Summary
Her præsenterer vi en mus hjernen vaskulær permeabilitet analyse ved hjælp af intraperitoneal injektion af fluorescerende sporstoffer efterfulgt af perfusion, der er gældende for animalske modeller af blod - hjerne barrieren dysfunktion. Én hemi-hjerne bruges til vurdering af permeabilitet kvantitativt, og den anden for tracer visualisering/immunfarvning. Proceduren tager 5-6 h for 10 mus.
Abstract
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en specialiseret barriere, som beskytter hjernen mikromiljø fra toksiner og patogener i omløb og vedligeholder hjernen homøostase. De vigtigste steder af barrieren er endotelceller af hjernen kapillærerne hvis barriere funktion resultater fra stramme intercellulære kryds og efflux transportvirksomheder udtrykt på plasmamembran. Denne funktion er reguleret af pericytes og astrocytter, der tilsammen udgør den neurovaskulære enhed (NVU). Flere neurologiske sygdomme som slagtilfælde, Alzheimers sygdom (AD), hjernetumorer er forbundet med en nedsat BBB funktion. Vurdering af BBB permeabilitet er derfor afgørende for evaluering af sværhedsgraden af den neurologiske sygdom og succes af behandling strategier ansat.
Vi præsenterer her en simpel endnu robust permeabilitet assay, der har været anvendt med succes til flere mus modeller både, genetiske og eksperimenterende. Metoden er meget kvantitative og objektive i forhold til tracer fluorescens analyse af mikroskopi, der er almindeligt anvendt. I denne metode, er mus indsprøjtet intraperitoneal med en blanding af vandig inert fluorescerende sporstoffer efterfulgt af bedøve musene. Hjerte perfusion af dyrene er udført før høst hjerne, nyrer og andre organer. Organer er homogeniseret og centrifugeres efterfulgt af fluorescens målingen fra supernatanten. Blodet fra de kardiale punktering lige før perfusion serverer til normalisering formål, den vaskulære rum. Væv Fluorescens er normaliseret til den våde vægt og serum fluorescens at opnå en kvantitativ tracer permeabilitet indeks. For yderligere bekræftelse, kan de kontralaterale hemi-hjerne bevaret for Immunhistokemi udnyttes til tracer fluorescens visualisering formål.
Introduction
Blod - hjerne barrieren (BBB) består af mikrovaskulære endotelceller (ECs) understøttes af tæt forbundet pericytes (pc'er), som er ensheathed i basal lamina, og astrocytter (ACs), indhylle basalmembranen med deres ende-fødder1 ,2. ECs interagere med flere celletyper, der understøtter og regulere den barriere funktion, primært ACs og pc'er, og også neuroner og mikroglia, alle sammen danner neurovaskulære enhed (NVU). NVU er kritisk for funktionen af BBB, som begrænser transport af blodbårne toksiner og patogener i at trænge ind i hjernen. Denne funktion er et resultat af stram vejkryds molekyler såsom claudin-5, occludin, zonula occludens-1, som er til stede mellem ECs og også på grund af virkningen af transportvirksomheder som p-glykoprotein (P-gp) at efflux molekyler, der indtaste endotelet tilbage i fartøj lumen1,2,3. BBB giver dog mulighed for transport af vigtige molekyler såsom næringsstoffer (glucose, jern, aminosyrer) af specifikke transportvirksomheder givet udtryk for på EF plasma membraner1,2,3. EF-lag er meget polariseret med hensyn til fordelingen af de forskellige transportvirksomheder mellem luminale (blod-vender) og abluminal (hjerne-vender membraner) at give mulighed for den specifikke og vektorielt transport funktion4,5 . Mens BBB er beskyttende over for stramt regulering CNS milieu, er det en stor udfordring for CNS medicinafgivelse i sygdomme som Parkinsons med en funktionel BBB. Selv i neurologiske sygdomme med BBB dysfunktion, kan det antages, at hjernen medicinafgivelse er øget især som barriere dysfunktion kan omfatte skader på de særlige transporter mål for eksempel som i Alzheimers sygdom (AD). I Annoncen, flere amyloid beta transportvirksomheder som LRP1, RASERI, P-gp er kendt for at være dysregulated og dermed målrette disse transportvirksomheder kan være nytteløs6,7,8. BBB er forringet i flere neurologiske sygdomme som slagtilfælde, annonce, meningitis, sklerose, og i hjerne tumorer9,10,11. Genoprette funktionen barriere er en afgørende del af den terapeutiske strategi og dermed dens vurdering er kritisk.
I dette arbejde, har vi beskrevet en objektiv og kvantitativ protokol for permeabilitet assay i gnavere, vi med held anvendt til flere mus linjer begge transgene og eksperimenterende sygdom modeller10,12,13 ,14. Metoden er baseret på en simpel intraperitoneal injektion af fluorescerende sporstoffer efterfulgt af perfusion af musene at fjerne røbestoffer fra det vaskulære rum. Hjernen og andre organer er indsamlet post perfusion og permeabilitet vurderet af en objektiv og absolutte permeabilitet indeks baseret på fluorescens målinger af væv homogeniseret i en pladelæseren. Alle rå fluorescens værdier er korrigeret for baggrunden ved hjælp af væv homogeniseret eller serum fra sham dyr, der ikke modtager nogen tracer. Rigelig normalizations medtages for serum volumen, serum fluorescens og vægten af væv, hvilket giver permeabilitet indeks, der er absolut og sammenlignelige mellem eksperimenter og vævstyper. For at lette sammenligning mellem grupper, kan de absolutte permeabilitet indeksværdier let omdannes til nøgletal som vi havde udført tidligere12. Samtidigt, kunne gemte hemi-hjerne og nyrer udnyttes til tracer visualisering af Fluorescens mikroskopi10. Den klassiske Fluorescens mikroskopi kunne være værdifuldt at opnå regional forskel i permeabilitet, omend besværlig på grund af subjektive udvalg af væv sektioner og billeder til en semi-kvantitative analyse. De detaljerede trin præsenteres i protokollen og noter er tilføjet eventuelt. Dette giver de nødvendige oplysninger for at held udføre i vivo permeabilitet assay i mus, der kan skaleres til andre små dyr. Analysen kan anvendes til mange former for røbestoffer giver mulighed for beregning og størrelse baseret permeabilitet vurdering af en kombination af røbestoffer med særskilte fluorescens-spektre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene blev håndteret med yderste omhu minimere smerter eller ubehag i forbindelse med proceduren. Denne procedure følger retningslinjerne dyrs pleje af vores institution og er blevet godkendt af de lokale udvalg (Regierungspraesidium Darmstadt, godkendelsesnummer FK/1044).
En skematisk af arbejde skridt for i vivo permeabilitet assay i mus er vist i figur 1. Oplysninger om hvert trin er beskrevet nedenfor.
1. dyr håndtering
-
Forberedelse og forvaltning af røbestoffer og anæstesiologi
- Forberede mærket rør og forme til væv indlejring mindst en dag før permeabilitet assay. Opretholde sterile forhold i hele protokollen ved arbejde under ren stinkskab og bruge værktøjer rengøres med 80% ethanol. Brug mandlige eller kvindelige wild-type (WT) eller angiopoietin-2 (Ang-2) gevinst af funktion (GOF) CD1 mus i den modne voksne aldersgruppe 3-6 måneder for den nuværende protokol. Udføre genotypebestemmelse af mus som tidligere beskrevet 10.
Bemærk: 80% alkohol vil ikke resultere i sterile instrumenter men vil minimere forurening af prøverne forberedt. - Fortynd alle røbestoffer i steril PBS til 2 mM bestande og gemme de delprøver, beskyttet mod lys ved-20 ° C.
- Vælge røbestoffer som (Tetramethyl rodamin) TMR og (fluorescein isothiocyanat) FITC med særskilte excitation/emission spectra og der er lysin fixable resulterer i minimal interferens mellem farvestofferne af Fluorescens mikroskopi (ved hjælp af TMR eller FITC filtrere henholdsvis) og af fluorometry i en Pladelæser til permeabilitet assay.
Bemærk: TMR dextran 3 kD og FITC dextran 3 kD anvendes i undersøgelsen er begge fixable Lysin og dermed kunne også bruges til immunhistokemisk analyse efter fiksering med aldehyder for at undersøge regionale forskelle. - Håndtere alle dyr med omhu efter retningslinjerne for institutionel pleje. Injicere intraperitoneal hver mus med 100 µL tracer løsning, der kan øges op til 200 µL, når en ekstra tracer kombineres ved hjælp af 100 µL af hver sporstof i en 1:1 blanding10,13. Injicere mindst ét dyr med PBS alene i stedet for røbestoffer til at tjene som sham kontrol for autofluorescence baggrund subtraktion.
- 5 min efter injektion af tracer, bedøver dyret med en i.p indsprøjtning af ketamin og xylazin (100 mg og 5-10 mg i 0,9% saltvand pr. kg krop vægt henholdsvis 150 µL af cocktail pr. 25 g mus).
Bemærk: Vet salve blev ikke anvendt på øjne under proceduren som perioden mellem dyrs anæstesi og perfusion/offer var kort (10 minutter) hvor enhver udtørring af øjnene blev ikke observeret.
- Forberede mærket rør og forme til væv indlejring mindst en dag før permeabilitet assay. Opretholde sterile forhold i hele protokollen ved arbejde under ren stinkskab og bruge værktøjer rengøres med 80% ethanol. Brug mandlige eller kvindelige wild-type (WT) eller angiopoietin-2 (Ang-2) gevinst af funktion (GOF) CD1 mus i den modne voksne aldersgruppe 3-6 måneder for den nuværende protokol. Udføre genotypebestemmelse af mus som tidligere beskrevet 10.
-
Blod samling og hjerte perfusion
- Forberede hjerte perfusion 10 min efter bedøvende administration til dyr. Kontrollere pote ryk reaktion for at sikre, at dyret nået et kirurgisk fly af anæstesi.
- Lægge dyrene på deres ryg og anvende 80% ethanol på huden af maveregionen. Ved hjælp af lille saks, lukke sig op den abdominale væg med et lille snit (2 cm) lige under brystkassen. Adskille leveren fra mellemgulvet og derefter langsomt skære igennem mellemgulvet udsætter pleural hulrum 15.
- Skære brystkassen bilateralt og løse snit brystbenet for at udsætte den venstre ventrikel. Indsæt en 21-gauge sommerfugl kanyle tilsluttet en peristaltiske perfusion system i bageste venstre hjertekammer.
- Punktere højre atrium og hurtigt (inden for 10 s) indsamle 200-300 µL af blod frigives i brysthulen ved hjælp af 1 mL pipette tips (med slutningen cut-off) i serum indsamling rør og gemme det på is.
Bemærk: Denne perfusion procedure er ikke-overlevelse. - Så snart blodet er indsamlet, tænde perfusion system (10-12 rpm, 5 mL/min) og perfuse dyr i 3 min. med varme (RT) 1 x PBS (gratis af Ca2 +/Mg2 + ioner).
Bemærk: PBS indeholdende Ca2 +/Mg2 + ioner kan udnyttes til bedre hjertet aktivitet under perfusion. Det samlede beløb af PBS bruges til perfusion er i intervallet 15-20 mL. - Vurdere perfusion kvalitet ved at bemærke farven af leveren, nyrerne, der vises hvide/bleg efter perfusion.
Bemærk: Nyre eller lever perfusion betyder ikke nødvendigvis hjernens perfusion som arterier (carotis/vertebrale) nå hjernen fra aorta kan få bristede under forberedelse i trin 3 især under den atriale punktering.
2. Vævscentre behandling
- Orgel indsamling og opbevaring
- For enden af perfusion bekræfte død af dyr af cervikal dislokation og høst hjerne og nyrer. Kontrollere hjernens perfusion af farven på hjerner (ikke synligt blod i fartøjer af meninges), for at udelukke dyr fra permeabilitet analyse når perfusion kvalitet ikke er god. Adskille hjernen i 2 hemibrains ved hjælp af en skalpel (figur 1).
- Dissekere med en skalpel en hemibrain fri for olfaktoriske lapper og lillehjernen og overførsel af hemicerebrum til et 2-mL-rør. Gemme hemi-lillehjernen i en ekstra rør, hvis det kræves for cerebellare permeabilitet vurdering.
- Overføre en enkelt nyre til en anden 2-mL-rør. Opbevare prøver straks på tøris.
- Integrere indbygget den tilbageværende nyre og hemi-hjerne (bestående af lillehjernen og olfaktoriske lapper) i væv-tek optimal opskæring temperatur (O.C.T) sammensatte på tøris.
- I sidste ende, centrifugeres blodprøverne opbevares på is i serum indsamling rør på 10, 000 g, 10 min. ved 4 ° C. Overføre serum supernatanter til 1,5 mL rør og placere dem i objektbeholderen tøris.
- Overføre alle de prøver, der opsamlet på tøris til-80 ° C fryser indtil videre forarbejdning.
Bemærk: Det er vigtigt at fryse prøver, før du fortsætter til homogenisering trin som homogenisering effektivitet øges efter som fryse optøning.
- Homogenisering og centrifugering
- Tø på is hemi-cerebrum og nyre prøverne frosset ned ved-80 ° C og vejer de rør, der indeholder organerne. Fra disse vægte, subtrahere gennemsnitsværdien af flere tomme rør (ca 20) at få væv vægt. Tilsæt 300 µL og 200 µL koldt 1 X PBS til rør indeholdende nyre og hemi-cerebrum, henholdsvis.
Bemærk: For lavere mængder af væv (ligesom hemi-lillehjernen, nedenfor 100 mg) vejer de enkelte rør anbefales. - Omrystes hver prøve i den oprindelige eppendorf-rør med en polytetrafluorethylen (PTFE) pistil knyttet til en elektrisk overhead omrører (1, 000 rpm) ved at udføre ca. 15 slag (1 streg = 1 op og 1 ned). Skyl pistil med PBS i mellem prøver og tør før man går videre til den næste prøve.
Bemærk: Brugen af detergenter i løbet af homogenisering var undgås på grund af potentiel interferens med fluorometry. Intracellulære tracer registreres imidlertid også i denne protokol, som er grundigt homogeniseret væv, som er mere effektiv, efter en runde af fryse optøning. - Gemme de homogeniserede prøver på is beskyttet mod lys, og der centrifugeres alle sammen i sidste ende på 15.000 g, 20 min, 4 ° C i en bordplade centrifuge. Overføre supernatanter til en ny 1,5 mL rør på isen for umiddelbar fluorometry eller ved-80 ° C skal analyseres senere.
- Tø på is hemi-cerebrum og nyre prøverne frosset ned ved-80 ° C og vejer de rør, der indeholder organerne. Fra disse vægte, subtrahere gennemsnitsværdien af flere tomme rør (ca 20) at få væv vægt. Tilsæt 300 µL og 200 µL koldt 1 X PBS til rør indeholdende nyre og hemi-cerebrum, henholdsvis.
- Fluorescens målingen og kvantificering
- Hvis frosset i slutningen af det forrige trin, tø på is væv supernatanten og serum prøverne opbevares ved-80 ˚C beskytte dem mod lys med folien.
- Der afpipetteres 50 µL fortyndede serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) eller væv analysere (som er) i en 384-godt sort plade. Omfatte mindst en prøve fra sham dyr for serum og væv analysere at sikre ordentlig baggrund subtraktion, som dette væv homogenatet baggrund er normalt højere end PBS bruges som fortyndingsvæsken.
Bemærk: Gennemsnitligt 3 fingeret dyr kan bruges til autofluorescence, selv om en meget lille variation i sham autofluorescence værdier (data ikke vist) blev observeret. Mængden af serum anvendes kan reduceres ved at fortynde det med PBS, som også kan øge signal-støj-forholdet for prøver med lav fluorescens som hjernen prøver. Op til 10 µL serum blev testet fortynde det med 40 µL PBS. Sørg for, at ingen bobler i brøndene. - Indsætter i pladelæseren 384-godt sort nummerpladen og åbne et nyt script at vælge fluorescens målingen.
- Angive gevinst til optimal og bruge excitation/emission (nm) værdier af 550/580 eller 490/520 for TMR eller FITC dyee henholdsvis og start måling for at få rå fluorescens enheder (RFUs).
- Bruge rå fluorescens enheder (RFUs) fra pladelæseren til at beregne permeabilitet indeks (PI) efter fratrække de tilsvarende sham værdier.
- * Permeabilitet indeks (mL/g) = (Væv RFUs/g væv vægt) / (Serum RFUs/mL serum)
- Eksempel beregning for hjernen permeabilitet indeks (PI) af dyr GOF1 (tabel 1):
- GOF1 hjernen RFUs - HUMBUG hjernen RFUs = 154-22,5 = 131.5
- GOF1 serum RFUs - HUMBUG serum RFUs = 38305-27 = 38278
- Hjernen vægt (g) = 0.195
- Serum volumen (ml) = 0,02
- Hjernen permeabilitet indeks (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
Bemærk: Permeabilitet indeksberegningerne udbytte værdier, der er absolut og sammenlignelige mellem eksperimenter og vævstyper. Disse kan dog forelægges som nøgletal for at lette sammenligning mellem 2 grupper 12. Dette kan opnås ved at dividere PI af hvert dyr i begge grupper med det gennemsnitlige PI af kontrolgruppen, kørsel kontrol gruppe betyder gennem 1 endnu holde inter animalske variation i kontrolgruppen. Denne transformation indeholder værdier for eksperimenterende gruppe (eller grupper) i forhold til kontrolgruppen indstillet til 1.
- Immunfluorescens visualisering af sporstof
- Skær de nyre/hemi-hjerne blokke indlejret indbygget i væv-tek sammensatte (O.C.T) (trin 2.1) i 10 µm sektioner på en kryostaten indstillet til-20 ° C og overføre sektionerne til dias placeres ved stuetemperatur. Når afsnittene er tørret (ca. 30 min), skal du overføre slides til-80 ° C fryser indtil brug.
- På dagen for farvning, tø dias ved 37 ° C i 10 min og derefter rette afsnittene med 4% paraformaladehyde (PFA) i 10 min ved stuetemperatur efterfulgt af hurtig vask i PBS.
- Inkuber sektioner i permeabilization/blokerende buffer lavet af steril PBS indeholdende 1% BSA og 0,5% Triton X-100 pH 7,5 i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber dias i 1,5 timer ved stuetemperatur med CD31 primære antistof (0,5 mg/ml, klon MEC 13.3), fortyndet i 1: 100 i bufferen indeholder steril PBS, 0,5% BSA, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2) efterfulgt af tre 5 min vasker i PBS.
- Udføre sekundær antistof inkubation i ovenstående bufferen i 1 time ved stuetemperatur med artsspecifik fluorescently mærket antistoffer fortyndet 1: 500 (2 mg/mL). For CD31, kan ged anti-rotte Alexa 568 eller Alexa 488 bruges i en fortynding på 1: 500. Omfatter DAPI (300 µM) i den sekundære antistof mix (1:1, 000 fortynding fra lager) for at plette for kerner.
- Montere de farvede sektioner med aqua polymount og lad det natten over for polymerisering ved stuetemperatur i mørke.
- Erhverve billeder ved hjælp af en spektral imaging Konfokal laser scanning mikroskop system. Analysere billeder af NIS elementer software (version 4.3). Software som Photoshop kan bruges til generering af montage tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har for nylig vist, at angiopoietin-2 (Ang-2) gevinst af funktion (GOF) mus har højere hjernen vaskulær permeabilitet end kontrol mus i sunde betingelser10. I streg-induceret mus var det også viser at GOF mus havde større infarkt størrelse og større permeabilitet end kontrol littermates. Disse resultater viser en kritisk rolle i Ang-2 i permeabilitet på BBB. Protokollen derfor udnyttet GOF mus og sammenlignet dem for at styre littermates for at beskrive i vivo permeabilitet assay. Men denne metode kan anvendes på enhver sygdom model, transgene musemodel eller narkotika behandlinger, der ændrer BBB permeabilitet, som vi gjorde tidligere 10,11,12,13.
En kort omsætning tid (15 min) for permeabilitet analyse er foreslået, som længere omsætning gange vil føre til en større clearance fra det vaskulære rum, som er blevet observeret også i tidligere undersøgelser16. Clearance af 3 kD FITC-dextran på 2 h ()figur 2 C, D) er meget større end på 15 min ()figur 2 A, B) i nyre samt hjernevæv. I hjernen er der meget lidt ekstravaskulære tracer på grund af intakt blod - hjerne barrieren i disse voksne WT mus (Fig. B, D). Anvende denne metode, blev tracer permeabilitet i Ang-2 GOF med WT littermates sammenlignet. Resultaterne præsenteres i en tabelformat (tabel 1) angive højere tracer ophobning i hjernen af GOF mus i forhold til WT mus. Nyre fluorescens ændres dog ikke mellem disse grupper. Immunfluorescens billeder bekræfte stigning i ekstravaskulære tracer i GOF mus ()figur 3 B, D) i forhold til WT mus ()figur 3 A, C) hvor sporstof er begrænset til vaskulære rum.
Figur 1. Skematisk af arbejdsgangen for den i vivo permeabilitet analyse ved hjælp af fluorescerende sporstoffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Tracer clearance på korte og lange omsætning gange. For at etablere tracer omsætning tid for permeabilitet assay, gangen kort omsætning af 15 min (A, B) var i forhold til gangen omløb af 2 h (C, D) post tracer injektion. Længere omsætning tidspunktet for 2 h førte til meget lave mængder af tracer ophobning i nyre (C) hvor de basale permeabilitet er høj sammenlignet med en kort 15 min omsætning tid (A) potentielt på grund af en meget stor frihøjde af FITC dextran-3 kD (grøn kanalen) fra det vaskulære rum. Denne effekt var endnu mere dramatisk i hjernen kendetegnet ved stramme blod - hjerne barrieren (B, D). CD31 farvning (røde kanal) bekræftet tilstedeværelsen af fartøjer i det pågældende område. Repræsentative billeder fra et enkelt dyr ud af 2 vildtype voksen CD1 musene injiceret med sporstof for hvert tidspunkt og dyr blev ofret uden perfusing dem for at visualisere det intravaskulære tracer. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Immunfluorescens farvning for røbestoffer til at vurdere ændringer i hjernen permeabilitet i GOF mus. Øget permeabilitet af 3 kD TMR-dextran tracer (i rødt) kan visualiseres i Ang-2 GOF mus (B, D) i forhold til WT littermates (A, C) i regionen cortex. I WT dyr er sporstof begrænset til fartøjer (A, C) mens ekstravaskulære tracer kan observeres i GOF mus (hvide pile i B, D). Farvning for CD31 (i blåt) i de flettede billeder bekræfter (A-D) tilstedeværelsen af fartøjer. Figuren viser repræsentative billeder fra 2 WT og 2 GOF musene injiceret med røbestoffer i.p og ofret 15 min post injektion med perfusion. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Animal ID | Hjernen vægt (g) | Nyre vægt (g) | Serum volumen (mL) | Serum RFU | Nyre RFU | Hjernen RFU | Perm. Indeks (10 ^-3 ml/g) | |
| Nyre | Hjernen | |||||||
| GOF 1 | 0.195 | 0,252 | 0.02 | 38305 | 31051 | 154 | 64,4 | 0.352 |
| GOF 2 | 0.177 | 0.249 | 0.02 | 42001 | 31411 | 126 | 60 | 0.278 |
| WT 1 | 0,167 | 0.301 | 0.02 | 40904 | 31591 | 64 | 51.2 | 0.122 |
| WT 2 | 0.146 | 0,294 | 0.02 | 39502 | 31768 | 70 | 54,8 | 0.164 |
| FINGERET | 0,155 | 0,27 | 0.02 | 27 | 36 | 22,5 | NA | NA |
Tabel 1. Væv permeabilitet beregninger. Permeabilitet indeks beregninger for Ang-2 gevinst af funktion (GOF) og vildtype littermates (WT) mus klart vise større (omkring 2-fold) hjernen permeabilitet i GOF mus i forhold til WT mus. Nyre permeabilitet er dog i samme interval mellem de 2 grupper. Basal nyre permeabilitet er meget større i forhold til hjernen som forventet på grund af fenestrated endotel i nyrerne, der ikke udgør en stram barriere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blod - hjerne barrieren dysfunktion er forbundet med en række neurologiske lidelser, herunder primære og sekundære hjernesvulster eller slagtilfælde. BBB opdeling er ofte forbundet med livstruende CNS ødem. Udredning af de molekylære mekanismer, der udløser åbning eller lukning af BBB er derfor af terapeutisk betydning i neurologiske og almindeligt undersøgt af forskere. Dog metoder til at undersøge BBB permeabilitet i vivo rapporteret i litteraturen, er ofte forbundet med tekniske vanskeligheder, der afhænger af kedelig og subjektive kvantificering af fluorescens billeder17,18 , 19. Desuden, nogle af metoderne, der omfatter hele hjernen fluorescens imaging, der er vildledende som det mere betegnende for permeabilitet af overfladiske hjernen fartøjer, der ikke udgør en stram barriere. Selv når kvantificering har udført baseret på objektive hjernen væv absorbans (fx evans blå permeabilitet vurdering) dyrene er ofte ikke perfunderet fører til fejlagtige fortolkning på grund af betydelig blod brøkdel. Hjernen vægt er en anden variabel, der ofte ikke er inkluderet i permeabilitet beregninger, men skal være ødem som følge af vaskulær permeabilitet kan øge vægten og ændre den netto permeabilitet. Desuden, sex og dyr at dyr hjernen vægt variationer kan cloud permeabilitet forskelle. Radioaktive sporstoffer såsom 14C saccharose og [3 H] inulin har været anvendt med succes til hjernen permeabilitet indeks men gør ikke pristilbud den brede vifte af størrelse og afgift baseret permeabilitet undersøgelse som med fluorescently mærket røbestoffer20.
Af ovennævnte grunde, vi har vedtaget en metode, der er enkelt, objektiv og kvantitativ i estimeringen af blod - hjerne barrieren permeabilitet i vivo i mus ved hjælp af fluorescently mærket røbestoffer. Dextrans er hydrofile polysaccharider karakteriseret ved deres moderat til høj molekylvægt (3-200 kD) og kan fås som ladede eller tomt molekyler baseret på konjugeret fluorophore. Endotel stramme kryds dannet af primært claudins (1, 3, 5 og 12) og occludin, sammen bestemme paracellular størrelse og opkræve selektivitet af tillægget pore rester til stede på deres første ekstracellulære loop (gennemgik i21). Permeabilitet over blod - hjerne barrieren i vivo er også afhængig af glycocalyx og basal lamina, to strukturer, der er til stede på begge sider af BBB22,23. Luminally nuværende glycocalyx er en gel som struktur dannet af negativt ladede oligosaccharider (heparin sulfater), der også fungerer som en barriere for blodbårne makromolekyler såsom albumin. Ændringer i glycocalyx tykkelse og sammensætning er også forbundet med vaskulær permeabilitet ændringer, så vi observeret i angiopoietin-2 gevinst på funktion mus sammenlignet med vildtype mus10. Basalmembranen er på den anden side til stede på abluminal siden i endothelial celler bestående af både den vaskulære basalmembranen lavet af endothelceller og pericytes, mens parenkymalt basalmembranen eller astrocytic basalmembranen lavet af astrocytter. Disse kælderen membraner er også negativt ladede og dermed også har kapacitet til at tjene som afgift barrierer. I denne henseende tilbyder konjugeret dextrans undersøgelse af både størrelse og gebyr-baserede permeabilitet. For eksempel TMR-dextran 3 kD er anioniske, mens TXR-dextran 3 kD er neutral, der kombinerer en af disse røbestoffer med et konjugeret høj molekylvægt dextran såsom FITC dextran 70 kD i den samme blanding sprøjtet til mus, man kunne vurdere de størrelse-baserede permeabilitet. Vi yderligere drage fordel af lysin-fixable arten af fluorescerende-mærket dextrans til at udforske de regionale forskelle i permeabilitet i standard immunofluorescens farvning. Dextrans også generelt udviser lav immunogenicitet og dermed tjener som gode røbestoffer. Lucifer gul, cadaverine, fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC), er blandt andre sporstoffer, der er i området lavmolekylære (0,4-0,8 kD) og er fixable.
I vores metode, røbestoffer blev injiceret af i.p rute efterfulgt af perfusing mus og opnåelse af fluorescens af hjernen homogeniseret normaliseret til våd vægt og serum fluorescens. Dette er en simpel men meget kvantitative og objektive metode, da der er ingen markering af afsnit/billeder som kvantificering af immunofluorecence metode, der bruges klassisk. Vi anvender kun én hemi-hjerne for permeabilitet analysen og udnytte de andre hemibrain for immunofluorescens farvning ved at analysere sagittal sektioner giver regionale forskelle i de samme dyr. Brugen af hver hemi-hjernen til forskellige samtidige målinger er en af de vigtigste fordele i vores protokol. Permeabilitet af andre organer som nyrer, leveren, etc. fungerer også, som en god intern kontrol som basal permeabilitet er høj i disse organer. For at sammenligne 2 grupper, man skal først trække sham dyret, (som ikke modtog tracer injektion) autofluorescence fra alle dyr i både grupper og alle væv typer (nyre, hjerne og serum) for hver tracer og derefter gå videre til normaliseret beregninger sammenligner de 2 grupper. Permeabilitet indeks (PI) er præsenteret, der opnås som et forhold af væv til serum fluorescens normaliseret til væv vægt og serum volumen. Vores beregninger give absolut værdi for tracer permeabilitet, der kan sammenlignes mellem eksperimenter og vævstyper. Disse værdier dog kan let udtrykkes som nøgletal eller procent mellem de 2 grupper, der sammenlignes, som vi også tidligere har gjort det12. Dette kan opnås ved at dividere PI af hvert dyr i begge grupper med det gennemsnitlige PI for alle dyrene i kontrolgruppen. Dette ville drive kontrolgruppen PI gennem 1 endnu holde fejl mellem dyr og for den eksperimentelle gruppe give værdier, der er gennemsnittet kontrol gruppe af 1.
Injektion af røbestoffer af i.p er lettere, men flere omkostninger intensive sammenlignet med i.v indsprøjtning, da mængden af tracer skal øges. Vores data (ikke vist) i denne henseende viser, at næsten 2-fold højere beløb i tracer er påkrævet ved i.p injektion sammenlignet med i.v at få lignende serum fluorescens værdier. Tidspunktet for omsætning er også højere i i.p rute i forhold til i.v på grund af den tid, det tager for tracer absorptionen i blodet. I denne henseende serum fluorescens værdier på 15 min post i.p injektion var sammenlignelig med 5 min post i.v injektion for røbestoffer i lav- og mellemindkomster Molekylær vægt intervallet mellem 0,4-4 kD (data ikke vist). Vi foreslår en kort omsætning tid, fordi paracellular permeabilitet er lineært og hvis betydelige væv Fluorescens er fundne post perfusion efter en kort omsætning tid (15 min), det allerede angiver en permeabilitet fænotype, som vi har rapporteret i vores tidligere publikationer10,12,13,14. Men på samme tid kunne man få serum fluorescens for normalisering. På længere omsætning gange er væv clearance betydelige, som reducerer serum fluorescens betydeligt og dermed kunne påvirke permeabilitet værdier normaliseret til serum. Mens tidspunktet for omsætning i forhold til den størrelse/afgift af tracer skal optimeres for hvert scenario, foreslår vi en kort omsætning tid som udgangspunkt. Dette gælder også for højere molekylvægt opløste stoffer såsom plasma IgGs og fibrinogen (150-400 kD) Hvis permeabilitet kendetegn er i modsætning til inert dextran røbestoffer på grund af deres meget store størrelse og specifik interaktion med cellulære receptorer som Fc receptorer, der ændrer deres halveringstid24. Dextrans på den anden side har ikke nogen specifikke transportsystem i endothelial level25 og som hjernen endotelceller ikke undergår pinocytosis til et betydeligt omfang skyldes meget lave niveauer af plasmalemma vesikel forbundet protein (PLVAP)26 , den vigtigste transport af dextrans er paracellular. Vi har anvendt ovenstående metode med held i flere scenarier som permeabilitet i Transgene mus i forhold til vildtype littermates og også vurderet permeabilitet ændringer i vildtype mus efter terapeutisk intervention10, 12 , 13 , 14. i Resumé, kombineret med immunofluorescens-farvning, permeabilitet analysen beskrevet her er en simpel og en robust metode til at vurdere permeabilitet af mus i vivo , kan også anvendes på andre små dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Sphingonet consortium finansieret af instituttets Leduq til støtte for dette arbejde. Dette arbejde blev også støttet af Collaborative Research Center "vaskulære differentiering og remodellering" (CRC / Transregio23, projekt C1) og af 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc program GO-IN, No. 291776 finansiering. Vi anerkender desuden Kathleen Sommer for hendes teknisk bistand med mus, håndtering og genotypebestemmelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
- Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
- Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
- Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
- Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
- Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
- Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
- Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E.
- Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
- Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
- Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
- Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
- Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).
