Summary
Här presenterar vi en mus hjärnan vaskulär permeabilitet analysen använder intraperitoneal injektion av fluorescerande spårämnen följt av perfusion som är tillämplig på djurmodeller av blod - hjärnbarriären dysfunktion. En hemi-hjärnan används för att bedöma permeabilitet kvantitativt och den andra för tracer visualisering/immunfärgning. Proceduren tar 5-6 h för 10 möss.
Abstract
Blod - hjärnbarriären (BBB) är en specialiserad barriär som skyddar den hjärnan mikromiljö från toxiner och patogener i cirkulationen och upprätthåller hjärnan homeostas. De främsta platserna av barriären är endothelial celler i hjärnan kapillärerna vars barriärfunktion resultat från snäva intercellulära junctions och effluxtransportörer uttryckt på plasmamembranet. Denna funktion regleras av pericyter och astrocyter som tillsammans bildar neurovaskulära enheten (NVU). Flera neurologiska sjukdomar som stroke, Alzheimers sjukdom (AD), hjärntumörer är associerade med en nedsatt BBB. Bedömning av BBB permeabiliteten är därför avgörande att bedöma svårighetsgraden av den neurologiska sjukdomen och framgången för de behandlingsstrategier som anställd.
Vi presenterar här en enkel men robust permeabilitet analysmetod som har använts framgångsrikt i flera mus modeller både genetiska och experimentella. Metoden är starkt kvantitativ och objektiv i jämförelse med tracer fluorescens analysen av mikroskopi som vanligen tillämpas. I denna metod injiceras möss intraperitonealt med en blandning av vattenhaltigt inert fluorescerande spårämnen följt av anesthetizing möss. Hjärt perfusion av djuren utförs före skörd hjärna, njurar eller andra organ. Organ är homogeniserad och centrifugeras följt av fluorescens mätning från supernatanten. Blod dras från hjärt punkteringen strax före perfusion serverar för normalisering ändamål vaskulära facket för. Den vävnad fluorescensen är normaliserad till våt vikt och serum fluorescensen att få en kvantitativ tracer permeabilitet index. För ytterligare bekräftelse, kan kontralaterala hemi-hjärnan bevaras för immunhistokemi utnyttjas för tracer fluorescens visualisering ändamål.
Introduction
På blod - hjärnbarriären (BBB) består av mikrovaskulära endotelceller (ECs) stöds av intimt förknippade pericyter (PCs), som är ensheathed i den basala lamina, och astrocyter (ACs) som omsluter basalmembranet med slutet-fötterna1 ,2. ECs interagera med flera celltyper som stöder och reglerar barriärfunktionen, primärt ACs och datorer, och även nervceller och mikroglia, varav alla bildar tillsammans den neurovaskulära enheten (NVU). NVU är avgörande för funktionen av BBB, vilket begränsar transport av blodburna toxiner och patogener från att komma in i hjärnan. Denna funktion är ett resultat av åtsittande-föreningspunkt molekyler såsom claudin-5, occludin, zonula occludens-1, som finns mellan ECs och även på grund av verkan av transportörer som p-glykoprotein (P-gp) som efflux molekyler som anger endotelet tillbaka in det fartyg lumen1,2,3. BBB tillåter emellertid för transport av viktiga molekyler såsom näring (glukos, järn, aminosyror) genom specifika transportörer uttryckt på EG plasma membran1,2,3. Det EG-lagret är mycket polariserad med avseende på fördelningen av de olika transportörerna mellan luminala (blod-vända) och abluminal (hjärnan söderläge membran) att tillåta för specifika och vectorial transport funktion4,5 . BBB är skyddande avseende tätt reglerar den CNS-miljön, är det en stor utmaning för CNS drogen leverans i sjukdomar såsom Parkinson med en funktionell BBB. Även i neurologiska sjukdomar med BBB dysfunktion, kan det inte antas att hjärnan drogen leverans ökar särskilt som barriär dysfunktion skulle kunna omfatta skador på de specifika transportör mål till exempel som i Alzheimers sjukdom (AD). I AD, flera beta-amyloid transportörer såsom LRP1, RAGE, P-gp är kända för att vara dysreglerad och därmed inriktning dessa transportörer kan vara fruktlöst6,7,8. BBB är nedsatt i flera neurologiska sjukdomar såsom stroke, AD, meningit, multipel-skleros, och hjärnan tumörer9,10,11. Återställer barriärfunktionen är en avgörande del av den terapeutiska strategin och således sin bedömning är kritisk.
I detta arbete, har vi beskrivit en objektiv och kvantitativ protokoll för permeabilitet assay hos gnagare att vi framgångsrikt tillämpas på flera mus linjer både transgen och experimentell sjukdom modeller10,12,13 ,14. Metoden bygger på en enkel intraperitoneal injektion av fluorescerande spårämnen följt av perfusion av mössen ta bort spårämnen från vaskulära facket. Hjärnan och andra organ är insamlade post perfusion och permeabilitet bedömas av ett objektivt och absolut permeabilitet index baserat på fluorescens mätningar av vävnad homogenates i en spektrofotometer. Alla råa fluorescens värden korrigeras för bakgrunden med vävnad homogenates eller serum från sham djur som inte får någon tracer. Gott om normalizations ingår för serum volym, serum fluorescens och vikten av vävnaderna, vilket således ger permeabilitet index som är absolut och jämförbara mellan experiment och vävnadstyper. För att underlätta jämförelse mellan grupper, kan de absoluta permeabilitet indexvärdena lätt omvandlas till nyckeltal som vi hade utfört tidigare12. Samtidigt skulle lagrade hemi-hjärnor och njure kunna utnyttjas för tracer visualisering av fluorescence mikroskopi10. Den klassiska fluorescensmikroskopi kunde vara värdefullt att få regional skillnad i permeabilitet än besvärligt på grund av subjektiva urval av vävnadssnitt och bilder för en semikvantitativ analys. De detaljerade anvisningarna presenteras i protokoll och anteckningar läggs vid behov. Detta ger nödvändig information för att framgångsrikt utföra permeabilitet analysen i vivo i möss som kan skalas till andra små djur. Analysen kan användas för många typer av spårämnen möjliggör kostnaden och storleken baserat permeabilitet bedömning av en kombination av spårämnen med distinkta fluorescens spectra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur har hanterats med största försiktighet minimerar smärta eller obehag under förfarandet. Detta förfarande följer riktlinjerna för djurens vård av vår institution och har godkänts av den lokala kommittén (Regierungspraesidium Darmstadt, godkännandenummer FK/1044).
En schematisk av arbete steg för i vivo permeabilitet test på möss visas i figur 1. Detaljerna i varje steg beskrivs nedan.
1. djurhantering
-
Beredning och administrering av spårämnen och anestetika
- Förbereda märkta rör och formar för vävnad inbäddning minst en dag innan permeabilitet analysen. Upprätthålla sterila förhållanden i hela protokollet genom arbetar under ren spiskåpa och använda verktyg rengörs med 80% etanol. Använda manliga eller kvinnliga vildtyp (WT) eller angiopoietin-2 (Ang-2) gain-of-function (GOF) CD1 möss i mogen vuxen ålder 3-6 månader för det nuvarande protokollet. Utföra genotypning av möss som beskrivs tidigare 10.
Obs: 80% alkohol resulterar inte i sterila instrument men kommer att minimera kontaminering av proverna beredd. - Späd ut alla spårämnen i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning till 2 mM lager och lagra de alikvoter skyddas från ljus vid-20 ° C.
- Välja spårämnen såsom (tetrametyl rodamin) TMR och (fluoresceinisothiocyanat) FITC med distinkta excitation/utsläpp spectra och som är lysin fastställbara vilket resulterar i minimal interferens mellan färgämnena, båda av fluorescensmikroskopi (använder TMR eller FITC filtrera respektive) och av fluorometry i en spektrofotometer för permeabilitet analysen.
Obs: TMR dextran 3 kD och FITC dextran 3 kD som används i studien är både lysin fastställbara och därmed kunde också användas för immunhistokemisk analys efter fixering med aldehyder för att undersöka regionala skillnader. - Hantera alla djur med största omsorg efter riktlinjerna som institutionsvård. Injiceras intraperitonealt varje mus med 100 µL tracer lösning som kan ökas upp till 200 µL när en ytterligare tracer kombineras med 100 µL av varje spårämne i en 1:1 blandning10,13. Injicera minst ett djur med PBS ensam i stället för de spårämnen som simulerad kontroll för autofluorescens bakgrund subtraktion.
- 5 min efter tracer injektion, söva djuret med en IP injektion av ketamin och xylazin (100 mg och 5-10 mg i 0,9% saltlösning per kg kropp vikt respektive 150 µL av cocktailen per 25 g mus).
Obs: Vet salva inte tillämpades på ögon under förfarandet som perioden mellan djur anestesi och perfusion/offer var kort (10 minuter) där varje torkning av ögonen inte observerades.
- Förbereda märkta rör och formar för vävnad inbäddning minst en dag innan permeabilitet analysen. Upprätthålla sterila förhållanden i hela protokollet genom arbetar under ren spiskåpa och använda verktyg rengörs med 80% etanol. Använda manliga eller kvinnliga vildtyp (WT) eller angiopoietin-2 (Ang-2) gain-of-function (GOF) CD1 möss i mogen vuxen ålder 3-6 månader för det nuvarande protokollet. Utföra genotypning av möss som beskrivs tidigare 10.
-
Blod insamling och hjärt perfusion
- Förbereda djuren för hjärt perfusion 10 min efter narkos administrering. Kontrollera frånvaron av tass twitch svar för att säkerställa att djuret nått ett kirurgiskt plan av anestesi.
- Låg djuren på ryggen och applicera 80% etanol på huden på buken. Öppna med liten sax upp bukväggen med ett litet snitt (2 cm) precis under revbenen. Separata levern från membranet och sedan långsamt skära igenom membranet utsätta de Plura Jonsson 15.
- Skär revbenen bilateralt och fixa skär bröstbenet för att exponera den vänstra ventrikeln. Infoga en 21-gauge fjärilsnål anslutet till peristaltiska perfusion system i den bakre delen av vänster kammare.
- Punktera höger förmak och snabbt (inom 10 s) samla in 200-300 µL av blood släppt in i bröstkorghålet med 1 mL pipettspetsar (med slutet cut-off) i serum samling rör och lagra det på is.
Obs: Proceduren perfusion är icke-överlevnad. - Så fort blodet samlas in, slå på perfusion systemet (10-12 rpm, 5 mL/min) och BEGJUTA djuret för 3 min med varma (RT) 1 x PBS (gratis för Ca2 +/Mg2 + joner).
Obs: PBS som innehåller Ca2 +/Mg2 + joner kan utnyttjas för bättre hjärtats aktivitet under perfusionen. Den totala mängden PBS används för perfusion är i intervallet 15-20 mL. - Bedöma perfusion kvalitet genom att notera färgen på levern, njurarna, som visas vit/blek efter perfusion.
Obs: Njur- eller leversjukdom perfusion nödvändigtvis tyder inte hjärnan perfusion som artärer (carotid/vertebrala) nå hjärnan från aorta kan få spruckit under förberedelsen i steg 3 särskilt under förmaksflimmer punkteringen.
2. vävnad behandling
- Orgel insamling och lagring
- I slutet av perfusionen, bekräfta djuret av cervikal dislokation och skörden hjärnan och njurarna. Verifiera hjärnan perfusion av färgen på hjärnan (ingen synlig blod i fartyg av hjärnhinnorna), för att utestänga djuren från permeabilitet analys när perfusion kvalitet inte är bra. Separera hjärnan i 2 hemibrains med en skalpell (figur 1).
- Dissekera med en skalpell en hemibrain fri från luktsinnet lober och lillhjärnan och överför hemicerebrum till en 2-mL tub. Lagra hemi-lillhjärnan i en extra tub om krävs för cerebellär permeabilitet bedömning.
- Överföra en enda njure till en annan 2-mL tub. Lagra proverna omedelbart på torris.
- Bädda in inföding de kvarvarande njure och hemi-hjärnan (bestående av lillhjärnan och luktsinnet lober) i vävnad-tek optimal skärtemperatur (O.C.T) sammansatta på torris.
- I slutändan, Centrifugera blodproverna förvaras på is i serum samling rör vid 10, 000 g, 10 min vid 4 ° C. Överföra serum supernatanterna 1,5 mL rör och placera dem i behållaren torris.
- Överföra alla prover som samlats in på torris till-80 ° C frys tills vidare bearbetning.
Obs: Det är viktigt att frysa proverna innan du fortsätter till homogenisering stegen som homogenisering effektiviteten ökar efter som frysa upptining.
- Homogenisering och centrifugering
- Tina på is hemi-storhjärnan och njure proverna frysas ner vid-80 ° C och väga rören som innehåller organ. Från dessa vikter, subtrahera medelvärdet av flera tomma rören (ca 20) att få vävnad vikten. Tillsätt 300 µL och 200 µL kallt 1 X PBS till rören som innehåller njure och hemi-storhjärnan, respektive.
Obs: för lägre mängder av vävnad (som hemi-lillhjärnan, under 100 mg) väger enskilda rören rekommenderas. - Homogenisera varje prov i den ursprungliga eppendorf-rör med en mortelstöt för polytetrafluoreten (PTFE) som bifogas en elektrisk overhead omrörare (1, 000 rpm) genom att utföra cirka 15 linjer (1 stroke = 1 upp och 1 down). Skölj mortelstöten med PBS mellan prover och torka torrt innan du fortsätter till nästa provet.
Obs: Användningen av rengöringsmedel under homogenisering undveks på grund av risken för störningar hos fluorometry. Dock upptäcks också intracellulära tracer i detta protokoll som vävnaden är grundligt homogeniserad, vilket är effektivare efter en omgång av frysa upptining. - Lagra de homogeniserade proverna på is skyddas från ljus och centrifugera alla tillsammans i slutet på 15.000 g, 20 min, 4 ° C i en bordsskiva centrifug. Överföra supernatanterna till en nya 1,5 mL rör på is för omedelbar fluorometry eller vid-80 ° C ska analyseras senare.
- Tina på is hemi-storhjärnan och njure proverna frysas ner vid-80 ° C och väga rören som innehåller organ. Från dessa vikter, subtrahera medelvärdet av flera tomma rören (ca 20) att få vävnad vikten. Tillsätt 300 µL och 200 µL kallt 1 X PBS till rören som innehåller njure och hemi-storhjärnan, respektive.
- Fluorescens mätning och kvantifiering
- Om fryst i slutet av det föregående steget, Tina på is supernatanten och serum vävnadsproverna lagras vid-80 ˚C skydda dem från ljus med folien.
- Överför med pipett 50 µL utspädda serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) eller vävnad supernatanterna (som är) till en 384-väl svart plåt. Inkludera minst ett prov från sham djur för serum och vävnad supernatanterna att säkerställa korrekt bakgrund subtraktion, som denna vävnad Homogenatet bakgrund är normalt högre än för PBS används som spädningsvätska.
Obs: I genomsnitt 3 sham djur kan användas för autofluorescens även en mycket liten variabilitet i sham autofluorescens värden (inga data anges) observerades. Mängden serum används kan minskas genom att späda den med PBS, vilket också kan öka signal-brusförhållandet för prover med låga fluorescens såsom hjärnan proverna. Upp till 10 µL serum testades att späda den med 40 µL PBS. Kontrollera att inga bubblor finns i brunnarna. - Infoga den 384-väl svarta plåten i plattan läsaren och öppna ett nytt manus att välja fluorescens mätning.
- Ställa in förstärkningen till optimal och Använd excitation/utsläpp (nm) värden för 550/580 eller 490/520 för TMR eller FITC dyee respektive och påbörja mätningen för att få rå fluorescens enheterna (RFUs).
- Använd raw fluorescens enheterna (RFUs) från plattan läsaren för att beräkna permeabilitet index (PI) efter avdrag motsvarande sham värden.
- * Permeabilitet Index (mL/g) = (Vävnad RFUs/g vävnad vikt) / (Serum RFUs/mL serum)
- Räkneexempel för hjärnan permeabilitet index (PI) djurets GOF1 (tabell 1):
- GOF1 hjärnan RFUs - SHAM hjärnan RFUs = 154-22,5 = 131,5
- GOF1 serum RFUs - SHAM serum RFUs = 38305-27 = 38278
- Hjärnans vikt (g) = 0.195
- Serum volym (ml) = 0,02
- Brain permeabilitet Index (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0,352
Obs: Permeabilitet indexberäkningarna ge värden som är absoluta och jämförbara mellan experiment och vävnadstyper. Dessa kan emellertid presenteras som nyckeltal för att underlätta jämförelse mellan 2 grupper 12. Detta kan uppnås genom att dividera PI varje djurs i båda grupperna med de genomsnittliga PI kontrollgrupp, kör kontroll gruppen medelvärdet genom 1 hålla ännu inter djura variationen i kontrollgruppen. Den här omvandlingen ger värden för experimentella gruppen (eller grupper) i förhållande till kontrollgruppen anges till 1.
- Immunofluorescens visualisering av tracer
- Skär njure/hemi-hjärnan blocken inbäddade inbyggt i vävnad-tek förening (O.C.T) (steg 2.1) till 10 µm sektioner på en kryostat ställa till-20 ° C och överföra avsnitten bilder placeras i rumstemperatur. När avsnitten är torkat (ca 30 min), överföra bilder till-80 ° C frys fram till användning.
- På dagen för färgning, Tina bilderna vid 37 ° C i 10 min och sedan fixa avsnitten med 4% paraformaladehyde (PFA) under 10 minuter vid rumstemperatur följt av snabb tvätt i PBS.
- Inkubera i avsnitt i permeabilisering/blockering buffert av sterila PBS med 1% BSA och 0,5% Triton x-100 pH 7.5 för 1 h i rumstemperatur.
- Odling av objektglas för 1,5 h i rumstemperatur med CD31 primär antikropp (0,5 mg/ml, klona MEC 13.3), utspädd i 1: 100 i buffert som innehåller steril PBS, 0,5% BSA, 0,25% Triton x-100 (pH 7,2) följt av tre 5 min tvättar i PBS.
- Utföra sekundär antikropp inkubation i ovanstående buffert för 1 h i rumstemperatur med artspecifika fluorescently märkt antikroppar utspädd 1: 500 (2 mg/mL). För CD31, kan get anti råtta Alexa 568 eller Alexa 488 användas vid en spädningsgrad av 1: 500. Inkluderar DAPI (300 µM) i den sekundära antikroppen blanda (1:1, 000 utspädning från lager) för att färga för atomkärnor.
- Montera de färgade sektioner med aqua polymount och lämna den över natten för polymerisation i rumstemperatur i mörkret.
- Hämta bilder med en spectral imaging confocal laserscanning Mikroskop system. Analysera bilder av NIS element software (version 4.3). Programvara som Photoshop kan användas för generering av montage siffror.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har nyligen visat att angiopoietin-2 (Ang-2) gain-of-function (GOF) möss har högre hjärnan vaskulär permeabilitet än kontroll möss i sunda förhållanden10. I stroke-inducerad möss var det också visar att GOF mössen hade större infarkt storlekar och större permeabilitet än de kontroll littermates. Dessa resultat visar en avgörande roll för Ang-2 i permeabilitet på BBB. Protokollet därför utnyttjas GOF möss och jämfört dem för att styra littermates för att beskriva permeabilitet i vivo analysen. Men denna metod kan tillämpas på någon sjukdom modell, transgen musmodell eller läkemedel behandlingar som förändrar BBB permeabilitet som vi gjorde tidigare 10,11,12,13.
En kort omsättning tid (15 min) för permeabiliteten analys föreslås, som längre omsättning gånger kommer att leda till en högre clearance från vaskulära facket, som också har observerats i tidigare studier16. Clearance av 3 kD FITC-dextran på 2 h ()figur 2 C, D) är mycket större än på 15 min ()figur 2 A, B) i njurarna samt som i hjärnvävnaden. I hjärnan finns det mycket lite extravaskulär tracer på grund av intakt blod - hjärnbarriären i dessa vuxna WT möss (Figur B, D). Tillämpa denna metod, jämfördes tracer permeabiliteten i Ang-2 GOF med WT littermates. Resultaten presenteras i ett tabellformat (tabell 1) indikerar högre tracer ackumulering i hjärnan av GOF möss jämfört med WT möss. Njure fluorescensen ändras dock inte mellan dessa grupper. Immunofluorescens bilder bekräfta ökningen av extravaskulära spårämne i GOF möss ()figur 3 B, D) jämfört med WT möss ()figur 3 A, C) där spårämne är begränsad till vaskulära facket.
Figur 1. Schematisk bild av arbetsflödet för i vivo permeabilitet analysen använder fluorescerande spårämnen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tracer clearance vid korta och långa cirkulationen gånger. För att fastställa tracer omsättning tiden för permeabilitet analysen, en kort omsättning tid 15 min jämfördes (A, B) med en lång omsättning tidpunkten för 2 h (C, D) post tracer injektion. Längre omsättning tidpunkten för 2 h ledde till mycket låga mängder tracer ackumulering i njurarna (C) där basala permeabiliteten är hög jämfört med en kort 15 min omsättning tid (A) potentiellt på grund av en mycket hög clearance av FITC dextran-3 kD (grön kanal) från vaskulära facket. Denna effekt var ännu mer dramatiska i hjärnan präglas av snäva blod - hjärna-barriären (B, D). CD31 färgning (röd kanal) bekräftat förekomsten av fartyg i regionen av intresse. Representativa bilder från ett enskilt djur ur 2 vildtyp vuxna CD1 möss injiceras med spårämne för varje tidpunkt och djur offrades utan startas dem för att visualisera den intravaskulära tracer. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Immunofluorescens färgning för spårämnen att bedöma förändringar i hjärnan permeabilitet i GOF möss. Ökad permeabilitet av 3 kD TMR-dextran tracer (i rött) kan visualiseras i Ang-2 GOF möss (B, D) jämfört med WT littermates (A, C) i regionen cortex. I WT djur är spårämne begränsad till fartyg (A, C) medan extravaskulär tracer kan observeras i GOF möss (vita pilar i B, D). Färgning för CD31 (i blått) i de sammanslagna bilderna bekräftar (A-D) närvaron av fartyg. Figuren visar representativa bilder från 2 WT och 2 GOF möss injiceras med spårämnen IP och offrat 15 min efter injektionen med perfusion. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Djur-ID | Hjärnans vikt (g) | Njure vikt (g) | Serum volym (mL) | Serum RFU | Njure RFU | Hjärnan RFU | Perm. Index (10 ^-3 ml/g) | |
| Njure | Hjärnan | |||||||
| GOF 1 | 0.195 | 0.252 | 0,02 | 38305 | 31051 | 154 | 64,4 | 0,352 |
| GOF 2 | 0.177 | 0.249 | 0,02 | 42001 | 31411 | 126 | 60 | 0,278 |
| WT 1 | 0,167 | 0.301 | 0,02 | 40904 | 31591 | 64 | 51,2 | 0.122 |
| WT 2 | 0.146 | 0.294 | 0,02 | 39502 | 31768 | 70 | 54,8 | 0.164 |
| SHAM | 0.155 | 0,27 | 0,02 | 27 | 36 | 22,5 | NA | NA |
Tabell 1. Vävnaden permeabilitet beräkningar. Permeabilitet index beräkningar för Ang-2 gain-of-function (GOF) och vildtyp littermates (WT) möss visar tydligt större (cirka 2-faldig) hjärnan permeabilitet i GOF möss jämfört med WT möss. Njure permeabiliteten är emellertid i samma intervall mellan de 2 grupperna. Basala njure permeabiliteten är mycket större jämfört med hjärnan som förväntat på grund av fenestrated endotel i njurarna som inte bildar en tät barriär.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blod - hjärnbarriären dysfunktion är associerade med ett antal neurologiska sjukdomar, inklusive primära och sekundära hjärntumörer eller stroke. BHB-nedbrytning förknippas ofta med livshotande CNS ödem. Förtydligandet av de molekylära mekanismer som utlöser öppning eller stängning av BBB därför utreds terapeutisk betydelse i neurologiska sjukdomar och ofta av forskare. Men, metoder för att undersöka BBB permeabilitet i vivo rapporteras i litteraturen, är ofta förknippade med tekniska svårigheter som beror på tråkiga och subjektiva kvantifiering av fluorescens bilder17,18 , 19. Dessutom några av metoderna inkluderar hela hjärnavbildning fluorescens som är vilseledande eftersom det mer vägledande av permeabilitet av ytliga hjärnan fartyg som inte bildar en tät barriär. Även när kvantifiering har utförts utifrån objektiva hjärnans vävnad absorbans (t.ex. evans blå permeabilitet bedömning) djuren är ofta inte perfusion leder till felaktig tolkning på grund av betydande blod bråkdel. Hjärnan väger en annan variabel som ofta inte ingår i permeabilitet beräkningar men behöver vara eftersom ödem som följd av vaskulär permeabilitet kan öka i vikt och förändra netto permeabilitet. Dessutom kan sex och djur-till-djur hjärnans vikt variationer moln permeabilitet skillnader. Radioaktiva spårämnen såsom 14C sackaros och [3 H] inulin har tillämpats framgångsrikt för hjärnan permeabilitet index men göra inte erbjudande det brett utbudet av storlek och kostnad baserat permeabilitet utredning som med fluorescently märkta spårämnen20.
Av ovanstående skäl antog vi en metod som är enkel, objektiv och kvantitativ uppskatta blod - hjärnbarriären permeabilitet i vivo i möss med fluorescently märkta spårämnen. Dextrans är hydrofil polysackarider kännetecknas av deras måttlig till hög molekylvikt (3-200 kD) och kan fås som laddat eller oladdat molekyler baserat på konjugerade fluorophore. Endothelial åtsittande föreningspunkter bildas av främst claudins (1, 3, 5 och 12) och occludin, tillsammans bestämma paracellular storlek och ladda selektivitet genom avgiften pore resthalterna på deras första extracellulära slinga (över21). Permeabilitet över blod - hjärnbarriären i vivo är också beroende av glykokalyx och den basala lamina, två strukturer som finns på vardera sidan av BBB22,23. Luminally nuvarande glykokalyx är en gel som struktur som bildas av negativt laddade oligosackarider (heparin sulfater) som också fungerar som en barriär mot blodburna makromolekyler som albumin. Förändringar i glykokalyx tjocklek eller sammansättning är också associerade med vaskulär permeabilitet förändringar som vi observerat i angiopoietin-2 vinst på funktion möss jämfört med vildtyp möss10. Basalmembranet finns å andra sidan på abluminal sida av endotelceller bestående av både vaskulär basalmembranet gjort av endotelceller och pericyter medan den parenkymal basalmembranet eller astrocytic basalmembranet gjort av astrocyter. Dessa källare membran är också negativt laddade och således har också kapacitet att fungera som kostnad hinder. I detta sammanhang erbjuda konjugerad dextrans utredning av både storlek och kostnad-baserade permeabilitet. TMR-dextran 3 kD är exempelvis anjoniska TXR-dextran 3 kD är neutrala, kombinera en av dessa spårämnen med konjugerade hög molekylvikt dextran såsom FITC dextran 70 kD i samma blandning injiceras till möss, man kunde bedöma storlek-baserade permeabilitet. Vi ytterligare utnyttja lysin-fastställbara beskaffenhet lysrör-märkt dextrans att utforska de regionala skillnaderna i permeabilitet i standard immunofluorescens färgning. Dextrans också i allmänhet uppvisar låg immunogenicitet och därmed fungera som bra spårämnen. Lucifer gul, cadaverine, fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC), är bland andra spårämnen som är i intervallet låg molekylvikt (0,4-0,8 kD) och är fastställbara.
I vår metod, spårämnen injicerades genom IP rutt följt av startas möss och erhålla fluorescensen av hjärnan homogenates normaliserade till våt vikt och serum fluorescensen. Detta är en enkel men ändå mycket kvantitativ och objektiv metod som det finns inget val av sektioner/bilder som i kvantifiering av immunofluorecence metod som klassiskt används. Vi använder endast en hemi-hjärnan för permeabilitet analysen och utnyttja den andra hemibrain för immunofluorescens färgning genom att analysera sagittal avsnitt som erbjuder regionala skillnader i samma djur. Användning av varje hemi-hjärna för olika samtidiga mätningar är en av de främsta fördelarna i våra protokoll. Permeabiliteten i andra organ såsom njurar, lever, etc. fungerar också, som en god intern kontroll som basal permeabiliteten är hög i dessa organ. För att jämföra 2 grupper, man måste först subtrahera sham djuret (som inte fick tracer injektion) autofluorescens från alla djur i både grupper och alla vävnad typer (njure, hjärna och serum) för varje spårämne och fortsätt sedan till normaliserade beräkningar jämföra 2 grupper. Permeabilitet index (PI) presenteras som erhålls som en kvot av vävnad att serum fluorescens normaliserade till vävnad vikt och serum volym. Våra beräkningar ger ett absolut värde för tracer permeabilitet som kan jämföras mellan experiment och vävnadstyper. Dessa värden men kan enkelt uttryckas som nyckeltal eller procent mellan de 2 grupperna jämförs som vi även gjort tidigare12. Detta kan uppnås genom att dividera PI varje djurs i båda grupperna med de genomsnittliga PI av alla djur i kontrollgruppen. Detta skulle driva kontrollgruppen PI genom 1 ändå hålla felet mellan djuren och för den experimentella gruppen ge värden som är av genomsnittet gruppen kontroll av 1.
Injektion av spårämnen av IP är lättare, men intensivare kostnad jämfört med intravenöst injektion, eftersom mängden spårämne behöver ökas. Våra data (visas inte) i detta avseende visar att nästan 2gånger högre belopp i spårämne krävs IP injektion jämfört med intravenöst för att få liknande serum fluorescens-värdena. Tidpunkten för cirkulation är också högre i IP route jämfört med intravenöst på grund av den tid det tar för tracer absorptionen i blodet. I detta avseende serum fluorescens värden på 15 min efter IP injektionen var jämförbara med 5 min efter intravenöst injektionen för spårämnen i intervallet låg och medelhög molekylvikt mellan 0,4-4 kD (inga data anges). Vi föreslår en kort omsättning tid eftersom paracellular permeabilitet är linjär och om betydande vävnad fluorescens är upptäckta post perfusion efter en kort omsättning tid (15 min), det redan indikerar en permeabilitet fenotyp som vi har rapporterat i vår tidigare publikationer10,12,13,14. Men på samma gång kunde man få serum fluorescensen för normalisering. Vid längre omsättning tidpunkter är vävnad clearance betydande, vilket minskar serum fluorescens avsevärt och därmed kan påverka permeabilitet värden normaliserade till serum. Medan tiden för omsättning i förhållande till den storlek/laddningen av spårämnet har ska optimeras för varje scenario, föreslår vi en kort omsättning tid som utgångspunkt. Detta gäller även för högre molekylvikt koncentrationsfördelningen såsom plasma IgG och fibrinogen (150-400 kD) vars permeabilitet egenskaper till skillnad från inert dextran spårämnen på grund av sin extremt stora storlek och särskild interaktion med cellulära receptorer såsom Fc receptorer som ändrar sin halveringstid24. Dextrans å andra sidan har inte någon specifik transportsystem den endothelial nivå25 och som hjärnan endothelial celler inte genomgår pinocytosis till betydande nivåer beror på mycket låga nivåer av plasmalemma vesikler associerade protein (PLVAP)26 , den huvudsakliga rutten av transport av dextrans är paracellular. Vi har tillämpat metoden ovan framgångsrikt i flera scenarier som permeabilitet hos transgena möss jämfört med vildtyp kullsyskon och utvärderade även permeabilitet förändringar i vildtyp möss efter terapeutisk intervention10, 12 , 13 , 14. Sammanfattningsvis kombinerat med immunofluorescens färgningen, permeabilitet analysen beskrivs här är en enkel och en robust metod att bedöma genomträngligheten av möss i vivo som också kan tillämpas på andra små djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Sphingonet konsortium finansierat av stiftelsen Leduq för att stödja detta arbete. Detta arbete fick också stöd av Collaborative Research Center ”vaskulär differentiering och remodeling” (CRC / Transregio23, projektet C1) och av 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc programmet GO-IN, nr 291776 finansiering. Vi bekräftar vidare Kathleen Sommer för hennes tekniskt bistånd med möss hantering och genotypning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
- Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
- Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
- Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
- Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
- Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
- Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
- Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E.
- Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
- Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
- Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
- Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
- Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).
