Summary
여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.
Abstract
혈액-뇌 장벽 (BBB) 두뇌 microenvironment 독 소 및 순환에 있는 병원 체에서 보호 하 고 두뇌 항상성 유지 하는 특수 방 벽 이다. 방 벽의 주요 사이트는 그 장벽 기능 꽉 세포 접합 및 원형질 막에 경과 전송기에서 결과 뇌 모세 혈관의 내 피 세포. 이 함수는 pericytes와 함께 혈관 단위 (NVU)를 형성 하는 이다 통제 된다. Alzheimer의 질병 (광고), 등 여러 신경 질환 뇌종양 장애인된 BBB 기능으로 연결 됩니다. BBB 침투성의 평가 중요 한 신경 질환의 심각도 및 고용 치료 전략의 성공에 따라서.
우리는 현재 여기 간단한 아직 강력한 침투성 분석 결과 여러 가지 마우스에 성공적으로 적용 된 둘 다, 유전과 실험 모델. 방법은 매우 양적이 고 일반적으로 적용 되는 현미경에 의해 추적 형광 분석에 비해 객관적입니다. 이 방법에서는, 마우스는 쥐 마비 뒤 수성 불활성 형광 추적기의 믹스와 함께 intraperitoneally 주입 수 있습니다. 동물의 심장 관류 뇌, 신장 또는 다른 장기 수확 전에 수행 됩니다. 장기 무 균 및 centrifuged는 상쾌한에서 형광 측정에 의해 따라. 혈액 관류의 바로 전에 심장 펑크에서 그려진 혈관 칸막이를 정규화 목적을 위해 제공 합니다. 조직 형광은 양적를 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 추적 침투성 색인. 추가 확인, contralateral hemi 두뇌 immunohistochemistry 보존 추적 형광 시각화 용도로 활용할 수 있습니다.
Introduction
Microvascular 내 피 세포 (ECs)는 ensheathed 기저 lamina에, 밀접 하 게 관련 된 pericytes (Pc), 및 지하실 막의 끝 발1 봉투 이다 (ACs)에서 지 원하는 이루어져 혈액-뇌 장벽 (BBB) ,2. 여러 셀 형식을 지원 하 고 규제 장벽 기능을 주로 ACs 및 Pc, 상호 작용 하는 ECs 그리고 또한 신경 및 microglia, 모두는 함께 형성 neurovascular 단위 (NVU). NVU는 BBB는 혈액을 매개로 독 소 및 두뇌에 들어가기에서 병원 체의 전송 제한 기능에 대 한 중요 합니다. 이 함수는 ECs 사이 p-당단백질 (P-gp) 그 경과 분자 endothelium 입력으로 다시 같은 전송기의 작용으로 인해 claudin-5, occludin, zonula occludens-1, 꽉-접합 분자의 결과 선박 루멘1,2,3. 그러나 BBB는 영양분 (포도 당, 철, 아미노산) 등 필수 분자의 수송에 대 한 특정 전송기 EC 플라즈마 막1,,23에 의해 수 있습니다. EC 레이어 luminal (혈액 연결)와 abluminal (뇌 연결 막) 대 한 구체적이 고 vectorial 전송 기능4,5 수 있도록 다양 한 전송기의 분포에 관하여 매우 편광은 . BBB 단단히 CNS 환경 규제에 대해 보호 하는 동안, CNS 약물 전달 기능 BBB와 파 킨 슨 등 질환에 대 한 주요 도전 이다. BBB 장애와 신경 질환에도 장벽 부전 손상 Alzheimer의 질병 (광고)에서 예를 들어 특정 전송 대상에 포함 될 수 있습니다 때문에 특히 두뇌 약물 전달 증가 추측 될 수 없다. 광고에서 LRP1, 분노, P-gp 등 여러 가지 아 밀 로이드 베타 전송기 dysregulated 것으로 알려져 있습니다 하 고 쓸데6,,78수 있습니다 따라서 이러한 전송기를 대상으로 합니다. BBB는 획, 광고, 수 막 염, 다 발성 경화 증 및 뇌 종양9,,1011등 여러 신경 질환에 손상 이다. 장벽 기능 복원 치료 전략의 중요 한 부분 이며 따라서 그 평가 중요 한.
이 작품에서는, 우리는 설명 된 객관적이 고 침투성 분석 결과 우리가 성공적으로 적용할 여러 마우스 라인 모두 실험과 유전자 변형 질환 모델10,12,13 설치류에 대 한 양적 프로토콜 ,14. 방법은 혈관 칸막이 추적기를 제거 뒤에 쥐의 관류 형광 추적기의 간단한 복 주사를 기반으로 합니다. 뇌 및 기타 장기 수집된 게시물 관류 및 침투성 객관적인 평가 절대 침투성 인덱스 플레이트 리더에서 조직 homogenates의 형광 측정에 따라 있습니다. 모든 원시 형광 값 조직 homogenates 또는 어떤 추적 프로그램에는 영향을 받지 않는 가짜 동물에서 혈 청을 사용 하 여 배경색을 수정할 수 있습니다. 충분 한 정규화 세럼 볼륨, 혈 청 형광, 및 조직, 따라서 저조한 침투성 인덱스를 완전 하 고 실험 및 조직 유형 사이 비교의 무게에 대 한 포함 되어 있습니다. 그룹 사이 비교의 용이성, 절대 침투성 인덱스 값 수 쉽게 변형 될 비율을 우리12이전 수행 했다. 동시에, 저장 된 hemi-두뇌와 신장 수 활용할 수 추적 프로그램 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법10. 고전적인 형광 현미경 검사 법 이기는 하지만 조직 단면도 및 반 정량 분석에 대 한 이미지의 주관적인 선택으로 인해 성가신 침투성에 지역 차이 얻기에 중요 한 될 수 있습니다. 자세한 단계는 프로토콜에서 제공 됩니다 그리고 적절 한 노트 추가 됩니다. 이 성공적으로 다른 작은 동물을 확장할 수 있는 쥐에서 vivo에서 침투성 시험을 수행 하기 위한 필요한 정보를 제공 합니다. 분석 결과 추적기의 많은 종류에 적용 될 수 있습니다 추적기와 독특한 형광 스펙트럼의 조합에 의해 침투성 평가 기반으로 책임과 크기에 대 한 허용.
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Protocol
모든 동물은 절차 동안 통증이 나 불편을 최소화 하는 최대 관심을가지고 처리 합니다. 이 절차 우리 기관의 동물 보호 지침을 다음과 같이 하 고 지역 위원회 (Regierungspraesidium 다름슈타트, 승인 번호 FK/1044)에 의해 승인 되었습니다.
침투성 시험 쥐에서 vivo에서 에 대 한 작업 단계의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 각 단계의 자세한 내용은 아래 설명 되어 있습니다.
1입니다. 동물 처리
-
준비 및 추적기 및 마 취약의 관리
- 침투성 시험 전날 이상 포함 하는 조직에 대 한 레이블된 튜브와 금형을 준비 합니다. 깨끗 한 증기 두건에서 작업 하 고 80% 에탄올으로 청소 하는 도구를 사용 하 여 프로토콜을 통해 무 균 상태를 유지 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 3-6 개월의 성숙한 성인 연령 집단에 있는 남성 또는 여성 야생-타입 (WT) 또는 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) CD1 마우스를 사용 합니다. 앞에서 설명한 10쥐의 유전형을 수행 합니다.
참고: 80% 알코올 살 균 계기 초래 하지 것입니다 있지만 준비 샘플의 오염을 최소화 됩니다. - 2mm 주식으로 메 마른 PBS에 모든 추적기를 희석 하 고-20 ° c.에 빛에서 보호 하는 aliquots를 저장
- (Tetramethyl Rhodamine) TMR 같은 추적기를 선택 하 고 (fluorescein isothiocyanate) 고유 여기/방출 스펙트럼과는 FITC는 리 형광 현미경 검사 법에 의해 모두 염료 간의 최소한의 간섭 결과로 고칠 수 (는 TMR을 사용 하 여 또는 FITC 각각 필터)와 fluorometry 침투성 분석 결과 대 한 플레이트 리더에 의해.
참고: TMR dextran 3 kD FITC dextran 3 kD는 연구에 사용 된 두 리 고칠 수 및 따라서 사용 될 수 있는 또한 알데하이드와 immunohistochemical 분석 후 고정 지역 차이 조사 하기 위하여. - 최대한 주의 기관 관리 지침에 따라 모든 동물을 처리 합니다. 추가 추적 프로그램 1:1 믹스10,13의 각 추적기의 100 µ L를 사용 하 여 결합 될 때 200 µ L까지 증가 될 수 있다 100 µ L 추적 솔루션으로 intraperitoneally 각 마우스를 주사. 혼자 autofluorescence 배경 빼기에 대 한 가짜 제어 역할을 추적기 대신 PBS를 가진 하나 이상의 동물을 주입.
- 추적 프로그램 삽입 후 5 분 anesthetize i.p 주사 마 취 제 및 Xylazine를 가진 동물 (100 mg과 5-10 밀리 그램 0.9%에서 염 분 당 킬로그램 몸 무게 각각, 150 µ L 당 25 g 마우스 칵테일의).
참고: 수 의사 연 고는 적용 되지 눈에 절차 동안 동물 마 취과 관류/희생 사이 기간 이었다 짧은 (10 분) 관찰 되지 있던 모든 눈의 건조.
- 침투성 시험 전날 이상 포함 하는 조직에 대 한 레이블된 튜브와 금형을 준비 합니다. 깨끗 한 증기 두건에서 작업 하 고 80% 에탄올으로 청소 하는 도구를 사용 하 여 프로토콜을 통해 무 균 상태를 유지 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 3-6 개월의 성숙한 성인 연령 집단에 있는 남성 또는 여성 야생-타입 (WT) 또는 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) CD1 마우스를 사용 합니다. 앞에서 설명한 10쥐의 유전형을 수행 합니다.
-
혈액 수집 및 심장 관류
- 동물 마 취 관리 후 심장 관류 10 분에 대 한 준비. 동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다 수 있도록 발 트 위치 응답의 부재를 확인 합니다.
- 그들의 뒤에는 동물을 80% 에탄올 복 부의 피부에 적용. 바로 흉 곽 아래에 작은 절 개 (2 cm)와 복 벽을 열어 작은 위를 사용 하 여. 횡 경 막에서 간 고 천천히 횡 격 막 흉 막 캐비티 15노출 극복 합니다.
- 양측 흉 곽을 잘라 고 왼쪽된 심 실 노출 하려면 컷된 흉 골을 해결. 좌 심 실의 뒷부분에 연동 관류 시스템에 연결 된 21-게이지 나비 바늘을 삽입 합니다.
- 오른쪽 아 트리 움 펑크와 신속 하 게 (10 s) 혈 청 컬렉션 튜브에 혈액 1 mL 피 펫 팁 (최종 마감)를 사용 하 여 흉 강에 발표의 200-300 µ L를 수집 하 고 얼음에 저장.
참고:이 관류 절차는 비 생존. - 즉시 혈액 수집 관류 시스템 (10-12 rpm, 5 mL/min)에 전환 하 고 따뜻한 (RT) 1 x PBS로 3 분에 대 한 동물을 perfuse (Ca의 무료2 +Mg2 + 이온).
참고: PBS 포함 캘리포니아2 +/Mg2 + 이온 활용할 수 있습니다 더 나은 심장 활동에는 관류 동안. PBS 관류에 대 한 사용의 총 금액은 15 ~ 20 mL의 범위입니다. - 간, 색상을 지적 함으로써 관류 품질 평가 신장 관류 후 화이트/창백을 표시.
참고: 신장 또는 간 관류 반드시 나타내지 않습니다 뇌 관류로 동맥 (경 동맥/척추) 도달 뇌 대동맥에서 특히 심 방 찔린 중 3 단계에서 준비 하는 동안 파열 얻을 수 있습니다.
2. 조직 처리
- 장기 수집 및 저장
- 관류의 끝에, 자 궁 경부 전위 및 수확 뇌와 신장에 의해 동물의 죽음을 확인 합니다. 관류 품질은 좋은 동물 침투성 분석에서 제외 되므로 뇌 관류 (meninges의 혈관에서 보이는 혈액), 머리의 색깔에 의해 확인 합니다. 메스 (그림 1)를 사용 하 여 2 hemibrains로 두뇌를 구분 합니다.
- 후 엽과 소 뇌의 무료 메스 한 hemibrain와 dissect 그리고 2 mL 튜브에는 hemicerebrum를 전송. 소 뇌 침투성 평가에 필요한 경우 추가 튜브에 헤 미-소 뇌를 저장 합니다.
- 다른 2 mL 튜브에 단일 신장 전송. 드라이 아이스에 샘플을 즉시 저장 합니다.
- 기본적으로 나머지 신장과 hemi-뇌 (소 뇌와 후 엽으로 구성 된)에 포함 조직-테크 최적의 절삭 온도 (O.C.T) 드라이 아이스에 화합물.
- 결국, 원심 10, 000g, 4 ° c.에서 10 분에 혈 청 컬렉션 튜브에 얼음에 저장 된 혈액 샘플 1.5 mL 튜브에 혈 청 supernatants 전송 및 드라이 아이스 컨테이너에 넣어.
- 추가 처리까지-80 ° C 냉장고를 드라이 아이스에 수집 된 모든 샘플을 전송 합니다.
참고: 그것은 녹고 동결로 후 균질 효율성 증가로 균질 단계를 진행 하기 전에 샘플을 동결 하는 것이 중요입니다.
- 균질 및 원심 분리
- Hemi-뇌와 신장 샘플 다운-80 ° C에서 냉동 얼음에 thaw와 장기를 포함 하는 튜브를 무게. 이러한 무게에서 조직 무게를 여러 빈 관 (약 20)의 평균 값을 뺍니다. 추가 300 µ L 및 감기 1의 200 µ L 신장과 hemi-뇌, 각각 포함 된 튜브에 X PBS.
참고: (헤 미-소 뇌, 100 mg 아래) 같은 조직의 낮은 금액에 대 한 개별 튜브의 무게는 것이 좋습니다. - 소계 (PTFE) 유 봉 약 15 스트로크를 수행 하 여 전기 오버 헤드 교 반기 (1, 000 rpm)에 연결 된과 원래 eppendorf 관에서 각 샘플을 균질 (1 스트로크 = 1 및 1 다운). 샘플 사이 PBS 가진 유 봉 헹 구 고 닦아 다음 예제를 진행 하기 전에 건조.
참고: 균질 동안 세제의 사용 했다 fluorometry 잠재적인 간섭으로 인해 피할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜에 세포내 추적 감지 또한 조직을 철저 하 게 균질 한 라운드의 동결 해 동 후는 더 효율적으로. - 빛과 15000 g, 20 분, 탁상 원심 분리기에 4 ° C의 끝에 모두 함께 원심 분리기에서 보호 하는 얼음에 무 균된 샘플을 저장 합니다. 즉각적인 fluorometry 또는 나중에 분석할 수-80 ° C에서 얼음에 새로운 1.5 mL 튜브 supernatants 전송.
- Hemi-뇌와 신장 샘플 다운-80 ° C에서 냉동 얼음에 thaw와 장기를 포함 하는 튜브를 무게. 이러한 무게에서 조직 무게를 여러 빈 관 (약 20)의 평균 값을 뺍니다. 추가 300 µ L 및 감기 1의 200 µ L 신장과 hemi-뇌, 각각 포함 된 튜브에 X PBS.
- 형광 측정 및 정량화
- 이전 단계의 끝에 동결 조직 상쾌한 및 혈 청 샘플은 호 일 빛에서 그들을 보호 하는-80 ˚C에 저장 된 얼음에 녹여.
- 384 잘 검정 잉크 판으로 희석된 혈 청 (30 µ L 1 x PBS + 20 µ L 세럼) 또는 (있는 그대로) 조직 supernatants의 50 µ L 플라스틱. 이 조직 homogenate 배경 일반적으로 희석제로 사용 하는 PBS의 이상으로 혈 청 및 조직의 supernatants 적절 한 배경 빼기를 보장 하기 위한 가짜 동물에서 적어도 하나의 샘플을 포함 합니다.
참고: 3 가짜 동물의 평균 비록 가짜 autofluorescence 값 (데이터 표시 되지 않음)에 아주 작은 변화 관찰 되었다 autofluorescence에 대 한 사용할 수 있습니다. PBS, 또한 뇌 샘플 같은 낮은 형광 샘플에 대 한 신호 대 잡음 비 증가 수와 그것을 diluting 하 여 혈 청 사용의 금액을 줄일 수 있습니다. 최대 10 µ L 세럼 40 µ L PBS와 그것을 diluting 테스트를 했다. 아니 거품 우물에 있는지 확인 합니다. - 384 잘 블랙 플레이트 플레이트 판독기에 삽입 하 고 형광 측정을 선택 하는 새로운 스크립트를 엽니다.
- 최적 이득을 설정 하 고 각각 TMR 또는 FITC dyee에 대 한 550/580 또는 490/520 여기/방출 (nm) 값을 사용 하 고 원시 형광 단위 (RFUs)를 측정 시작.
- 플레이트 리더에서 원시 형광 단위 (RFUs)를 사용 하 여 해당 하는 가짜 값을 뺀 후 침투성 색인 (PI) 계산.
- * 침투성 인덱스 (mL/g) = (조직 RFUs/g 조직 중량) / (혈 청 RFUs/mL 혈 청)
- 예제 계산 뇌 침투성 색인 (PI)에 대 한 동물 GOF1의 (표 1).
- GOF1 RFUs-가짜 뇌 RFUs 뇌 = 154-22.5 131.5 =
- GOF1 혈 청 RFUs-가짜 혈 청 RFUs 38305-27 = = 38278
- 뇌의 무게 (g) = 0.195
- 혈 청 볼륨 (ml) = 0.02
- 뇌의 침투성 인덱스 (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
참고: 침투성 인덱스 계산 항복 값을 절대 및 실험 및 조직 유형 사이 비교. 그러나 이들은 2 그룹 12사이 비교의 용이성에 대 한 비율으로 제시 될 수 있습니다. 이 두 그룹에 각 동물의 PI 1 아직 유지 간 동물 변형 제어 그룹에서 통해 컨트롤 그룹 평균 운전 제어 그룹의 평균 PI와 함께 나누어 얻을 수 있습니다. 이 변화는 1로 설정 하는 컨트롤 그룹을 기준으로 실험 그룹 (또는 그룹)에 대 한 값을 제공 합니다.
- 추적의 면역 형광 시각화
- 10 µ m는 cryostat에 섹션-20 ° C로 설정 하 고 실내 온도 슬라이드 섹션을 전송으로 조직-테크 화합물 (O.C.T) (2.1 단계)에 기본적으로 포함 된 신장/hemi-두뇌 블록을 잘라. 섹션은 일단 말리 면 (약 30 분), 전송 슬라이드-80 ° C 냉동 고 사용까지.
- 얼룩이 지기의 날, 10 분 동안 37 ° C에서 슬라이드를 해 동 하 고 PBS에서 빠른 세척 뒤 실 온에서 10 분 동안 4 %paraformaladehyde (PFA)와 섹션을 수정.
- Permeabilization/차단 버퍼 1 %BSA 및 0.5% 트라이 톤 X-100 pH 7.5 실 온에서 1 h 포함 된 살 균 PBS의에서 섹션을 품 어.
- CD31 1 차 항 체로 상 온에서 1.5 h에 대 한 슬라이드를 품 어 (0.5 mg/ml, 멕 13.3 복제), 트라이 톤 X-100 (pH 7.2) PBS에 3 5 분 세척 뒤 살 균 PBS, 0.5% BSA 0.25%를 포함 하는 버퍼에 1: 100에 희석.
- 수행 이차 항 체 외피 종의 함께 실 온에서 1 h 대 위의 버퍼 붙일 항 체 희석된 1: 500 (2 mg/mL)를 표시 합니다. CD31에 대 한 염소 반대로 쥐 알 렉 사 568 또는 알 렉 사 488 1: 500의 희석에 사용할 수 있습니다. DAPI를 포함 (300 μ M) 이차 항 체는 핵에 대 한 얼룩 (1:1, 000 희석 주식에서) 혼합.
- 아쿠아 polymount와 스테인드 섹션을 탑재 하 고 어둠 속에서 실 온에서 중 합에 대 한 그것을 떠나 하룻밤.
- 스펙트럼 영상 confocal 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. NIS 요소 소프트웨어 (버전 4.3)에 의해 이미지를 분석 합니다. 몽타주 그림의 생성을 위해 포토샵과 같은 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
우리는 최근에 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) 마우스 건강 조건10제어 마우스 보다 더 높은 두뇌 혈관 침투성을가지고 나타났습니다. 뇌졸중 유발 쥐에서 그것은 또한 쇼 프 쥐 했다 더 큰 경색 크기와 제어 littermates 보다 큰 침투성. 이러한 결과 BBB에 침투성에 중앙 2의 중요 한 역할을 보여 줍니다. 따라서 프로토콜 GOF 마우스를 활용 하 고 비보에 침투성 분석 결과 설명 하기 위해 littermates를 제어 하는 그들을 비교. 그러나,이 방법은 어떤 질병 모델, 유전자 변형 마우스 모델에 적용 될 수 있다 또는 우리가 했던 이전 10,11,,1213BBB 침투성을 변경 하는 치료 약물.
침투성 분석에 대 한 짧은 순환 시간 (15 분)은 제안으로 긴 순환 시간 큰 클리어런스 또한 이전 연구16에 관찰 되었습니다 혈관 구획에서 이어질 것입니다. 3의 클리어런스 kD 2 h (그림 2 FITC dextran C, D) (그림 2 15 분 보다 훨씬 더 A, B) 뇌 조직에서 뿐만 아니라 신장에서. 뇌에서는 이러한 성인 WT 쥐 (그림 B, D)에 그대로 혈액-뇌 장벽으로 인해 아주 작은 extravascular 추적 프로그램입니다. 이 방법을 적용, WT littermates과 중앙 2 GOF에서 추적 침투성 비교 되었다. 테이블 형식 (표 1)에 제시 결과 WT 쥐에 비해 GOF 쥐의 두뇌에서 높은 추적 축적을 나타냅니다. 그러나, 신장 형광이이 그룹 사이 되지 변경 됩니다. 면역 형광 이미지 확인 GOF 마우스 (그림 3 에 extravascular 추적 증가 B, D) WT 마우스 (그림 3 에 비해 A, C) 추적 프로그램 혈관 구획에 제한 됩니다.
그림 1. 비보에 침투성 분석 결과 형광 추적기를 사용 하 여에 대 한 워크플로의 회로도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 짧고 긴 순환 시간에서 추적 정리. 침투성 분석 결과, 15 분의 짧은 순환 시간에 대 한 추적 프로그램 순환 시간을 설정 하기 위해 (A, B)는 2 h (C, D) 게시물 추적 프로그램 삽입의 긴 순환 시간 비교 되었다. 2 h의 더 긴 순환 시간 FITC dextran-3 kD (녹색의 매우 높은 정리 때문에 잠재적으로 짧은 15 분 순환 시간 (A) 에 비해 신장 (C) 기저 침투성이 높은 추적 축적의 매우 낮은 금액을 주도 채널) 혈관 구획에서. 이 효과 꽉 혈액-뇌 장벽 (B, D)에 의해 특징 두뇌에 더욱 극적인 했다. CD31 얼룩 (빨강 채널) 관심 영역에서 혈관의 존재를 확인 했다. 2 야생-타입 성인 CD1 쥐 각 시간 포인트와 동물에 대 한 추적 프로그램 주입에서 단일 동물에서 대표 이미지는 혈관 내 추적 프로그램을 시각화 하는 그들을 perfusing 없이 희생 되었다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 면역 형광 검사 GOF 쥐에서 뇌 침투성 변화를 평가 하는 추적기에 대 한 얼룩. 3의 침투성을 증가 kD TMR dextran 추적 프로그램 (빨간색)으로 중앙 2 GOF 쥐 (B, D) (A, C)는 피 질 영역에서 WT littermates에 비해 구상 될 수 있다. WT 동물 추적 프로그램 extravascular 추적 프 쥐 ( B, D에흰색 화살표)에서 관찰 될 수 있다 반면 혈관 (A, C)에 제한 됩니다. CD31 (블루)에 대 한 병합 된 이미지에 얼룩이 (A-D) 혈관의 존재를 확인 합니다. 그림 2에서 대표 이미지 WT 2 GOF 쥐 추적기 i.p 주사 하 고 15 분 포스트 주입 관류와 희생입니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 동물 ID | 두뇌 무게 (g) | 신장 중량 (g) | 혈 청 볼륨 (mL) | 세럼 RFU | 신장 RFU | 두뇌 RFU | 펌 인덱스 (10 ^-3 ml/g) | |
| 신장 | 뇌 | |||||||
| GOF 1 | 0.195 | 0.252 | 0.02 | 38305 | 31051 | 154 | 64.4 | 0.352 |
| GOF 2 | 0.177 | 0.249 | 0.02 | 42001 | 31411 | 126 | 60 | 0.278 |
| 무게 1 | 0.167 | 0.301 | 0.02 | 40904 | 31591 | 64 | 51.2 | 0.122 |
| WT 2 | 0.146 | 0.294 | 0.02 | 39502 | 31768 | 70 | 54.8 | 0.164 |
| 가짜 | 0.155 | 0.27 | 0.02 | 27 | 36 | 22.5 | NA | NA |
표 1입니다. 조직 침투성 계산. 침투성 인덱스 계산 중앙 2 이득-의-(GOF) 기능과 야생-타입 littermates (WT) 쥐에 대 한 명확 하 게 보여 더 큰 (약 2-fold) GOF 쥐 WT 쥐에 비해 침투성 두뇌. 그러나 신장 침투성은 2 그룹 간에 동일한 범위에. 기저 신장 침투성은 훨씬 더 단단한 방 벽을 형성 하지 않는다 신장에서 fenestrated endothelium 인해 예상 대로 뇌에 비해.
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Discussion
혈액-뇌 장벽 부전 기본 및 보조 뇌종양 이나 뇌졸중 등 신경 성 질환의 숫자와 연결 됩니다. BBB 붕괴는 종종 CNS 부 종 생명이 연결 됩니다. 트리거 오프닝 분자 메커니즘의 해명 또는 BBB의 폐쇄는 그러므로 신경 장애 그리고 일반적으로 치료 의미의 조사 연구자에 의해 있다. 그러나, 조사 하는 방법을 문학에서 보고 된 BBB 침투성에서 vivo에서 수시로 연관 된다 형광 이미지17,18 의 지루하고 주관적인 정량화에 의존 하는 기술적인 어려움 , 19. 또한, 방법의 일부 포함 뇌 형광 이미징으로 더 단단한 방 벽을 형성 하지 않는다 표면 뇌 혈관의 침투성을 나타내는 그릇입니다. 동물은 종종 중요 한 피 분수 인해 잘못 된 해석으로 이어지는 끼얹는다는 객관적인 뇌 조직 흡 광도 (예: 에반스 블루 침투성 평가)에 따라도 때 정량화 수행 되었습니다. 뇌 무게는 침투성 계산에 포함 되지 자주 하지만 혈관 침투성에서 발생 하는 부 종 수 무게를 증가 하 고 net 침투성을 변경할 필요가 다른 변수입니다. 또한, 섹스와 동물-동물 두뇌 무게 변이 침투성 차이 클라우드 수 있습니다. 14C 자당 등 [3h] 눌린 방사성 트레이 서 두뇌 침투성 인덱스 성공적으로 적용 된 하지만 다양 한 크기와 충전 붙일 레이블된 추적기20으로 침투성 조사를 기반으로 제공 하지 않습니다.
위의 이유로, 우리는 간단 하 고 객관적인 혈액-뇌 장벽 침투성에서 비보에 붙일 레이블된 추적기를 사용 하 여 마우스에 추정에 양적 방법을 채택 했다. Dextrans 그들의 보통 높은 분자량 (kD 3-200)에 의해 특징 친수성 다 당 류 이며 충전 또는 충전 분자 활용된 fluorophore를 기반으로 얻을 수 있습니다. 내 피 꽉 접합 주로 claudins (1, 3, 5, 12)에 의해 형성 하 고 occludin, 함께 paracellular 크기 결정 공 잔류물 (21에서검토) 그들의 첫 번째 extracellular 루프에는 충전에 의해 선택도 충전. 혈액-뇌 장벽에서 비보에 걸쳐 침투성은 또한 glycocalyx와 기저 lamina BBB22,23의 양쪽에 있는 두 개의 구조에 의존 합니다. Luminally 현재 glycocalyx은 알 부 민 등 혈액을 매개로 고분자를 장벽 역할도 부정 청구 oligosaccharides (헤 파 린 황산 염)에 의해 형성 된 구조 처럼 젤. 우리는 야생 타입 마우스10에 비해 기능 마우스의 angiopoietin 2 이득에 관찰 glycocalyx 두께 또는 구성 변화 혈관 침투성 변화에 연관 있습니다. 지하실 막 두 혈관 지하실 멤브레인 parenchymal 지하실 막 또는 astrocytic 지하실 막 만든 반면 내 피 세포와 pericytes에 의해 만들어진 구성 된 내 피 세포의 abluminal 측에 존재는 다른 한편으로 의해 이다. 지하실 막이 또한 부정적으로 위탁 하 고 따라서 또한 충전 방 벽으로 봉사 하는 능력을가지고. 이와 관련, 활용된 dextrans 크기와 충전 기반 침투성의 조사를 제공합니다. 예를 들어 TMR-dextran 3 kD는 음이온 TXR-dextran 3 kD는 중립, 활용된 높은 결합 한 이러한 추적기 FITC dextran 70 같은 분자량 dextran 동일한 혼합에 kD 쥐에 주입, 하나 크기 기반 침투성 평가할 수 있습니다. 우리 더 형광 표시 된 dextrans 탐험 표준 면역 형광 염색에 침투성에 있는 지역 다름의 lysine 고칠 수 자연의 활용. Dextrans는 또한 일반적으로 낮은 immunogenicity를 전시 하 고 따라서 좋은 추적기 역할. 루시퍼 노란색, cadaverine, fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC)는 낮은 분자량 범위에 있는 다른 추적기 (0.4-0.8 kD)와 고칠 수 있다.
우리의 방법에는 추적기 i.p 경로 뒤에 쥐를 perfusing에 의해 주입 했다 하 고 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 뇌 homogenates의 형광을 취득 합니다. 이것은 간단한 아직은 매우 정량적 객관적인 방법을 선택 영역이 없는 섹션/이미지에서 고아 하 게 사용 되는 immunofluorecence 메서드에 의해 정량화의. 우리 침투성 분석 결과 대 한 하나의 hemi-두뇌 활용를 면역 형광 분석 화살 섹션 같은 동물에 지역 차이 제공 하 여 얼룩에 대 한 다른 hemibrain. 고유한 동시 측정을 위한 각 반의 두뇌를 사용 하 여 우리의 프로토콜의 주요 장점 중 하나입니다. 또한, 신장, 간 등 다른 장기의 침투성 좋은 내부 제어 기저 침투성은 이러한 기관에서 높은 역할. 2 그룹을 비교 하기 위해 가짜 동물 (그 추적 프로그램 주입 받지 않았다)를 먼저 할 것 모두 그룹에 모든 동물 및 모든 조직에서 autofluorescence 유형 (신장, 뇌, 그리고 혈 청) 각 추적에 대 한과 다음에 정규화 진행 2 그룹을 비교 하는 계산. 침투성 색인 (PI) 얻은 것입니다 조직 조직 무게와 혈 청 볼륨을 정규화 하는 혈 청 형광의 비율로 표시 됩니다. 우리의 계산 실험 및 조직 유형 사이 비교 될 수 있는 추적 프로그램 침투성에 대 한 절대 값을 산출 한다. 그러나 이러한 값, 수 있다 쉽게 표현 될 비율 또는 %2 그룹으로 우리는 또한 이전12비교 되. 이 컨트롤 그룹에 있는 모든 동물의 평균 PI와 두 그룹에서 각 동물의 파이 나누어 얻을 수 있습니다. 이 1의 제어 그룹 평균을 기준으로 값을 주고 동물 사이 및 실험적인 그룹에 대 한 오류를 유지 아직 1 통해 컨트롤 그룹 PI를 드라이브 것입니다.
I.p 여 추적기의 주입은 쉽게, 하지만 더 많은 비용 집중에 비해 i.v 주입, 추적의 양을 증가 시킬 필요가. 이 점에서 우리의 데이터 (표시 되지 않음) 나타냅니다 추적기에 거의 2-fold 높은 금액 i.p 주입 테타에 비해 형광 값 유사한 혈 청을 얻을 하는 데 필요한. 또한, 순환의 시간 i.p 경로 추적 혈 류로 흡수에 대 한 촬영 시간이 테타에 비해 높은 수준 이다. 이와 관련, 15 분 게시물 i.p 주입에 혈 청 형광 값은 0.4-4 사이의 낮은 중간 분자량 범위에서 추적기에 대 일 분 게시물 i.v 주입에 비해 kD (데이터 표시 되지 않음). Paracellular 침투성 선형 이며 상당한 조직 형광 검출된 게시물 관류 짧은 순환 시간 (15 분) 후, 그것은 이미 이면 침투성 형 우리가에서 보고 있다 때문에 우리는 짧은 순환 시간 제안 우리의 이전 간행물10,12,,1314. 동시에 아직 한 정규화에 대 한 혈 청 형광을 얻을 수 있습니다. 긴 순환 시간, 조직 정리에 상당한는 혈 청 형광을 상당히 감소 하 고 따라서 혈 청으로 정규화 침투성 값에 영향을 수도 있습니다. 추적 프로그램의 크기/충전에 관하여 순환의 시간 각 시나리오에 대 한 최적화 하는, 시작 지점으로 짧은 순환 시간을 것이 좋습니다. 이 플라즈마 같은 높은 분자량 용액에도 적용 됩니다 IgGs 및 fibrinogen (150-400 kD) 누구의 침투성 특성은 그들의 매우 큰 크기 및 Fc 같은 세포 수용 체와의 특정 상호 작용 때문에 불활성 dextran 추적기와 달리 그들의 하프 라이프24변경 수용 체입니다. Dextrans 다른 한편으로 어떤 특정 교통 시스템 내 피 레벨25 에 고 단백질 (PLVAP)26 plasmalemma 기의 낮은 수준에 관련 된 뇌 내 피 세포로 인해 상당한 수준 pinocytosis 매우 받아야 하지 할로 , dextrans의 수송의 주요 경로 paracellular. 우리와 같은 유전자 변형 쥐에 침투성 야생-타입 littermates에 비해 치료 개입10, 후 야생 타입 마우스에 침투성 변화 평가 성공적으로 여러 시나리오에서 위의 방법을 적용합니다 12 , 13 , 14. 요약 하자면, 면역 형광 얼룩과 결합 하 여, 여기에 설명 된 침투성 분석 결과 이며 간단한 마우스에서 생체 내에 다른 작은 동물에도 적용 될 수 있는의 침투성을 평가 하는 강력한 방법.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 Sphingonet 컨소시엄이이 작업을 지원 하기 위한 Leduq 기초에 의해 투자를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 또한 "혈관 차별화 및 리 모델링" 공동 연구 센터에 의해 지원 되었다 (CRC / Transregio23, 프로젝트 C1)와 7. FP, COFUND, 괴테 국제 Postdoc 프로그램 이동-IN, No. 291776 자금. 우리 더 처리 및 유전형 캐슬 린 서머를 한 쥐와 그녀의 기술 지원에 대 한 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
- Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
- Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
- Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
- Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
- Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
- Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
- Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E.
- Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
- Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
- Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
- Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
- Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).
