyterna i mKSOM medium innehållande 0,3% dBSA saknar CB. Introducera skålen till inkubatorn vid 37 ° C under 5% CO2 tills Cellfusion.
Obs: Efter enucleation, cytoplasman bort från ooplasm innehåller spindlar och kromosomer.
6. fusion av en givare Cell och en utan äggcell
-
Beredning av HVJ-E
- Lägg till 260 µL iskall HVJ-E fjädring lösning till frystorkade HVJ-E (från kit, se Tabell av material) och Pipettera upp och ner tills helt avstängd.
Observera: Lämplig mängd frystorkade HVJ-E bereds i en flaska och 260 µL HVJ-E fjädring lösning ingår i kitet. - Förbereda 5 µL portioner av HVJ-E lösningen, och sedan förvaras vid-80 ° C tills Cellfusion.
Försiktighet: Behandla noggrant HVJ-E på is, eftersom det är temperaturkänsliga. Efter slutförandet av experiment, lämpligt autoklav HVJ-E material och behållare för att helt inaktivera virus komponenter.
- Lägg till 260 µL iskall HVJ-E fjädring lösning till frystorkade HVJ-E (från kit, se Tabell av material) och Pipettera upp och ner tills helt avstängd.
-
Cellfusion
- Späd en 5 µL HVJ-E lösning med 20 µL av den cell fusion buffert omedelbart före användning. Placera den utspädda HVJ-E lösningen på is fram till användning.
Obs: Cell fusion bufferten ingår i HVJ-E kit. - Förbereda cell fusion kammaren som visas i figur 3A. Överföra utan oocyterna till HCZB medium på cell fusion kammaren använder pipetten (innerdiameter: 150 µm till 200 µm); plats 4 µL av varje lösning (HCZB medium som innehåller 6% -BSA för donatorcellerna, HVJ-E lösning, HCZB medium, 9% PVP i HCZB medium) och täcka kammaren med ungefär 1 mL av mineralolja.
Obs: Lämpligt antal utan oocyter som överförs till kammaren för manipulation under en cell fusion förfarande är från 5 till 30. För större partier av oocyter upprepas cell fusion proceduren. I stället för kammaren, kan en 60 mm petriskål cover användas, om tillgängligt. - Placera de utan oocyterna i HCZB medium under ett Mikroskop 400 X magnificationat i rumstemperatur. Aspirera donatorcellerna använder mikromanipulation pipetten (6-7 µm inre diameter platt-slutade spets), och utvisa celler till HVJ-E fjädring lösning.
- Sedan aspirera cumulus celler taget med HVJ-E suspension lösningen att vara lika separerade från varandra, gör det möjligt för seriell Cellfusion. Hålla utan oocyterna i HCZB medium med innehav pipett. Borra zona pellucida med mikromanipulation pipetten med piezo pulsen (intensitet av 3-6, hastighet av 2-3).
- Efter öppnandet hålet i zona pellucida, placera en cumulus cell tätt till äggcellen membranet, tillsammans med HVJ-E fjädring lösning med en volym 5 gånger volymen av en cumulus cell, utan att gå via äggcellen membranet.
Obs: Förbereda 6-7 µm inre diameter platt-slutade tips mikromanipulation pipetter för cumulus celler. Pipetter måste tvättas regelbundet använder 9% PVP medium för att upprätthålla smidig cell release. Steg 6.2.3 - 6.2.5 måste vara klar inom 10 min, eller effektiviteten av Cellfusion blir lägre. Membranet fusion aktivitet av HVJ-E är inaktiverat i autoklav, behandling med rengöringsmedel, eller 70% etanol. Efter experimentet, måste HVJ-E lösningen på lämpligt sätt bortskaffas. - Efter manipulation av Cellfusion, omgående överföra oocyterna till mKSOM medium innehållande 0,3% dBSA och flytta till en inkubator vid 37 ° C under 5% CO2 för 1 h.
- Späd en 5 µL HVJ-E lösning med 20 µL av den cell fusion buffert omedelbart före användning. Placera den utspädda HVJ-E lösningen på is fram till användning.
7. aktivering av rekonstruerade oocyter och behandling med Trichostatin A och C-Vitamin
-
Beredning av TSA
- Dosera 5 mM TSA lösning i 3 µL portioner och lagra lösningen vid-20 ° C.
- Tillsätt 2,5 µL av 5 mM TSA stamlösning 1 ml av DMSO (en koncentration av 12,5 µM).
- Späd 8 µL av 12,5 µM TSA stamlösning i 2 mL av aktiveringen medium och mKSOM medium (en slutlig koncentration på 50 nM).
-
Beredning av VC
- Lägg till 1 mg VC i 1 mL sterila endotoxinfria vatten och förvaras vid-20 ° C.
- Lägg till VC stamlösning till mKSOM medium (en slutlig koncentration på 10 µg/mL).
-
Aktivering av de rekonstruerade oocyterna
- En timme efter Cellfusion, kontrollera den förtida kromosom kondens (PCC) i de rekonstruerade oocyterna (figur 3B) med Mikroskop (X 400).
- Överföra rekonstruerade oocyterna till aktiveringen medium (se steg 1.3) som innehåller TSA och inkubera i 6 h vid 37 ° C under 5% CO2 i luft (figur 3 c). Observera bildandet av pro-kärnor i SCNT embryon, och applicera sedan 2 timmar TSA behandling i mKSOM medium innehållande 0,3% dBSA (figur 2 c).
- Överföra de TSA-behandlade embryona till mKSOM medium kompletteras med VC och inkubera i 7 h, som visas i figur 3D.
- Efter 7 h VC behandling, överföra VC-behandlade embryon till mKSOM medium innehållande 0,3% dBSA och inkubera i 4 dagar vid 37 ° C under 5% CO2 i luften.
Obs: För att producera klonade möss, överför morfologiskt normala 2-cellstadie embryon till oviducts av pseudo dräktiga honmöss (MCH(ICR)) dag när en vaginal plug hittas (0,5 dag pseudograviditet)15. Efter 19,5 dagar registreras antalet implantationsställen och nyfödda efter kejsarsnitt.
Representative Results
För att producera klonade musembryon, användes cumulus och fostrets fibroblast celler. Antalet rekonstruerade oocyter och utveckling till 2-cells scenen efter äggcellen aktivering visas i tabell 1. En mycket hög frekvens av pronukleär bildandet (89 till 100%) och utveckling till 2-cells scenen (77-89%) observerades under alla förhållanden. Några av klonade embryon, som härrör från cumulus celler och utvecklas till 2-cells scenen, överfördes till oviducts av pseudo dräktiga honor. Sex klonad avkomma av 72 överförda embryon producerades från tre dräktiga honor genom seriell behandling av TSA och VC (figur 4). Ungefär 15% av klonade embryon har rapporterats att utveckla till sikt genom att följa denna SCNT förfaranden12. Överföring av klonade 2-cells embryon vid andra institutioner har dessutom uppnått 9 till 15% levande avkomma, som representerar bättre utveckling än den enda TSA behandlingen på klonade embryon. Dessutom behandling med TSA och VC avsevärt förbättrat effektiviteten i in vitro- embryonal utveckling till blastocyststadiet (tabell 2, P < 0,05, Students t-test). Dessa in vitro- developmental data visar att den positiva effekten av TSA och VC är begränsad av mus stammar varken av celltyper. Dessa resultat tyder på att SCNT metoden underlättar fosterskadande förmåga av klonade embryon.
Figur 1: Beredning av dBSA.
Stegvisa procedurer för att förbereda dBSA lösningen är avbildade. Omfattningen av jonbyte kan bedömas av färgaändringen av pärlorna. Övre vänstra figuren visar att 1,2 g av BSA löses i 10 mL sterilt vatten i rumstemperatur. Efter att BSA är upplöst, läggs jonbyte harts pärlor (övre högra). När blandningen av BSA lösning med jonbyte harts pärlor ändrar färg från blå-grön guld (längst ned till höger), ersätta pärlorna med färska. Nedre vänstra figuren visar att färg på pärlor förblir blå-grön, och jonbyte är klar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Enucleation förfaranden.
(A) en illustration av enucleation kammaren. Enucleation oocyter utförs i HCZB medium med CB. Piezo drivande systemet, används en plats av 9% PVP medium för att förbereda glas pipetten för enucleation. Ställen täcks av mineralolja. (B) ett diagram och en Mikrograf Visa positionen av spindlar och kromosomer innan enucleation. Svart pilspetsar: de spindlar och kromosomer. Röda pilspetsar: första polar kroppen. (C) en diagram och en Mikrograf Visa framgångsrika enucleation. Svart pilspetsar: de spindlar och kromosomer. Röd pilspets: första polar kroppen. Blå pilspets: hålet i zona pellucida. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cell fusion förfaranden och kultur villkora av SCNT embryon.
(A) en illustration av cell fusion kammaren. Cellfusion utförs i HCZB medium som innehåller 6% dBSA. En plats av 9% PVP medium används för att förbereda glas pipetten för Cellfusion. Ställen täcks av mineralolja. (B) ett diagram och en Mikrograf av förtida kromosom kondens bildas en timme efter Cellfusion (svart pil). (C) en diagram- och en Mikrograf pronukleär struktur bildade sex timmar efter aktivering (svarta pilar). (D) systemet med TSA, VC och dBSA behandlingen av SCNT embryon. Grön pil representerar behandling med TSA, följt av inkubation med VC (gul pil) under mKSOM medium innehållande med 0,3% dBSA (blå pil). Pilen huvuden anger tidpunkten för ändring av medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Klonad avkomma härrör från cumulus celler bara efter kejsarsnitt efter 19,5 dagarna av graviditeten.
På den översta raden finns efterbörd. Klonad avkomma visas här genererades i en kärnöverföring experimentera från tre foster mödrar. Moderkakan storlek var 1,5 till 2 gånger större än storleken på de som produceras av in vitro- fertilisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Grupp | Givare celltyp | Mus-stam | Lol oocyter som används | Lol oocyter smält | Lol oocyter visar tidig kromosom kondens | Lol oocyter visar pronuclei bildandet (%) | Lol pronuclei-bildade oocyter som utvecklats 2-cells embryon (%) |
|
| TSA, VC | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 81 (99) | 72 (89) | |
| obehandlat | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 84 | 82 | 82 | 82 (100) | 68 (83) | |
| TSA, VC | fostrets fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 202 | 171 | 169 | 151 (89) | 124 (82) | |
| obehandlat | fostrets fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 201 | 171 | 147 | 142 (97) | 109 (77) | |
Tabell 1: effekter av TSA och VC behandlingen på den in vitro- utveckling av klonade musembryon till 2-cells scenen.
| Grupp | Givare celltyp | Mus-stam | Lol 2-cells embryon används | Lol 2-cells embryon utvecklats till varje stadier (%) | |||
| 4-cell | morula | blastocysten | |||||
| TSA, VC | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 152 | 152 (100) | 149 (98) | 135 (89) en | |
| obehandlat | Cumulus | C57BL/6 × DBA/2 | 83 | 47 (57) | 41 (49) | 32 (39) b | |
| TSA, VC | fostrets fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 124 | 110 (89) | 101 (81) | 88 (71) c | |
| obehandlat | fostrets fibroblast | MCH(ICR)×MCH(ICR) | 109 | 54 (50) | 45 (41) | 29 (27) d | |
| a-b, c-d Olika upphöjd inom samma givare celler representerar signifikanta skillnader (P < 0,05) | |||||||
Tabell 2: effekter av TSA och VC behandlingen på den in vitro- utveckling av klonade musembryon i blastocyststadiet.
Discussion
Sammanfattningsvis tyder dessa resultat på att SCNT metod kunde minska tekniska svårigheter, öka effektiviteten av SCNT utan att genetisk modifiering och mRNA tillskott (tabell 1, tabell 2) och säkerställa stabil produktion av klonade embryon. Denna metod gör det möjligt för oss att rekonstruera mer SCNT embryon än konventionella metoder på grund av den bättre överlevnaden och förenklat protokoll. I detta protokoll är ett kritiskt steg Cellfusion. För att framgångsrikt producera klonade möss, är det viktigt att säkerställa att rätt mängd HVJ-E beskrivs i protokollet bibehålls under cell fusionsprocessen och oocyter behöver returneras till inkubatorn inom 10 min under stegen 6.2.3 - 6.2.5. Eftersom 20 till 30 donatorcellerna kan vara aspirerade tillsammans med HVJ-E i taget i manipulation pipetten, är antalet oocyter som erhållits genom en operation större än den befintliga metoden. I slutändan kan vi producera ungefär 20 till 30 åter Byggyta oocyter inom 10 min. Även när du arbetar med en stor sats av oocyter (100 eller fler), cell fusion förfarandet bör ta en timme eller mindre genom att upprepa stegen 6.2.3 - 6.2.5. Metod och tekniker som presenteras här kan fungera som effektiva protokoll med förenklade tekniska krav.
Närvarande är de molekylära mekanismerna bakom utvecklingen av SCNT embryon fortfarande oklart. Denna förbättrade SCNT-metod bidrar också till studera sådan omprogrammering mekanismer, eftersom denna metod kan producera många klonade embryon i bara ett experiment. Denna metod använder kroppsceller med intakt cellmembran för Cellfusion. Således kan det vara möjligt att tillämpa denna strategi till andra celler såsom tail tip celler16, sertoli celler17och embryonala stamceller (ES) celler18. När konventionella SCNT metoder används för att injicera relativt stora celler, såsom tail tip-cellerna, direkt in i äggcellen cytoplasman, det blir även mer tekniskt krävande att få levande embryon. Dessutom är relativt hård celler, såsom sertoli celler, svåra att bryta genom pipettering för att injicera. När dessa olika celltyper anses vara är metoden cell fusion utnyttja HVJ-E enkel och effektiv. Även om det värdet och säkerhet HVJ-E har övertygande visat19,20, kan det vara viktigt att åter överväga möjligheten att använda HVJ-E för att producera klonade djur för jordbruks- eller biomedicinska ändamål.
Dessutom producerade nyligen en grupp framgångsrikt klonat möss härstammar från urin celler21. För att rädda utrotningshotade däggdjur, kommer hädanefter SCNT använder cellerna samlas i ett icke-invasivt sätt, till exempel urin cellen, vara perfekt. Mer nyligen, en annan grupp direkt har genererat klonade möss använder antigen-specifika CD4+ T cells22. Det vore intressant att undersöka om denna metod är också tillämpliga på effektivt klona möss från sådana celler. Latrunculin A har dessutom rapporterats som ett bättre alternativ för att hämma aktin polymerisation under enucleation och partenogenetiska aktivering av SCNT oocyter23. Framtida studie kan avslöja om Latrunculin A behandlingen, i stället för cytochalasin B, ytterligare förbättrar generation av klonade avkomma. Dessutom har TSA behandling framgångsrikt använts i möss, grisar24och kaniner25 genom att ändra behandlingstid, period och koncentration. Dessutom VC inte bara förbättrar embryonal utveckling i svin SCNT10, men förbättrar också iPS cellproduktion hos människor och möss26. Det är således rimligt att spekulera TSA och VC behandling kan också tillämpas på andra däggdjursarter, som vi kan behöva optimera behandlingstiden av TSA och VC för varje art.
Avslutningsvis skulle denna metod göra det möjligt att generera klonade möss med en praktisk nivå av effektivitet med enkla rutiner. Därför kan resultaten av denna studie leda oss att använda SCNT tekniken för att bevara genetiska resurser av sällsynta djur, och för att förstå de molekylära mekanismerna av nukleära omprogrammering och tidig embryonal utveckling.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av JSPS KAKENHI grant nummer JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 till K.M. Sumitomo Foundation Grant för grundläggande forskningsprojekt (150810 till K.M.). Kindai universitet forskningsanslag (15-I-2 K.M. och M.A.). M.O. bekräftar core stöd som tillhandahålls av Cancer Research UK (C6946/A24843) och Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Vi tackar Ms. N. Backes-Kamimura och Mr J. Horvat för korrekturläsning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
| MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
| CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
| Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
| Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
| NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
| Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
| Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
| Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
| Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
| EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
| Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
| BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
| Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
| Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
| HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
| SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
| Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |
References
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Kishigami, S., et al. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).
- Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).
- Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).
- Matoba, S., et al. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell. 159 (4), 884-895 (2014).
- Kishigami, S., et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).
- Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).
- Bui, H. T., et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).
- Chen, J., et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet. 45, 34-42 (2013).
- Huang, Y., et al. Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos. Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).
- Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos. J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules. Biol Open. 6, 415-424 (2017).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
- Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).
- Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. Manipulating the mouse embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).
- Ogura, A., et al. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells. Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).
- Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).
- Tachibana, M., et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).
- Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 1-8 (2016).
- Kaminuma, O., et al. Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells. EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).
- Terashita, Y., et al. Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization. Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).
- Zhao, J., et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).
- Shi, L. H., et al. Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).
- Esteban, M. A., et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).
