Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/57038
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

Summary

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

Abstract

מחסום הדם - מוח (BBB) היא מכשול מיוחדים מגן microenvironment למוח את הרעלים ואת פתוגנים במחזור ושומר על הומאוסטזיס המוח. האתרים העיקריים של המכשול הם תאי אנדותל של הנימים במוח שתפקידם המכשול נובעת צמתי המערכת צר, מסועי בזרימת הביע על קרום פלזמה. פונקציה זו מוסדר על ידי pericytes, האסטרוציטים היוצרים יחד את יחידת נוירו-וסקולריים (NVU). מספר מחלות נוירולוגיות כגון שבץ, מחלת אלצהיימר (AD), גידולים במוח קשורים עם תפקוד לקוי BBB. הערכה של החדירות BBB לכן חשוב בהערכת חומרת המחלה הנוירולוגית וההצלחה של אסטרטגיות טיפול המועסקים.

אנו מציגים כאן פשוטה אך assay חדירות חזקות זה הוחלו בהצלחה על העכבר מספר מודלים שניהם, גנטית ו ניסיוני. השיטה היא מאוד כמותי ואובייקטיבי לעומת הניתוח פלורסצנטיות מעקב על ידי מיקרוסקופ שמוחל כלל. בשיטה זו, עכברים מוזרקים intraperitoneally עם שילוב של מימית המשדרים פלורסנט אינרטי ואחריו מאלחש העכברים. זלוף הלב של בעלי החיים מבוצע לפני הקטיף במוח, בכליות או איברים אחרים. האיברים הומוגני, centrifuged ואחריה פלורסצנטיות מדידה תגובת שיקוע. דם מן הלב הניקוב רק לפני זלוף משמש לצורך נורמליזציה כדי תא כלי הדם. קרינה פלואורסצנטית הרקמה הוא מנורמל כדי פלורסצנטיות משקל, סרום רטוב להשיג כמותיים מעקב חדירות אינדקס. לאישור נוסף, contralateral המי-המוח יחסית אימונוהיסטוכימיה יכול להיות מנוצל למטרות הדמיה פלורסצנטיות מעקב.

Introduction

מחסום הדם - מוח (BBB) מורכב microvascular אנדותל התאים (ECs) נתמך על ידי הדוק pericytes (אישיים), אשר ensheathed בתוך הנדן הבזליים, ו האסטרוציטים (ACs) זה לעטוף את קרום המרתף ברגליים הסוף-1 ,2. ECs אינטראקציה עם מספר סוגי תאים תומכים, לווסת את הפונקציה מכשול, בעיקר ACs ומחשבים, גם נוירונים ואת מיקרוגלייה, אשר כולם יחד יוצרים יחידת נוירו-וסקולריים (NVU). NVU היא קריטית עבור הפונקציה של BBB, אשר מגביל את התעבורה של רעלים נישא בדם, פתוגנים מלהיכנס המוח. פונקציה זו היא תוצאה של מולקולות חזק-צומת claudin-5, occludin, zonula occludens-1, אשר נמצאים בין ה-ECs וגם עקב הפעולה של מובילי כגון p-גליקופרוטאין (P-gp) בזרימת את מולקולות מזין את אנדותל בחזרה כלי לומן1,2,3. BBB עם זאת מאפשר עבור הובלה של מולקולות חיוניים כגון חומרים מזינים (גלוקוז, ברזל, חומצות אמינו) על ידי מובילי ספציפיים הביע על2,31,ממברנות פלזמה EC. השכבה EC הוא מקוטב מאוד לגבי חלוקת למעליות שונים בין luminal (דם הפונה) לבין abluminal (המוח הפונה ממברנות) כדי לאפשר וקטורי וספציפית התחבורה פונקציה4,5 . בעוד BBB הוא מגן ביחס בחוזקה המסדיר את חצרו CNS, זה אתגר גדול עבור משלוח סמים CNS מחלות כגון פרקינסון עם BBB פונקציונלי. אפילו במחלות נוירולוגיות עם תפקוד לקוי של BBB, זה לא יכול להניח כי משלוח סמים המוח מוגברת במיוחד בזכות תפקוד המחסום יכול לכלול נזק על מטרות טרנספורטר ספציפי למשל כמו מחלת אלצהיימר (AD). לספירה, מספר שנאים עמילואיד ביתא כגון LRP1, זעם, P-gp ידועים להיות dysregulated, ומכאן מיקוד שנאים אלה עשוי להיות חסר תועלת6,7,8. BBB היא נפגעת מספר מחלות נוירולוגיות כגון שבץ מוחי, לספירה, דלקת קרום המוח,-טרשת נפוצה, ואת המוח גידולים9,10,11. שחזור הפונקציה מכשול הוא חלק חיוני של האסטרטגיה הטיפולית, ובכך בהערכתו הוא קריטי.

בעבודה זאת, שתיארנו אובייקטיבית, הפרוטוקולים כמותית של חדירות assay בחולדות כי אנחנו הוחלו בהצלחה מספר קווים העכבר בשתי מחלות הטרנסגניים וניסויים מודלים10,12,13 ,14. השיטה מבוססת על זריקה בקרום הבטן פשוטה של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף של העכברים כדי להסיר את המשדרים תא כלי הדם. למוח ולאיברים נוספים הם פוסט שנאספו זלוף, חדירות לאומדן אובייקטיבית ואינדקס חדירות מוחלטת על סמך מדידות קרינה פלואורסצנטית של רקמת homogenates ב קורא צלחת. כל הערכים פלורסצנטיות raw מתוקנות על רקע באמצעות רקמות homogenates או סרום מחיות המזויפים שאינם מקבלים כל מעקב. Normalizations בשפע כלולים עבור נפח סרום נסיוב פלורסצנטיות, המשקל של הרקמות, ובכך מניב אינדקס חדירות מוחלטת, השוואה בין סוגי רקמות ניסויים. כדי להקל על ההשוואה בין הקבוצות, ערכי אינדקס חדירות מוחלט יכול בקלות להיהפך ל יחסי כפי שאנחנו ביצע בעבר12. במקביל, מאוחסנות המי-המוח וכליות יכול להיות מנוצל להמחשת נותב על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ10. מיקרוסקופיה זריחה קלאסי יכול להיות יקר בהשגת אזורי השוני חדירות אמנם מסורבלת עקב בחירה סובייקטיבית של מקטעי רקמת ותמונות עבור ניתוח כמותי למחצה. השלבים המפורטים מוצגים בפרוטוקול, הערות נוספות בהתאם לצורך. פעולה זו מספקת את המידע הדרוש לביצוע בהצלחה וזמינותו חדירות ב- vivo בעכברים כי ניתן לשנות אחרים חיות קטנות. הבדיקה ניתן להחיל על סוגים רבים של המשדרים ומאפשר את החיוב ואת הגודל המבוסס על חדירות הערכה ע י שילוב של המשדרים עם פלורסצנטיות ברורים ספקטרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל החיות שטופלו עם ש"צריך מזעור כאב או אי נוחות במהלך ההליך. הליך זה עוקב אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים של מוסדנו, אושרה על ידי הוועדה המקומית (Regierungspraesidium דרמשטט, אישור מספר FK/1044).

תיאור סכמטי של השלבים בעבודה ויוו חדירות assay בעכברים מוצג באיור1. הפרטים של כל שלב שיפורטו להלן.

1. לטיפול בבעלי חיים

  1. הכנה וניהול של המשדרים, הרדמה
    1. להכין תבניות שפופרות שכותרתו רקמות הטבעה לפחות יום לפני וזמינותו חדירות. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל הפרוטוקול על ידי עובד תחת מכסה המנוע נקי fume באמצעות כלים לנקות עם 80% אתנול. השתמש זכר או נקבה פראי-סוג (WT) או angiopoietin-2 (אנג-2) רווח-של-פונקציה CD1 (GOF) עכברים בקבוצת הגיל מבוגר בוגר של 3-6 חודשים עבור פרוטוקול הנוכחי. לבצע genotyping של העכברים כפי שתואר לעיל 10.
      הערה: 80% אלכוהול לא יביא כלי סטרילי אך יצמצם זיהום של הדגימות מוכן.
    2. לדלל את כל המשדרים ב- PBS סטרילי לתוך 2 מ מ מניות ולאחסן את aliquots מוגן מפני אור ב-20 ° C.
    3. לבחור המשדרים כגון (Tetramethyl Rhodamine) TMR, (fluorescein isothiocyanate) FITC עם עירור ברורים/פליטת ספקטרום וכי הן ליזין שניתן לתקן וכתוצאה להפרעה מזערית בין צבעים הן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (באמצעות את TMR או FITC לסנן בהתאמה) על ידי fluorometry ב קורא צלחת עבור וזמינותו חדירות.
      הערה: TMR לתוספי 3 kD, FITC לתוספי 3 kD השתמשו במחקר הם שני ליזין ניתן לתיקון, ומכאן יכול גם לשמש עבור קיבוע שאחרי ניתוח immunohistochemical עם aldehydes על מנת לחקור הבדלים אזוריים.
    4. להתמודד עם כל החיות עם ש"צריך לבצע את ההנחיות לטיפול מוסדי. מזריקים intraperitoneally העכבר כל 100 פתרון מעקב µL אשר ניתן להגדיל עד 200 µL כאשר מעקב נוספים משולב באמצעות µL 100 של מעקב כל10,1:1 לערבב13. מזריקים חיה אחת לפחות PBS לבד במקום המשדרים כדי לשמש המזויפים למזגן autofluorescence רקע חיסור.
    5. 5 דקות לאחר ההזרקה tracer, עזים ומתנגד החיה עם זריקה מקומות של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (100 מ ג ו- 5-10 מ"ג ב- 0.9% תמיסת מלח לכל ק"ג גוף משקל בהתאמה, µL 150 של. הקוקטייל לכל 25 g העכבר).
      הערה: משחה הוטרינר לא הוחל על העיניים במהלך ההליך כמו בתקופה שבין בעלי חיים הרדמה והקרבה/זלוף היה קצר (10 דקות) שבו כל ייבוש העיניים לא נצפתה.
  2. דם הלב ואוסף זלוף
    1. להכין את החיות זלוף לב 10 דקות לאחר הרדמה. בדוק היעדר תגובה עווית כפה על מנת להבטיח כי החיה הגיע מטוס כירורגי של הרדמה.
    2. לשים את בעלי החיים שלהם בחזרה ולהחיל 80% אתנול על העור של אזור הבטן. בעזרת מספריים קטנות, לפתוח את קיר הבטן עם חתך קטן (2 ס מ) רק מתחת לצלעות. להפריד בין הכבד מהסרעפת ולאחר מכן לאט לחתוך דרך הסרעפת לחשוף את חלל הצדר 15.
    3. לחתוך את כלוב הצלעות בשני הצדדים ותקן עצם החזה שנגזרו על מנת לחשוף את החדר השמאלי. הכנס מחט 21-מד פרפר מחובר דרך מערכת סינון זלוף. הצד האחורי של החדר השמאלי.
    4. לנקב אטריום ימין במהירות (תוך 10 s) לאסוף 200-300 µL של דם שוחרר לתוך הפתח שבחזה באמצעות טיפים פיפטה 1 מ"ל (עם סיום ניתוק) בסרום אוסף צינורות ולאחסן אותו בקרח.
      הערה: הליך זלוף זה ההישרדות.
    5. ברגע הדם נאסף, אדליק את המערכת זלוף (10-12 סל ד, 5 mL/min), perfuse החיה למשך 3 דקות עם חמים (RT) 1 x ל- PBS (חינם של Ca2 /מ"ג2 + יונים).
      הערה: PBS המכיל Ca2 +/Mg2 + יונים יכול להיות מנוצל עבור פעילות הלב טוב יותר במהלך זלוף. הסכום הכולל של PBS המשמש זלוף הוא בטווח של 15-20 מ.
    6. להעריך איכות זלוף מאת וציין את הצבע של הכבד, הכליות, אשר מופיעים לבן/חיוור לאחר זלוף.
      הערה: בכליות או בכבד זלוף אינן מצביעות בהכרח על המוח זלוף כמו עורקים (עורק הצוואר/בחוליות) מתוכניות המוח של אבי העורקים עלול לקבל נקרע במהלך הכנת בשלב 3 במיוחד במהלך הניקוב פרפור.

2. ברקמה

  1. אורגן איסוף ואחסון
    1. בסוף זלוף, לאשר את מותו של החיה על ידי נקע בצוואר הרחם, המוח מסיק והכליות. ודא זלוף המוח לפי הצבע של המוח (גלוי דם בכלי של קרומי המוח), כדי לא לכלול את החיות מניתוח חדירות כאשר איכות זלוף אינה טובה. הפרד בין המוח לתוך 2 hemibrains באמצעות אזמל (איור 1).
    2. לנתח עם האזמל hemibrain אחד ללא הריח אונות, המח ולהעביר את hemicerebrum צינור 2-mL. לאחסן המי-המוח הקטן צינור נוסף אם נדרש להערכת אסטרוציטומה חדירות.
    3. העברה כליה בודדת עוד צינור 2-mL. לאחסן את הדגימות מיד קרח יבש.
    4. הטבע באופן מקורי את הכליה הנותרת ואת המי-מוח (הכוללת את המוח ואת הריח אונות) רקמה-tek חיתוך אופטימאליים טמפרטורה (O.C.T) המורכב על קרח יבש.
    5. בסופו של דבר, centrifuge את דגימות הדם המאוחסן על הקרח סרום אוסף צינורות-10, 000 גרם, 10 דקות ב 4 º c להעביר סרום supernatants 1.5 mL צינורות ומניחים בתוך המיכל קרח יבש.
    6. העברת כל הדגימות שנאספו על קרח יבש ל-80 מעלות צלזיוס למקפיא עד עיבוד נוסף.
      הערה: חשוב להקפיא את הדגימות לפני שממשיכים לשלבים המגון כמו המגון מגביר יעילות לאחר כמו הקפאת מפשיר.
  2. המגון, צנטריפוגה
    1. להפשיר על הקרח הדגימות המי-המוח לבין הכליות קפואים למטה ב-80 מעלות צלזיוס ולשקול הצינורות המכילים את האיברים. מכל אלה משקולות, להחסיר את הערך הממוצע של שפופרות ריק מספר (בערך 20) כדי לקבל את המשקל רקמות. להוסיף 300 µL ו- µL 200 קר 1 X PBS כדי הצינורות המכילים הכליה ואת המי-המוח הגדול, בהתאמה.
      הערה: עבור כמויות נמוכות של רקמות (כמו המי-המוח הקטן, להלן 100 מ"ג) במשקל של צינורות בודדים מומלץ.
    2. Homogenize כל מדגם בצינור גלאים המקורי עם כבעלי טפלון (PTFE) המצורפת של בחישה תקורה חשמלי (1, 000 סל ד) על-ידי ביצוע כ-15 קווים (קו 1 = 1 למעלה ולמטה 1). לשטוף את המרוסקים עם PBS בין דגימות, לנגב היבש לפני שתמשיך את הדוגמה הבאה.
      הערה: השימוש דטרגנטים במהלך המגון היה נמנע עקב הפרעה אפשרית עם fluorometry. עם זאת, מעקב תאיים מזוהה גם ב פרוטוקול זה כמו הרקמה ביסודיות הוא הומוגני, אשר יעיל יותר לאחר סיבוב אחד של הקפאת מפשיר.
    3. לאחסן את הדגימות homogenized על הקרח מוגן מפני האור ואת כולם ביחד בסופו של דבר ב 15,000 g, 20 דקות, 4 ° C ומפרידה שולחן צנטריפוגה. העברה supernatants צינורות 1.5 mL החדש על הקרח מיידית fluorometry או ב- 80 ° C כדי להיות מנותח מאוחר יותר.
  3. פלורסצנטיות מדידה ו כמת
    1. אם קפוא בסוף השלב הקודם, להפשיר על קרח את תגובת שיקוע, סרום דגימות רקמה המאוחסנים ב-80 הלעפה תרוטרפמט ולהגן עליהם מפני אור עם מסכל.
    2. פיפטה µL 50 של סרום מדולל (PBS 1 x µL 30 + סרום µL 20) או רקמה supernatants (כמו) לתוך צלחת שחורה 384-. טוב. כוללים מדגם אחד לפחות מן החי מזויפים עבור supernatants סרום ורקמות להבטיח רקע נכון חיסור, רקמת homogenate הוא בדרך כלל גבוה מזה של PBS משמש את diluent.
      הערה: ממוצע של 3 חיות דמה יכול לשמש autofluorescence למרות השתנות מעט מאוד בערכים autofluorescence דמה (נתונים לא מוצג) נצפתה. כמות הנסיוב בשימוש יכול להיות מופחת על ידי לדלל אותה עם PBS, אשר יכול גם להגביר את האות לרעש יחס עבור דגימות עם פלורסצנטיות נמוך כגון הדגימות המוח. סרום µL Upto 10 נבחנה לדלל אותה עם 40 µL PBS. ודא כי אין בועות נמצאים הבארות.
    3. תכניס את הצלחת שחור 384-ובכן לקורא צלחת ופתח תסריט חדש בחירת פלורסצנטיות מדידה.
    4. להגדיר הרווח של האופטימלית, לשימוש עירור/פליטה (ננומטר) הערכים של 550/580 או 490/520 TMR או FITC dyee בהתאמה ולהתחיל את המדידה כדי להשיג את יחידות קרינה פלואורסצנטית raw (RFUs).
    5. להשתמש את יחידות קרינה פלואורסצנטית raw (RFUs) מהקורא צלחת לחישוב מדד חדירות (PI) לאחר הפחתת את הערכים המזויפים.
      1. * אינדקס חדירות (mL/g) = (משקל רקמות רקמות RFUs/g) / (סרום נסיוב RFUs/mL)
    6. למשל חישוב עבור המוח חדירות אינדקס (PI) של החיה GOF1 (טבלה 1):
      1. GOF1 המוח RFUs - דמה המוח RFUs = 154-22.5 = 131.5
      2. GOF1 סרום RFUs - בשאם נסיוב RFUs = 38305-27 = 38278
      3. המוח משקל (g) = 0.195
      4. סרום נפח (ml) = 0.02
      5. המוח חדירות אינדקס (10-3 g/mL) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        הערה: החישובים אינדקס חדירות תשואות ערכים מוחלטים, השוואה בין סוגי רקמות ניסויים. אלה עם זאת ניתן להציג כמו יחסי, כדי להקל על ההשוואה בין 2 קבוצות 12. זו יכולה להיות מושגת על ידי חלוקת החוקר של כל בעל חיים בשתי הקבוצות עם החוקר מתכוון בקבוצת הבקרה, נהיגה הממוצע קבוצת הבקרה באמצעות 1 עדיין שומר את הווריאציה בעלי חיים של אינטר בקבוצת הביקורת. השינוי הזה מספק את הערכים של הקבוצה הניסיונית (או קבוצות) ביחס קבוצת הביקורת מוגדר כ- 1.
  4. Immunofluorescence ויזואליזציה של מעקב
    1. חותכים את אבני כליה/חמי-מוח מוטבע באופן מקורי במתחם רקמות-tek (O.C.T) (שלב 2.1) 10 מיקרומטר מקטעים cryostat מוגדר כ-20 ° C ולהעביר הסעיפים על השקופיות ממוקמים בטמפרטורת החדר. ברגע הסעיפים הם יבשים (בערך 30 דקות), העברת שקופיות מקפיא-80 ° C עד השימוש.
    2. ביום של צביעת, להפשיר את השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לתקן את הסעיפים עם 4% paraformaladehyde (PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריה כביסה מהירה ב- PBS.
    3. דגירה בסעיפים permeabilization/חסימת מאגר של PBS סטרילי המכיל 1% BSA ו- 0.5% טריטון X-100 pH 7.5 לשעה בטמפרטורת החדר.
    4. דגירה שקופיות עבור h 1.5 בטמפרטורת החדר עם נוגדן ראשוני CD31 (0.5 מ"ג/מ"ל, כפיל MEC 13.3), מעורבבת עם בטחונות במאגר המכיל PBS סטרילי, BSA 0.5%, 0.25% טריטון X-100 (pH 7.2) ואחריו שלושה שוטף 5 דקות ב- PBS.
    5. לבצע נוגדנים משניים הדגירה במאגר לעיל לשעה בטמפרטורת החדר עם תלויי מין fluorescently שכותרתו שבערך מדולל נוגדנים (2 mg/mL). עבור CD31, ניתן להשתמש עז אנטי חולדה אלקסה 568 או אלקסה 488-לדילול שבערך. כוללים דאפי (300 מיקרומטר) בהנוגדן משני לערבב (1:1, 000 דילול מן המלאי) כתם על הגרעינים.
    6. הר הסעיפים ויטראז'ים עם polymount אקווה ולהשאיר אותה ללילה עבור הפילמור בטמפרטורת החדר בחושך.
    7. לרכוש תמונות באמצעות לייזר קונפוקלי ספקטרלי הדמיה במיקרוסקופ מערכת סריקה. לנתח את התמונות על-ידי תוכנת אלמנטים ש"ח (גירסה 4.3). תוכנות כגון פוטושופ ניתן לדור של דמויות מונטאז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו הראו לאחרונה כי angiopoietin-2 (אנג-2) רווח-של-פונקציה (GOF) עכברים יש גבוה יותר חדירות כלי דם במוח מאשר עכברים שליטה תנאים בריאים10. בעכברים שבץ הנגרמת, היה זה גם מראה כי העכברים GOF היו חדירות גדולה יותר מאשר הארנבונים מאותה שליטה וגדלים לאוטם גדול יותר. תוצאות אלו מראות תפקיד קריטי של אנג-2 בחדירות-BBB. הפרוטוקול ולכן מנוצל העכברים GOF והשוו אותם כדי לשלוט הארנבונים מאותה לתיאור וזמינותו חדירות ויוו . עם זאת, שיטה זו ניתן להחיל על כל דגם דגם, הטרנסגניים עכבר המחלה או סמים טיפולים שמשנות את החדירות BBB כפי שעשינו בעבר 10,11,12,13.

זמן מחזור קצר (15 דקות) לניתוח חדירות הוא הציע, כפי פעמים מחזור ארוך יותר יוביל סיווג גדול יותר מן התא כלי דם, אשר נצפתה גם מחקרים קודמים16. הסיווג של 3 kD FITC-לתוספי-2 h (איור 2 C, D) היא הרבה יותר גדולה מאשר ב- 15 דקות (איור 2 A, B) כליה גם כמו רקמת המוח. במוח, יש מעט מאוד extravascular מעקב עקב שלם מחסום הדם - מוח בעכברים WT אלה למבוגרים (איור ב', ד). יישום שיטה זו, החדירות מעקב באנג-2 GOF עם הארנבונים מאותה WT נמשל. התוצאות שהוצגו בתבנית טבלה (טבלה 1) מצביעות על הצטברות מעקב גבוה יותר במוחם של עכברים GOF בהשוואה WT עכברים. עם זאת, קרינה פלואורסצנטית הכליה אינה משתנה בין קבוצות אלה. תמונות immunofluorescence לאשר הגדלת מעקב extravascular בעכברים GOF (איור 3 B, D) בהשוואה WT עכברים (איור 3 A, C) איפה רכיב המעקב מוגבל לתא כלי הדם.

Figure 1
איור 1. תיאור סכמטי של זרימת העבודה עבור ויוו חדירות וזמינותו באמצעות המשדרים פלורסנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. סיווג מעקב קצר, זמן מחזור פעמים. כדי לבסס את זמן מחזור מעקב וזמינותו פרמאביליות, זמן מחזור קצר של 15 דקות (A, B) היה לעומת זמן מחזור ארוך של 2 h (C, D) פוסט מעקב הזרקה. תקופת ההשאלה עוד 2 h הוביל כמויות נמוכות מאוד של מעקב הצטברות כליה (ג) שבו החדירות הבזליים הוא גבוה בהשוואה של קצר 15 דקות זרימת הזמן (א) שעשוי להיות בשל סיווג גבוה מאוד של FITC kD לתוספי-3 (ירוק ערוץ) מן התא כלי הדם. אפקט זה היה אפילו יותר דרמטי במוח מאופיין את הדוק מחסום הדם - מוח (ב', ד). CD31 מכתים (ערוץ אדום) אישרו הנוכחות של כלי שיט באיזור של עניין. להחליפן בתמונות מחיה אחת מתוך 2 פראי-סוג למבוגרים CD1 עכברים הזריקו את רכיב המעקב עבור כל נקודת זמן וכל חיות הוקרבו ללא פרפוזיה אותם כדי להמחיש את רכיב המעקב קרישה תוך-כלית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. Immunofluorescence מכתים עבור המשדרים להעריך שינויים במוח חדירות בעכברים GOF- גדל החדירות של 3 kD TMR-לתוספי מעקב (באדום), ניתן לאבחן בעכברים GOF אנג-2 (B, D) ביחס הארנבונים מאותה WT (א, ג) באזור הקורטקס. בבעלי חיים WT רכיב המעקב היא מוגבלת בכלי הדם (A, C), בעוד extravascular מעקב יכול להיות שנצפו בעכברים GOF (החצים הלבנים של B, D). צביעת עבור CD31 (בכחול) של תמונות הממוזג (A-D) מאשר הנוכחות של כלי... האיור מציג להחליפן בתמונות 2 WT ועכברים GOF 2 הזריק המשדרים מקומות והקריב 15 דקות הזרקת פוסט עם זלוף. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

זיהוי בעלי חיים משקל המוח (g) משקל של הכליות (g) סרום נפח (mL) סרום RFU כליות RFU המוח RFU בגלל הסיכון אינדקס (10 ^-3 מ"ל/g)
כליה המוח
GOF 1 0.195 0.252 0.02 38305 31051 154 64.4 0.352
GOF 2 0.177 0.249 0.02 42001 31411 126 60 0.278
WT 1 0.167 0.301 0.02 40904 31591 64 51.2 0.122
WT 2 0.146 0.294 0.02 39502 31768 70 54.8 0.164
קטי נחום 0.155 0.27 0.02 27 36 22.5 נה נה

טבלה 1. רקמות חדירות חישובים. אינדקס חדירות שהחישובים אנג-2 רווח-של-פונקציה (GOF) ועכברים פראי-סוג הארנבונים מאותה (WT) מראים בבירור גדול (בערך קיפול. כפול) המוח חדירות בעכברים GOF בהשוואה WT עכברים. החדירות כליה הוא אולם בטווח זהה בין 2 הקבוצות. החדירות כליות הבזליים גדול בהרבה לעומת המוח כמצופה לאור אנדותל fenestrated כליה זה לא ליצור מחסום חזק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחסום הדם - מוח בתפקוד מזוהה עם מספר רב של הפרעות נוירולוגיות, כולל גידולים במוח העיקרי והמשני או שבץ מוחי. התפלגות BBB קשורה לעיתים קרובות עם בצקת CNS סכנת חיים. הבהרה של המנגנון המולקולרי המפעילות את פתיחת או סגירת BBB ולכן חשיבות טיפולית בהפרעות נוירולוגיות, בדרך כלל נחקר על ידי חוקרים. עם זאת, שיטות לחקור BBB חדירות ויוו דיווחו בספרות, הקשורים לעתים קרובות עם קשיים טכניים תלויים כימות מייגע וסובייקטיביות של קרינה פלואורסצנטית תמונות17,18 , 19. יתר על כן, חלק מהשיטות כוללים עיבוד כל המוח פלורסצנטיות מסולף כפי שהוא מעיד יותר החדירות של המוחיים שטחית, זה לא ליצור מחסום חזק. אפילו כאשר כימות בוצעה על סמך ספיגת רקמת המוח אובייקטיבית (למשל הערכת חדירות של אוונס כחול) בעלי החיים הם לעתים קרובות לא perfused מובילה לפרשנות מוטעים עקב שבר דם משמעותית. משקל המוח הוא עוד משתנה לעיתים קרובות אינו נכלל בחישובי פרמאביליות, אך צריך להיות כמו בצקת הנובע חדירות כלי דם יכול להגדיל את המשקל ולשנות את החדירות נטו. יתר על כן, מין ווריאציות משקל המוח החי-כדי-חיה יכולה לטשטש הבדלים חדירות. קליעים נותבים רדיואקטיביים כגון סוכרוז 14C ו- [3 H] אינולין הוחלו בהצלחה עבור אינדקס חדירות המוח אבל לא מציעים מגוון רחב של גודל, תשלום המבוסס על החקירה חדירות כמו עם קליעים נותבים שכותרתו fluorescently20.

מהסיבות הנ ל, אימצנו שיטה פשוטה, אובייקטיביים, כמותיים באומדן מחסום הדם - מוח חדירות ב- vivo בעכברים באמצעות fluorescently שכותרתו המשדרים. Dextrans הינם פוליסכרידים הידרופילית מאופיין על ידי משקל מולקולרי שלהם בינונית-גבוהה (3-200 kD), ניתן להשיג גם מולקולות טעונות או לא טעונים מבוסס על fluorophore מצומדת. צמתי צר אנדותל הנוצרת על-ידי בעיקר claudins (1, 3, 5 ו- 12), occludin, יחד לקבוע את גודל paracellular, גובה סלקטיביות לפי האישום נקבובית שאריות נוכח בלולאה הראשונה שלהם חוץ-תאית (נבדקה21). חדירות על פני מחסום הדם - מוח ויוו היא גם תלויה glycocalyx ואת הנדן הבזליים, שני מבנים שנמצאים משני צדי BBB22,23. Glycocalyx luminally הנוכחי הוא ג'ל כמו מבנה הנוצרת על-ידי oligosaccharides טעונים שלילית (הפארין סולפטים) זה גם משמש כמחסום כדי מקרומולקולות נישא בדם כגון אלבומין. שינויים glycocalyx עובי או קומפוזיציה קשורים גם בשינויים חדירות כלי דם כמו הבחנו ב- angiopoietin-2 רווח של הפונקציה עכברים לעומת פראי סוג עכברים10. קרום המרתף מאידך גיסא קיים על הצד abluminal של תאי אנדותל הכוללת שני כלי הדם קרום המרתף שנעשו על ידי תאי אנדותל ואת pericytes, ואילו קרום המרתף parenchymal או קרום המרתף astrocytic גרם מאת האסטרוציטים. ממברנות מרתף אלה גם הם אניון, וכך גם יכולת לשמש תשלום מחסומים. בהקשר זה, dextrans מצומדת מציעים החקירה של גודל וגם חדירות מבוסס תשלום. לדוגמה, kD TMR-לתוספי 3 הוא anionic ואילו TXR-לתוספי 3 kD הוא נייטרלי, המשלב באחד המשדרים הללו עם גבוה מצומדת לתוספי משקל מולקולרי כגון FITC לתוספי 70 kD בתערובת באותו מוזרק לעכברים, אחד יכול להעריך את החדירות המבוססת על גודל. אנחנו עוד יותר את היתרון של הטבע ליזין-ניתן לתיקון של התווית על-ידי פלורסנט dextrans לחקור את הבדלים אזוריים חדירות ב immunofluorescence רגיל מכתים. Dextrans בדרך-כלל גם התערוכה immunogenicity נמוך, ובכך לשמש המשדרים טוב. לוציפר צהוב, cadaverine, fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC), הם בין אחרים המשדרים הנמצאים בטווח נמוך משקל מולקולרי (0.4-0.8 kD) הם ניתן לתיקון.

בשיטה שלנו, המשדרים הוזרקו דרך מקומות ואחריו פרפוזיה העכברים, קבלת את זריחה של המוח homogenates מנורמל המשקל הרטוב, של זריחה סרום. זוהי שיטה פשוטה אך מאוד כמותי ואובייקטיבי כמו שיש אין מבחר קטעים/תמונות כמו כמת בשיטה immunofluorecence המשמש בסגנון קלאסי. עלינו לנצל את המי-מוח אחד בלבד עבור וזמינותו פרמאביליות, לנצל את hemibrain אחרים עבור צביעת על-ידי ניתוח קטעים הסאגיטלי מתן הבדלים אזוריים אותה חיה immunofluorescence. השימוש של כל המי-מוח למדידות בו-זמניות ברורים הוא אחד היתרונות העיקריים של התקנון שלנו. החדירות של איברים אחרים כגון הכליות, הכבד, וכו ' משמש גם פקד פנימי טוב כמו החדירות הבזליים הוא גבוה באיברים אלה. על מנת להשוות בין 2 קבוצות, אחד יצטרך תחילה לחסר החיה מזויפים (כי לא קיבל הזרקת tracer) autofluorescence של כל החיות הן קבוצות ואת כל הרקמה סוגי (כליות, מוח, סרום) עבור כל מעקב ולאחר מכן המשך מנורמל ל חישובים השוואה בין 2 הקבוצות. מדד חדירות (PI) מוצג זה מתקבל יחס של רקמה פלורסצנטיות סרום מנורמל באמצעי אחסון, משקל, סרום, רקמות. החישובים שלנו תשואה בערכו המוחלט עבור החדירות מעקב ניתן להשוואה בין ניסויים סוגי רקמות. ערכים אלה עם זאת, ניתן בקלות לבטא יחס או אחוזים בין 2 הקבוצות שמשווים כמו גם עשינו בעבר12. זו יכולה להיות מושגת על ידי חלוקת החוקר של כל בעל חיים בשתי קבוצות עם החוקר מתכוון של כל בעלי החיים בקבוצת הביקורת. זה היה מעצבן את קבוצת הביקורת PI באמצעות 1 עדיין שומר את השגיאה בין בעלי החיים ועבור קבוצת הניסוי לתת ערכים שאינם ביחס הממוצע קבוצת הבקרה של 1.

הזרקה של קליעים נותבים על ידי מקומות קל יותר, אך עלות מאומצת יותר לעומת זריקה העירוי, כפי מידת מעקב צריך להיות מוגברת. הנתונים שלנו (לא מוצג) בהקשר זה מציין את כמות כמעט קיפול כפול גבוה יותר המעקב נדרש על ידי הזרקת מקומות לעומת השגחנו על עירוי כדי לקבל סרום דומה פלורסצנטיות ערכים. כמו כן, הזמן של מחזור הדם הוא גבוה במסלול מקומות לעומת העירוי בשל הזמן נלקח לקליטה מעקב לתוך זרם הדם. בהקשר זה, סרום הערכים זריחה ב 15 דקות פוסט מקומות ההזרקה היו דומות 5 דקות פוסט העירוי זריקה עבור המשדרים בטווח משקל מולקולרי נמוך ובינוני בין 0.4-4 kD (נתונים לא מוצג). אנו מציעים זמן מחזור קצר כי paracellular חדירות היא לינארית אם הרקמה ניכר פלורסצנטיות זלוף פוסט שאותרו לאחר זמן מחזור קצר (15 דקות), זה כבר מצביע על הפנוטיפ חדירות כפי דיווחנו ב שלנו הקודם פרסומים10,12,13,14. ובכל זאת במקביל אחד יכול להשיג את פלורסצנטיות סרום של נורמליזציה. בזמנים מחזור ארוך יותר, סיווג רקמות הינו משמעותי, אשר מפחיתה משמעותית את הנסיוב פלורסצנטיות, ובכך העלולים להשפיע ערכים חדירות מנורמל ל סרום. בעוד הזמן של מחזור ביחס הגודל/הטעינה רכיב המעקב חייב להיות מותאם במיוחד עבור כל תרחיש, אנו מציעים זמן מחזור קצר כנקודת ההתחלה. זה חל גם מומסים בגבול משקל מולקולרי גבוה יותר כגון פלזמה IgGs והם פיברינוגן (150-400 kD) שמאפייניה חדירות בניגוד לתוספי אינרטי המשדרים עקב שלהם גודל גדול במיוחד ואינטראקציה ספציפי עם קולטנים הסלולר כגון Fc קולטנים המשנים את מחצית חיים שלהם24. Dextrans מאידך גיסא אין כל מערכת תחבורה ספציפיים-רמת אנדותל25 ומקושרת כמו תאי אנדותל המוח אינם עוברים פינוציטוזה לרמות משמעותית עקב מאוד רמות נמוכות של plasmalemma שלפוחית חלבון (PLVAP)26 , הדרך העיקרית של תחבורה של dextrans הוא paracellular. אנחנו החלת שיטת לעיל בהצלחה מספר תרחישים כגון חדירות ב העכברים הטרנסגניים בהשוואה לפראי-סוג הארנבונים מאותה גם העריכו חדירות שינויים בעכברים פראי סוג לאחר התערבות טיפולית10, 12 , 13 , 14. לסיכום, בשילוב עם ההכתמה immunofluorescence, וזמינותו חדירות המתוארים כאן הוא פשוט, שיטה חזקה כדי להעריך את החדירות של עכברים ויוו שניתן להחיל גם בעלי חיים קטנים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר קונסורציום Sphingonet במימון קרן Leduq לתמיכה עבודה זו. עבודה זו גם נתמך על ידי המרכז לחקר שיתופי "בידול וסקולרית ובניה" (CRC / Transregio23, פרויקט C1) ועל -ידי 7. FP, COFUND, גתה הבינלאומי פוסטדוק תוכנית קדימה-פנימה, מס 291776 מימון. אנו עוד יותר להכיר קתלין זומר לסיוע טכני שלה עם עכברים טיפול ו genotyping.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD Thermosfisher D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD Thermosfisher D3306
Ketamine (Ketavet) Zoetis
Xylazine (Rompun) Bayer
0.9% Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS Gibco 10010-015
Tissue-tek O.C.T compound Sakura Finetek 4583
37% Formaldhehyde solution Sigma 252549-1L prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V Roth 8076.3
Triton X-100 Sigma T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 BD Pharmingen 553370
goat anti rat alexa 568 Molecular Probes A-11077
goat anti rat alexa 488 Molecular Probes A-11006
DAPI Molecular Probes D1306
Aqua polymount Polyscience Inc 18606
21-gauge butterfly needle BD 387455
serum collection tube Sarstedt 41.1500.005
2mL eppendorf tubes Sarstedt 72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers Kimberley-Clark Professional 05511
384-well black plate Greiner 781086
slides superfrost plus Thermoscientific J1800AMNZ
PTFE pestle Wheaton 358029
electric overhead stirrer VWR VWR VOS 14
plate reader Tecan Infinite M200
Cryostat Microm GmbH HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System Nikon
peristaltic perfusion system BVK Ismatec
microcentrifuge eppendorf 5415R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  3. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  4. Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
  7. Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
  8. Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
  9. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  10. Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
  11. Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
  12. Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
  13. Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
  14. Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  16. Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
  17. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  19. Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  20. Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
  21. Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
  22. Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
  23. Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
  24. Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
  25. Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
  26. Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).

Tags

מדעי המוח גיליון 132 מחסום הדם - מוח BBB ויוו חדירות המשדרים כמותית פלורסנט תאי אנדותל microvessels זלוף בקרום הבטן נימים,
<em>In Vivo</em> מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devraj, K., Guérit, S., Macas,… More

Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. J. Vis. Exp. (132), e57038, doi:10.3791/57038 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter