Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تحسين إدماج الجينية الكيميائية تحقيقات في جبكرس لرسم خرائط الصور-crosslinking والكيمياء بيورثوجونال في خلايا الثدييات الحية

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57069
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences, University of Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

يرد مقايسة fluorescence سهلة لتقييم كفاءة أزواج الأمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز/الحمض الريبي النووي النقال دمج البروتينات في خلايا الثدييات غير المقبول-الأحماض الأمينية (ncAAs). ويرد وصف تطبيق ncAAs لدراسة مستقبلات مقترنة بالبروتين G (جبكرس)، بما في ذلك رسم الخرائط crosslinking صور لربط المواقع ووسم هذه العملية بيورثوجونال على الخلايا الحية.

Abstract

إدراج الوراثية من الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) عن طريق قمع كودون وقف العنبر تقنية قوية لتثبيت المجسات مصطنعة ومويتيس رد الفعل على البروتينات مباشرة في الخلية الحية. هو إدماج كل نكا مكرسة متعامد القامع-الحمض الريبي النووي النقال/أمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز (AARS) زوج التي يتم استيرادها إلى الكائن الحي المضيف. يمكن تختلف كفاءة إدماج ncAAs مختلفة إلى حد كبير، وغير مرضية في بعض الحالات. ويمكن تحسين أزواج المتعامدة عن طريق التلاعب AARS أو الحمض الريبي النووي النقال. ومع ذلك، التطور الموجه للحمض الريبي النووي النقال أو AARS استخدام مكتبات كبيرة وأساليب الاختيار الميت/على قيد الحياة ليست ممكنة عمليا في خلايا الثدييات. ويرد هنا، سهلة وقوية تستند إلى الأسفار مقايسة لتقييم كفاءة أزواج متعامد في خلايا الثدييات. يسمح الفحص فحص عشرات ومئات متغيرات AARS/الحمض الريبي النووي النقال بجهد معتدل وضمن فترة زمنية معقولة. استخدام هذا التحليل لتوليد ترنس الجديدة التي تحسن كفاءة نظام متعامد بيروليسيني هو وصف، جنبا إلى جنب مع تطبيق ncAAs لدراسة البروتين ز إلى جانب المستقبلات (جبكرس)، التي تشكل تحديا الكائنات للرابطة الوطنية لرياضة الطفرات. أولاً، من خلال دمج بانتظام نكا صور--كروسلينكينج في جميع أنحاء سطح مستقبلات الخلية، يتم تعيين مواقع الربط من يغاندس مختلفة على مستقبلات سليمة مباشرة في الخلية الحية. الثانية، بتضمين ncAAs الجيل الأخير هذه العملية، فائق السرعة مجاناً محفز مستقبلات وسم بصبغة فلورسنت ويتجلى، الذي يستغل بيورثوجونال تروج لها سلالة معكوس "الدر ديلس" سيكلواديتيون (سبيداك) في الخلية الحية. كما يمكن تطبيق ncAAs عموما أي البروتين بشكل مستقل في حجمه، الأسلوب للمصلحة العامة لعدد من التطبيقات. وباﻹضافة إلى ذلك، إدراج نكا لا يتطلب أي معدات خاصة، ويتم بسهولة في مختبرات الكيمياء الحيوية القياسية.

Introduction

إدماج المجسات الكيميائية الوراثية في البروتينات وسيلة قوية لتسهيل التحقيق في الجوانب الهيكلية والديناميكية لوظيفة البروتين مباشرة في سياق الأصلية من الخلية الحية. في الوقت الحاضر، مئات أحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) مجهزة بمجموعات كيميائية الأكثر المتباينة يمكن سيتيسبيسيفيكالي إدراجها في البروتينات تخليق الحيوي1،2،،من34. بينهما، يجد المرء ncAAs المراعية للصور مثل الصور-كروسلينكيرس5و صور قفص6،7،،من89 والأحماض الأمينية-صور للتحويل10، 11، والأحماض الأمينية التي تحمل الالكينات المتوترة والكينس بيورثوجونال خالية من محفز الكيمياء2،،من1213،14،15،16 ،17والأحماض الأمينية التي تحمل دانسيل18و9،الكومارين19و21 برودان20،فلوروفوريس، ومجهزة بالمسابير الفيزيائية الحيوية الأخرى الأحماض الأمينية وكما هو الحال مع وظيفة التعديلات متعدية الجنسيات1،2،3،4،،من2223،24،25.

يتم تمكين الترميز الوراثي من نكا مخصصة أمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز (AARS) إقران إلى المشابهة القامع-الحمض الريبي النووي النقال، الذي يتضمن نكا ردا على كودون وقف العنبر خلال التوليف ريبوسومال العادية. أزواج نكارس/الحمض الريبي النووي النقال صممت كي يكون متعامد في الكائن المضيف، أي لا عبر الحديث مع أزواج الذاتية. هذا الأسلوب راسخة في المضيفين بدائية وحقيقية النواة والخلايا تنطبق بسهولة على الثدييات. أزواج لإدماج نكا في خلايا الثدييات تستند إلى نظم متعامد الرئيسية الثلاثة: النظام تيروسيل، الذي يجمع بين تيرس من كولاي26 مع القامع العنبر تيروسيل من ستيروثيرموفيلوس باء-27 (Ec تيرس/زوج يامبتوقيت جنوب بريطانيا)، كولاي ليوسيل نظام (المفوضية الأوروبية/الحمض الريبي النووي النقاللويكوا زوج)6،،من1828 ونظام بيروليسيل أرتشايال (بيلرس/الحمض الريبي النووي النقال برونتوسوروس زوج)3، الذي بموجبه الحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس القامع العنبر طبيعي. وبصفة عامة، كل نكا يعترف به نكارس متخصصة. اعتماداً على هيكل ncAA، يتم الحصول عليها في نكارس عن طريق التطور الموجه تيرس أو التي أو بيلرس، على الرغم من أن بعض سينثيتاسيس يمكن قبول أكثر من الرابطة الوطنية لرياضة.

يتم استيراد الزوج متعامد إلى الخلايا ببساطة استخدام ناقل بلازميد. والبلازميدات الأكثر شيوعاً وكفاءة بيسيسترونيك وترميز سواء بالنسبة سينثاتيز والحمض الريبي النووي النقال تشكيل زوج متعامد29. ترميز بلازميد الثاني لبروتين فوائد كودون العنبر في موقع مخصص للتعديل ترانسفيكتيد المشترك. نكا بساطة إضافة إلى متوسط نمو الخلية. ومع ذلك، غالباً ما تستخدم مختلف المجموعات المتخصصة أنواع مختلفة من بنيات بلازميد حتى بالنسبة لإدماج نكا نفس. بنيات تختلف في ترتيب الجينات في ناقلات، نوع من سينثاتيز كودون الاستخدام في الجينات سينثاتيز، استخدام المروج، والبديل للحمض الريبي النووي النقال وعدد الأشرطة التعبير الحمض الريبي النووي النقال. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تختلف فعالية إدماج ncAAs مختلفة جذريا بسبب كفاءة الحفاز مختلفة سينثيتاسيس مختلفة، ونوعية الحمض الريبي النووي النقال، و العوامل الأخرى30. ولذلك، من المهم أن يكون في متناول اليد طريقة سريعة وموثوق بها لتقييم كفاءة زوج متعامد، سواء في اختيار النظام الأكثر ملاءمة لتطبيق المطلوب والقيام ببعض خطوات التحسين التي تحسن عموما البروتين التعبير غلة.

وقد أنشأنا بسيطة وقوية تستند إلى الأسفار مقايسة لتقييم كفاءة أزواج متعامد29 (الشكل 1). في التحليل، خلايا transfected اشتركت مع بلازميد الترميز لزوج متعامد، جنبا إلى جنب مع بلازميد مراسل بيسيسترونيك ترميز سواء بالنسبة للبروتينات الفلورية الخضراء واضعة كودون وقف العنبر في موقف متساهلة (اجفبالعلامة) مشري الجينات. تتم قراءة الأسفار الحمراء والخضراء لكامل الخلية ليساتيس في قنوات منفصلة عن قارئ لوحة في لوحة 96-جيدا. كثافة الفلورية الخضراء مباشرة يرتبط بالكفاءة لقمع العنبر، حين يعطي كثافة ومضان أحمر تقدير حجم العينة المقاسة وكفاءة تعداء مباشرة. فيما يتعلق بفحوصات مماثلة تستند إلى الأسفار تلا مساعدة الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)32من31،، المقايسة يعطي تقييما فوريا وشاملاً للتعبير البروتين في السكان خلية كله، الذي أكثر تمثيلية من الظروف التجريبية المعتادة، ويقدم أكثر سهولة الحصول على البيانات وتجهيز مع البرامج القياسية. عموما، الميزة الرئيسية للفحص أنه وسيلة لعدد كبير من العينات يمكن تحليلها بالتوازي. استخدام هذا الفحص، ونحن قد فحص مكتبة مصممة بطريقة رشيدة من ترنس القامع لتحسين كفاءة نظام متعامد برونتوسوروس30. ويصف هذا العمل البروتوكول التجريبي القيام بهذا التحليل وإظهار أمثلة على تطبيقه، بما في ذلك الاستفادة المثلى زوج متعامد لإدراج الصور-كروسلينكينج نكا فأزيدو-L-فينيلالاناين (العازي) ومقارنة إدماج الكفاءات من الأحماض الأمينية مختلفة (الشكل 2).

على مدى السنوات الماضية، ثبت نكا أدوات قوية جداً للتحقيق في الهيكلية والجوانب الفنية للبروتين ز إلى جانب المستقبلات (جبكرس)33،34،35،،من3637 , 38-في البشر، وتكوين أسرة كبيرة من الغشاء مستقبلات (800 عضو) جبكرس وتمثل الأهداف الرئيسية للعقاقير العلاجية. الوصف الهيكلي مباشرة من جبكرس لا تزال صعبة وأساليب البيوكيميائية التكميلية العالية اللازمة للتحقيق فيها. نحن رائدة استخدام ncAAs كروسلينكينج صور لخريطة GPCR السطوح واكتشاف يجند ملزمة جيوب34. استخدام نظامنا الأمثل لإدماج عُزي، ادخلنا بانتظام عُزي عبر المجال جوكستاميمبراني كله من هذه العملية مباشرة في خلايا الثدييات الحية. عند إشعاع الأشعة فوق البنفسجية، عُزي أشكال أنواع نيتريني شدة رد الفعل الذي يلتقط الجزيئات المجاورة تساهمي. عندما تتم إضافة يجند للنظام، عُزي بمثابة تحقيق قرب تكشف فيها مواقف المستقبلات تقترب من يجند منضم. وبهذه الطريقة، وضع الربط من هرمون نيوروبيبتيدي أوروكورتين (Ucn1) على مستقبلات فئة GPCR ب كورتيكوتروبين-تحرير-عامل الكتابة 1 (CRF1R)33 كان أول كشف النقاب عنها. في الآونة الأخيرة، ونحن كشفت عن أنماط ملزمة مميزة ليضع والخصوم على مستقبلات نفس38. طبق نهج مماثل قبل الآخرين للكشف عن أورثوستيريك ومواقع ربط اللوستيريك الأخرى الببتيدات والجزيئات الصغيرة يغاندس على الأخرى جبكرس39،40،،من4142. ويصف هذه المخطوطة البروتوكول التجريبي المطبق في لدينا مختبر لرسم خرائط الصور-كروسلينكينج للسطوح GPCR. الطريقة سريعة نسبيا، واضحة ولا يتطلب أي معدات خاصة، حيث أنها تنطبق في مختبرات الكيمياء الحيوية القياسية. الأهم من ذلك، يوفر هذا النهج أداة قيمة ليس فقط لتحديد مواقع الربط يجند فيها البيانات الهيكلية 3D نادرة، ولكن أيضا تكملة الموجودة في المختبر البيانات مع معلومات من مستقبلات معدلة تماما بوستترانسلاتيونالي في البيئة الفسيولوجية للخلية الحية.

التطورات الأخيرة في رواية ncAAs تتعلق الجانب سلسلة مجموعات كيميائية مناسبة للكيمياء بيورثوجونال خالية من محفز فائق السرعة قد فتحت إمكانية تثبيت fluorophores الجيل الأخير لتصوير فائقة القرار إلى البروتينات مباشرة على يعيش الخلايا2،43. وتشمل هذه المراسي الكيميائية سيكلوكتيني المتوترة في سكوك14، نونيني بيسيكلو [6.1.0] في12،بكنك17، وعبر-سيكلوكتينيس في تكلفة الامتلاك الكلية * ك13،،من1517 من بين ncAAs أخرى إيواء نوربورنيني16،17،44 أو سيكلوبروبيني45،46 moiety. NcAAs ضخمة للكيمياء بيورثوجونال مدرجة بالبديل من بيلرس وعادة ما تتم الإشارة إليها بيلرسAF (يشير إلى الطفرة Y271A و Y349F في بيلرس م. باركيري )، فضلا عن الأخرى المخصصة تطورت نكارس17 , 44-المراسي بيورثوجونال تتفاعل مع تيترازيني الكواشف47 عبر سيكلواديتيون ديلز-الدر معكوس إلكترون-الطلب إعطاء غلات التوسيم عالية ضمن بضع دقائق43،48. بيد قد تم الطعن في تطبيق هذا النهج قوية إلى التسمية جبكرس سبب منخفضة كفاءة الكلية للنظام نكا متعامد على إدراج. استخدام نظامنا برونتوسوروس المعززة، أظهرنا مؤخرا إدماج عالية الغلة من هذه الأحماض الأمينية في جبكرس وفائق السرعة هذه العملية وضع العلامات على سطح خلايا الثدييات يعيش30. مستقبلات المسمى كانت لا تزال وظيفية، كما أنها تستوعب الفيزيولوجية عند تنشيط المستقبلات مع مؤثر. المراسي البروتوكول التجريبي لإدراج بيورثوجونال في جبكرس والخطوات وضع العلامات التالية التي تم وصفها هنا. تجهيز جبكرس مع فلوروفوريس مشرق الصغيرة هو الخطوة الأساسية الأولى باتجاه دراسة ديناميات GPCR الهيكلية في الخلية الحية عبر تقنيات متقدمة في الفحص المجهري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الأسفار على أساس الفرز لإدماج الكفاءات (الشكل 1)

  1. الحفاظ على خلايا HEK293 في المتوسط "تعديل النسر" دولبيكو (دميم؛ الجلوكوز عالية، 4 مم الجلوتامين، بيروفات) وتستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
  2. البذور في اليوم السابق تعداء الخلايا.
    1. فصل الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في 0.05% التربسين/برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.5 مم يدتا. استخدم 1 مل التربسين/يدتا لطبق 10 سم. آرو مع 10 مجلدات متوسطة كاملة وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج. حساب عدد الخلايا في تعليق استخدام هيموسيتوميتير49.
    2. بذور 6.0 × 105 HEK293 الخلايا الواحدة وكذلك لوحات 6-جيدا في 2 مل كاملة النمو المتوسطة. إعداد العديد من الآبار كعدد العينات، وبئرين إضافية اجفب البرية من نوع وعينه transfected وهمية، على التوالي.
  3. التحكم الملتقى (المنطقة التي تحتلها الخلايا) تحت مجهر. ترانسفيكت الخلايا عند التقاء ~ 70% استخدام كاشف بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد).
    1. ح 1 قبل تعداء، إضافة مبلغ الطازجة نكا الأسهم الحل المناسب لجميع الآبار لتركيز نكا نهائي من 0.25-0.5 ملم. إضافة الرابطة الوطنية لرياضة لجميع الآبار، بما في ذلك مراقبة البرية من نوع الإيجابية والخلايا transfected وهمية، لمنع الخلافات في إشارات الأسفار التي قد تنجم عن آثار ncAA على النمو الخلوي.
      ملاحظة: لإعداد حلول الأسهم، حل نكا إلى 0.1-0.5 م باستخدام 0.2-0.5 M هيدروكسيد الصوديوم. ومع ذلك، قد تتطلب بعض ncAAs solubilization الأولية في [دمس] و/أو تحييد من أربعة مجلدات 1 م حبيس (درجة الحموضة 7.4) قبل استخدام. وبشكل عام، توصي بها الشركة المصنعة وضع بروتوكول لإعداد حل أسهم.
    2. في أنبوب ميكروسينتريفوجي، خلط 1 ميكروغرام لترميز بلازميد الحمض النووي لزوج نكارس/الحمض الريبي النووي النقال لفحصها مع 1 ميكروغرام لمراسل بلازميد الحمض النووي (pcDNA3.0-اجفب183TAG-مشري). في أنابيب منفصلة، إعداد تعداء متطابقة استخدام مرجع البرية من نوع اجفب ومن تعداء وهمية.
      ملاحظة: عدد نسخ الكاسيت الحمض الريبي النووي النقال جزءا لا يتجزأ من بلازميد الترميز لزوج نكارس/الحمض الريبي النووي النقال يعتمد على التطبيق. تيسيرا للاستنساخ، 1 الحمض الريبي النووي النقال نسخة ينصح عند فحص ترناس مختلفة، بينما يوصي 4 نسخ (ولو لم يكن ضروريا) عند اختبار نكارس مختلفة أو إدراج ncAAs مختلفة بنفس زوج متعامد.
    3. لكل أنبوبة تحتوي على الحمض النووي إضافة 100 ميليلتر لاكتات مخزنة المالحة (رطل) الذي يحتوي على 20 مم لاكتات الصوديوم في pH 4.0 و 150 مم كلوريد الصوديوم. ميكس بإيجاز.
    4. لكل أنبوبة تحتوي على الحمض النووي في رطل إضافة 6 ميليلتر من 1 ميكروغرام/ميليلتر بي في رطل (نسبة بي/الحمض النووي = 3/1 ث/ث) ودوامه فورا. تبني على RT لمدة 10-15 دقيقة.
    5. تأخذ 400 ميليلتر الخلية المتوسطة من كل بئر وإضافته إلى خليط الحمض النووي-برينس لتحييد درجة الحموضة. لعاب خليط الحمض النووي إلى الخلايا.
      ملاحظة: عادة ما يتضمن دميم الفينول الأحمر كمؤشر الرقم الهيدروجيني. أثناء الخطوة تحييد سيغير لون الخليط أضيف في الأنبوب من الأصفر (الحمضية) إلى اللون الأحمر (المحايدة). على الرغم من أن تشكيل المجمعات الحمض النووي في رطل في الأس الهيدروجيني الحمضية يعطي غلة تعداء أعلى50، يمكن بدلاً من ذلك تشكيل مجمعات الحمض النووي-بي مباشرة على درجة الحموضة 7.4 (على سبيل المثال في دميم خالية من المصل). في حالة استخدام دميم لنموذج المجمعات الحمض النووي، تخطي الخطوة تحييد 1.3.5. على أي حال، من الضروري أن لا المصل موجود في الخليط عند تشكيل المجمعات.
  4. حصاد الخلايا تعداء بعد 48 ساعة.
    1. نضح المتوسطة وشطف الخلايا مرة واحدة مع 2 مل برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية). إضافة 800 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.5 مم يدتا واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فصل وتعليق الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    2. نقل تعليق خلية في أنابيب 1.5 مل تحتوي على 200 ميليلتر PBS تستكمل مع 5 مم مجكل2.
    3. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ز وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. وفي هذه الحالة، فلاش-تجميد الكريات في سائل ن2 وتخزينها في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. دائماً ارتداء نظارات حماية العين.
  5. إضافة 100 ميليلتر تريس تحلل العازلة (50 مم تريس-HCl pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% X-100 تريتون، يدتا 1 مم وبمسف المضافة حديثا) إلى الخلية الكريات واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. لتسهيل تحلل، دوامة كل 5 دقائق.
  6. تدور أسفل الحطام خلية لمدة 10 دقيقة على 4 درجة مئوية و 14,000 س ز ونقل ميليلتر 90 من المادة طافية في أسود 96-جيدا لوحات. قياس اجفب ومشري fluorescence استخدام قارئ لوحة مزودة بوحدة نمطية الأسفار.
    ملاحظة: استخدام عوامل الإثارة والانبعاثات المناسبة اجفب (λإس: 488 نانومتر؛ λم: 509 نانومتر) ومتشيري (λإس: 588 نانومتر؛ λم: 611 nm). وسوف تمتد يقاس اجفب قيم مجموعة بين الحد الأدنى للقيمة التي تم الحصول عليها من خلايا ترانسفيكتيد وهمية وقيمة قصوى، التي يتم الحصول عليها عادة من اجفب البرية من نوع. رعاية إنشاء نافذة القياس الصحيح في الصك.
  7. يتم حساب كفاءة نكا التأسيس كالنسبة بين الأسفار العينة والأسفار التي تم الحصول عليها من التعبير عن اجفب البرية من نوع. يتم تطبيع كافة القيم إلى الأسفار متشيري.
    Equation 1

2-الوراثية إدماج ncAAs في جبكرس كروسلينكينج صور رسم الخرائط ليجند GPCR التفاعلات (الشكل 3)

  1. الحفاظ على خلايا HEK293T في دميم وتستكمل مع 10% (v/v) FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
  2. الخلايا في اليوم السابق تعداء من البذور.
    1. فصل الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في 0.05% التربسين/برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.5 مم يدتا. استخدم 1 مل التربسين/يدتا لطبق 10 سم. آرو مع 10 مجلدات متوسطة كاملة وريسوسبيند الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. حساب عدد الخلايا في تعليق استخدام هيموسيتوميتير49.
    2. بذور 5.0 × 105 293T الخلايا كل بئر في 2 مل كاملة النمو المتوسطة في لوحات 6-جيدا. لكل موقف فحص، إعداد 1 جيدا كل يجند بالإضافة إلى بئر واحدة33،عنصر تحكم الربط38. قد يدرج بئر إضافي يكون transfected مع مستقبلات البرية من نوع (wt) للتحقق من مستوى التعبير المسخ.
  3. اليوم، وبعد السيطرة على التقاء (المنطقة التي تحتلها الخلايا) تحت مجهر. ترانسفيكت الخلايا عند التقاء ~ 70% استخدام بي.
    1. إضافة ح 1 قبل تعداء، عُزي إلى جميع الآبار بتركيز نهائي من 0.5 مم.
      1. إعداد حل أسهم 0.5 M عُزي. كل لوحة 6-جيدا، وتزن 1.2 ملغ عُزي في أنبوب وحله في 15 ميليلتر 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم. تمييع الحل الأسهم في المتوسط 1.2 مل كاملة وإضافة 200 ميليلتر من الخليط لكل بئر.
        ملاحظة: تعد حلاً أسهم طازجة من عُزي لكل تجربة. مجموعة أزيد نصف عمر قصيرة في المحاليل، لا سيما على درجة الحموضة الأساسية، ويشتمل أزيرس حالها، بل أيضا شكل المتدهورة.
    2. مبلغ إجمالي قدرة 2 ميكروغرام الحمض النووي كل بئر ترانسفيكت: 1 ميكروغرام من بلازميد الترميز لهذه العملية معلم العلم آخذة كودون علامة في الموضع المطلوب و 1 ميكروغرام من بلازميد الترميز لزوج متعامد مكرسة عُزي (E2AziRS51 و 4 نسخ قرابة يام بتوقيت جنوب بريطانياالقامع-الحمض الريبي النووي النقال)33،38.
      ملاحظة: عندما بما في ذلك مقارنة wt للتحقق من مستويات التعبير، ترانسفيكت كمية أقل من بلازميد الحمض النووي لمستقبلات wt. اعتماداً على هذه العملية، 0.2-0.5 مكغ بلازميد ترميز wt مستقبلات مستويات الغلة مماثلة ك 1.0 ميكروغرام من بلازميد المسخ. ترانسفيكت نفس الكمية من الحمض النووي في جميع الآبار، يملأ الحمض النووي المفقودين مع وهمية (على سبيل المثال موجه فارغ).
    3. المضي قدما كما هو موضح في 1.3.3-1.3.5.
    4. المضي قدما أما مع الخطوة 2.4 لصور--كروسلينكينج يغاندس تعداء بعد 48 ساعة، أو انتقل إلى الخطوة 2، 5 للحصاد المباشر والتحليل للتحقق من مستقبلات التعبير.
  4. صور--كروسلينكينج ليجند.
    1. إعداد حل أسهم يجند 1,000 x. حل يجند الببتيد بتركيز 100 ميكرومتر في [دمس].
      ملاحظة: يعتمد تركيز يجند على ثابت التفكك كد التفاعل GPCR يجند. تركيز نهائي العاشر 100 كد المفضل. إذا كان يجند الببتيد ملح حمض تريفلورواسيتيك (تفا)، تنظر في وزن تفا عند حساب الوزن الجزيئي (1 x TFA كل الأحماض الأمينية الأساسية في الببتيد). أيضا، نرى أن الببتيدات في العام بلوري. تجنب تكرار تجميد مسحوق الببتيد وفتح حاوية ببتيد ابدأ حتى أنه لم يبلغ درجة حرارة الغرفة.
    2. تمييع 1:1,000 حل الأسهم يجند في المخزن المؤقت ملزم يتألف من 0.1% جيش صرب البوسنة، 0.01 ٪ تريتون العاشر 100، 5 مم مجكل2 في المخزن المؤقت للانفصال حبيس (المحاسب) التي تحتوي على حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 12.5 ملم 4 (حبيس)-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 140 ملم كلوريد الصوديوم و 5 ملم بوكل. تحضير 1 مل كل عُزي GPCR المسخ. استبدال المتوسطة الخلية مع 1 مل من يجند الحل. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
      ملاحظة: ضبط وقت الحضانة إلى GPCR محددة، المحاسبة لاستيعاب حركية ومستقبلات يجند. إطالة فترة حضانة لا تحسين غلة crosslinking.
    3. تشعيع العينات لمدة 20 دقيقة في كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر مع 5 × 8 ث أنابيب و ~ مسافة 5 سم للخلايا. فصل الخلايا من بيبيتينج وتحويلها إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل. بيليه الخلايا لمدة 3 دقائق في 800 x ز وتجاهل المادة طافية.
    4. حل قرص مثبطات البروتياز (PI) كوكتيل في 1 مل 25 مم يدتا/ح2س جعل حل أسهم 50 x. الكوة بي الأسهم الحل وتخزينها في-20 درجة مئوية. تمييع الأسهم 50 x 01:25 في المحاسب وريسوسبيند الكريات الخلية في 50 ميليلتر من 2 × PI في المحاسب. فلاش-تجميد الخلايا في السائل ن2.
      ملاحظة: ارتداء نظارات حماية العين. عند هذه النقطة، يمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. تابع مع الخطوة 2.6.
  5. الحصاد الخلية مباشرة.
    1. نضح المتوسطة. إضافة 800 ميليلتر من 0.5 مم يدتا في المحاسب. احتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت أو على الجليد.
    2. فصل الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتحويلها إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل. إضافة 200 ميليلتر من 5 مم مجكل2 في المحاسب. بيليه الخلايا لمدة 3 دقائق في 800 x ز وتجاهل المادة طافية.
    3. ريسوسبيند الكريات الخلية في 50 ميليلتر من 2 × PI في المحاسب وتجميد فلاش في سائل ن2. ارتداء نظارات حماية العين.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  6. تحلل الخلية.
    1. ذوبان الجليد الخلايا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية 30-45 ثانية ودوامه بإيجاز. الاحتفاظ بعينات الباردة من الآن فصاعدا. بيليه الأغشية في 2,500 س ز و 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تجاهل المادة طافية، الذي يحتوي على الجزء الأكبر البروتينات سيتوسوليك.
    2. ريسوسبيند الكريات في 50 ميليلتر حبيس تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 مم HCl حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪، 1 ٪ X-100 تريتون، 1.5 مم مجكل2، 1 مم عطا، 1 مم DTT وأضاف طازجة 2 × كوكتيل PI. مزيج دقيق. الخلايا و 30 دقيقة على الجليد ودوامه كل 5 دقائق.
    3. تدور أسفل الحطام خلية ل 10 دقيقة في 14,000 س ز و 4 درجة مئوية. نقل المادة طافية على الفور إلى أنبوب رد فعل جديدة.
      ملاحظة: المضي قدما في التحليل الحق بعيداً. يمكن تخزينها في ليساتيس في-20 درجة مئوية، ولكن كل دورة تجميد أذاب يضعف نوعية النتائج.
  7. تحليل لطخة غربية.
    1. إعداد العينة وتأخذ 3-5 ميليلتر ليستي وملئه يصل إلى 7 ميليلتر مع ح22 إضافة سين ميليلتر م 1 DTT وميليلتر 3 4 x عينة المخزن المؤقت الذي يحتوي على 2% الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 10% وبرومفينول 0.04% مم 63 تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، الزرقاء. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. عندما يكون هذه العملية الغليكوزيلاتي وعصابات باهتة أو بقع مشكلة، عينات ديجليكوسيلاتي مع بنغازي و زيادة كثافة الإشارات وشحذ العصابات. استخدام 3-5 ميليلتر ليستي وديجليكوسيلاتي في إجمالي حجم 10 ميليلتر يتبع البروتوكول المورد. إضافة ميليلتر 3 4 x عينة المخزن المؤقت.
      ملاحظة: غالباً ما تكون بروتينات الغشاء الغليكوزيلاتي في العديد من المواقع والدول، مما يضعف نوعية القرار في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل. ومع ذلك، لا ديجليكوسيلاتي لا العينات لتحليل مستوى التعبير من طفرات عُزي-هذه العملية باستخدام الأجسام المضادة العلم لأنها ذات صلة بتقييم جزء الغليكوزيلاتي تماما، ناضجة مستقبلات على سطح الخلية.
    3. حل عينات عن طريق صفحة صحيفة بيانات السلامة القياسية ولطخة نقل البروتينات إلى غشاء PVDF.
      تنبيه: اكريلاميد الأعصاب. ارتداء القفازات وحماية العين.
    4. كتلة الغشاء ح 1 في الرايت أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الحليب المقشود 5% في تي تبس تحتوي على 20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 0.15 م كلوريد الصوديوم و 0.1% 20 توين.
    5. التحقيق الغشاء مع جسم المضادة يجند متبوعاً بالجسم المضاد الثانوي مترافق برنامج الصحة الإنجابية. أغسل بينهما مع TBS-ت. للكشف عن مستوى التعبير عُزي-هذه العملية، التحقيق في الغشاء مع جسم HRP تجارية (انظر الجدول للمواد).
    6. القيام برد فعل تشيميلومينيسسينسي المحسنة (القامة) باستخدام كاشف مسافنة محلية الصنع وكشف الإشارات لمدة 5 دقائق في الظلام.

3-فائق السرعة بيورثوجونال وسم من جبكرس في خلايا الثدييات الحية

ملاحظة: البروتوكول هو الأمثل للبئر 4 غرف كوفيرسليبس (المنطقة جيدا = 2.2 سم2). لأحجام مختلفة تماما، يجب تحجيم البروتوكول تبعاً لذلك.

  1. طلاء السطح من شرائح المجهر. القيام بالإجراء برمته تحت غطاء عقيمة.
    1. إعداد هيدروبروميد بولي-د-يسين (MW = 500-550 كاتشين) حل الأسهم (PDL) بتركيز 1 ملغ/مل في المخزن المؤقت بورات 50 مم (8.5 درجة الحموضة). تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. لا تجمده.
    2. تمييع PDL حل الأسهم 01:40 في المياه النقية فائقة العقيمة لتركيز 25 ميكروغرام/مل (العامل الحل) نهائي، ثم تصفية الحل من خلال عامل تصفية عقيمة 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: ويمكن تخزين الحل العامل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
    3. تغطي تماما أسفل كل من شريحة مجهرية جيدا مع 500 ميليلتر لحل عملي PDL. احتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت ونضح الحل العامل PDL.
      ملاحظة: ويمكن استخدام الحل العامل PDL يصل إلى ثلاث مرات. إذا كان الحل يحتاج إلى إعادة استخدامها، نقل الحل المستخدمة من الشرائح المغلفة بأنبوب عقيمة جديدة وتسمية الأنبوب تبعاً لذلك. ابدأ مزيج الحل المعاد تدويرها مع حل جديد.
    4. أشطف كل س 3 جيدا مع ~ 700 ميليلتر مياه نقية فائقة العقيمة واسمحوا جافة على الأقل 1 ح.
      ملاحظة: من المهم جداً شطف الآبار بدقة، كما بقايا الحل PDL السامة للخلايا. يمكن استخدامها على الفور للفحص المجهري الشرائح المغلفة أو تخزينها لفترة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجات مئوية.
  2. الحفاظ على خلايا HEK293T في دميم وتستكمل مع 10% (v/v) FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
  3. الخلايا في اليوم السابق تعداء من البذور.
    1. فصل الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في 0.05% التربسين/برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.5 مم يدتا. استخدم 1 مل التربسين/يدتا لطبق 10 سم. آرو مع 10 مجلدات متوسطة كاملة وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج. حساب عدد الخلايا في تعليق استخدام هيموسيتوميتير49.
    2. بذور 1.0 × 105 HEK293T الخلايا في البئر (منطقة cm ² 2.2) في 600 ميليلتر مجاناً صبغ دميم كاملة.
      ملاحظة: لأغراض التصوير، وأنها مريحة جداً للعمل منذ البداية في متوسط الذي لا يحتوي على أي صبغة. صبغة مجاناً دميم تركيبات متاحة تجارياً.
  4. التحكم الملتقى (المنطقة التي تحتلها الخلايا) تحت مجهر وترانسفيكت الخلايا في التقاء ~ 70% استخدام كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية.
    1. ح 1 قبل تعداء، تعد حلاً أسهم طازجة 100 مم من تكلفة الامتلاك الكلية * K في 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم و [دمس] 15% (v/v).
    2. كل جيدا، تخلط 3 ميليلتر من تكلفة الامتلاك الكلية * ك حل الأسهم مع 12 ميليلتر من 1 م حبيس الأس الهيدروجيني 7.4. بلطف إضافة الحل إلى الآبار لتكلفة الامتلاك الكلية نهائية * K تركيز 0.5 مم.
    3. إعداد مبلغ إجمالي قدرة 500 نانوغرام دنا كل بئر. في أنبوب ميكروسينتريفوجي، يؤدي إلى تمييع 200 نانوغرام pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-اجفب، 200 نانوغرام بلازميد ترميز/tRNAAFبيلرس ميغابايتبرونتوسوروس زوج متعامد (أربعة أشرطة للحمض الريبي النووي النقالM15) و 100 نانوغرام pcDNA3.1_Arrestin3 بلازميد في 50 ميليلتر المتوسطة (صبغ مجانية، وخالية من المصل، والمضادات الحيوية الحرة).
      ملاحظة: وبصفة عامة، تعداء المشارك من أريستين ليس من الضروري مراعاة استيعاب هذه العملية. بيد يسرع Arrestin3 المشترك ترانسفيكتينج تدخيل CRF1R، ومريحة للغاية عند تحليل تدخيل طفرات عديدة.
    4. تمييع ميليلتر 1.25 من الكاشف تعداء على أساس المادة الدهنية (2.5 ميليلتر الواحدة 1 ميكروغرام من الحمض النووي) في 50 ميليلتر المتوسطة (صبغ مجانية، وخالية من المصل، والمضادات الحيوية الحرة) وإضافة الحل إلى خليط الحمض النووي. دوامة فورا واحتضان 5-10 دقيقة في مجمعات الرايت إضافة الحمض النووي-الدهن في الخلايا.
      ملاحظة: في تجربتنا، transfected مورفولوجيا الخلايا باستخدام تعداء على أساس المادة الدهنية تبدو الفسيولوجية أكثر بالمقارنة مع الخلايا transfected مع بي. برينس تعطي درجة أعلى من الكفاءة تعداء، ينبغي أن يكون بي يفضل للمتلقين للمعلومات من التطبيقات مثل لطخة غربية، بينما تعداء على أساس المادة الدهنية خيار أفضل ترانسفيكت الخلايا لتصوير التجارب.
  5. ح 24 تعداء بعد، تسمية المستقبلات مع الأصباغ الفلورية.
    1. إعداد حل أسهم صبغ تيترازيني 0.5 مم في [دمس] و 10 ملغ/مل من الحمض النووي تلطيخ صبغ حل الأسهم في نقية فائقة H2o.
    2. نقل 100 ميليلتر المتوسطة من كل بئر في أنبوب 1.5 مل رد فعل. إضافة ميليلتر 1.8 الحل صبغ تيترازيني الأسهم وميليلتر 0.3 من الحمض النووي تلطيخ صبغ الأسهم الحل. نقل المتوسطة التي تحتوي على صبغات مرة أخرى إلى البئر واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: وقد صبغ تيترازيني-أورانج-فلوري بتركيز نهائي من 1.5 ميكرومتر.
    3. نضح المتوسطة وشطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة الزائدة من صبغة بلطف. إضافة 600 ميليلتر الكامل صبغ يسخن المتوسطة النمو الحر إلى 37 درجة مئوية.
  6. استيعاب الفحص المجهري ومستقبلات الأسفار.
    1. تصور مستقبلات المسمى تحت 63 x (أو ما شابه) التكبير باستخدام عوامل التصفية المناسبة للتجارة والنقل (λإس: 488 نانومتر؛ λم: 509 نانومتر)، صبغة اللون البرتقالي الفلورسنت (λإس: 550 نانومتر؛ λم: 570 نانومتر) والحمض النووي تلطيخ صبغ (λ إس: 350 نانومتر؛ Λم: 461 nm). التقاط صورة مع كل مرشح قبل تفعيل المستقبلات.
    2. تعزيز استيعاب مستقبلات استخدام 200 نيوتن متر Ucn1.
      1. إعداد حل أسهم 1,000 x Ucn1 من 200 ميكرومتر في [دمس].
        ملاحظة: تبعاً لقابلية ذوبان الببتيد، قد تتمكن من إعداد المخزون في المياه النقية أو المخزن المؤقت.
      2. نقل 100 ميليلتر المتوسطة من بئر في أنبوب رد فعل 1.5 مل وإضافة 0.6 ميليلتر من الحل الأسهم مؤثر الببتيد. نقل الخلف متوسطة في البئر.
      3. مراقبة الاستيعاب الداخلي تحت المجهر. التقاط الصور بعد وقوع الكشف الواضح لاستيعاب (10-15 دقيقة إلى ساعة، اعتماداً على مستقبلات و overexpression من أريستينس) باستخدام عوامل التصفية المذكورة سابقا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الخطوط العريضة للمقايسة الأسفار هو مبين في الشكل 1. الإنزيم يعمل في ثلاثة طلبات. في المقام الأول، يتم فحص عدد من المتغيرات الحمض الريبي النووي النقال لإدماج Lys(Boc) بزوج متعامد برونتوسوروس. Lys(Boc) هو من الأحماض الأمينية ستيريكالي مماثلة إلى برونتوسوروس. برونتوسوروس ليست متاحة تجارياً، أن Lys(Boc) يستخدم عادة كركيزة قياسية بيلرس. ترنس فرزهم تستند الحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس. ويتحمل كل متغير الحمض الريبي النووي النقال الطفرات قواعد واحدة أو زوج قاعدي في الحلقات وينبع عقلانية تهدف إلى تحسين الاستقرار الحمض الريبي النووي النقال، والتوافق مع الأجهزة متعدية حقيقية النواة. وصف كافة التفاصيل حول تصميم الحمض الريبي النووي النقال لدينا عمل الأخيرة30. النتائج النموذجية ويرد في الشكل 2 ألف: ترنس مختلفة تعطي الكفاءة قمع مختلفة، مما ينعكس بوضوح مبلغ fluorescence المقاسة. إظهار أشرطة خطأ صغير من تريبليكاتيس البيولوجية أن القيم استنساخه بدرجة عالية. في المقام الثاني، يتم تقييم الخيارين الجينات E2AziRS26،51، الذي يشتمل صور--كروسلينكير فأزيدو-Phe (العازي)،. E2AziRS مشتق من تيرس كولاي . يعمل أحد الجينات البديل الأصلي كولاي كودون الاستخدام، بينما الثاني كودون الأمثل للاستخدام في H. العاقل. ويبين المقايسة الأسفار أن البديل الأمثل كودون يعطي غلات البروتين (الشكل 2). أخيرا، يتم إدراج معدل الأحماض الأمينية المختلفة للكيمياء بيورثوجونال انقر فوق مقارنة (الشكل 2). جميع ncAAs المقدمة هنا (بكنك، TCO * K وسكوك) مدرجة بزوج مببيلرساف/ترنابيل متعامد نفسه. وهو مدرج أيضا بهذا الزوج Lys(Z) واستخدمت كعنصر إيجابي. لتوضيح مدى موثوقية المقايسة الأسفار، ونكا موازية إدماج تجارب أجريت على هذه العملية، CRF1R. أجرى تحليل لطخة غربية لتقدير التعبير هذه العملية (الشكل 2، ج). ولوحظت نفس الاتجاهات التي لوحظت مع اجفب في مقايسة الأسفار مع CRF1R. جدير بالذكر أن إدماج عُزي CRF1R تعززت جداً عند استخدام الجينات E2AziRS كودون-محسنة مقارنة بالجينات الأصلية، تبين أنه يمكن أن يكون حتى تحسن معتدل من 1.5-2-حظيرة لبروتين لذوبان (اجفب) وفقا للمقايسة fluorescence تأثير أكبر على مستوى التعبير أكثر تحديا غشاء بروتينات (الشكل 2). وكملاحظة عامة، فيما يتعلق بالعدد من أشرطة الكاسيت الحمض الريبي النووي النقال لاستخدامها لكل تطبيق، ينصح واحد فقط الحمض الريبي النووي النقال كاسيت عند فحص ترنس مختلفة بغية تسهيل إجراءات الاستنساخ. عند فحص نكارس مختلفة أو إدراج كفاءة ncAAs مختلفة بنفس زوج متعامد، يكرر أربعة جنبا إلى جنب للحمض الريبي النووي النقال كاسيت هي المفضلة لتحقيق غلات أعلى نكا التأسيس.

تم نشر النظام الأمثل لإدماج عُزي بما في ذلك الجين E2AziRS أنسنة خريطة جيب ملزم CRF1R وتحديد مسارات الربط من يغاندس مختلفة 5: يضع الببتيد هما Ucn1 ونموذج الإبلاغ الموحد، والخصوم الببتيد ثلاثة Ucn1(8-40)، نموذج الإبلاغ الموحد (9-41) و dFXCRF(12-41) (الشكل 3). بينما سابقا تبين فعالية إدماج عُزي الانخفاض عندما يقترب من ال33،ج GPCR تيرمينوس34، لدينا النظام الأمثل لإدماج عُزي يتيح مستويات التعبير قابلة للمقارنة من طفرات عُزي مع العلامة-مواقع في أجزاء مختلفة من الجينات هذه العملية (الشكل 4 أ). وتظهر النتائج في الشكل 4 باء فحص الحلقة خارج الخلية 2 (ECL2) واللولب V CRF1R كجزء ممثل جيب ملزم يجند. ويكشف عصابة في الحجم الصحيح للمنتج كروسلينكينج أن الموقف الذي تقع بالقرب من يجند داخل مجمع مستقبلات يجند، أي أنها جزء من جيب ملزم. تم العثور على عدة مرات crosslinking مع يغاندس كل اختبار، وتكشف عن أنماط ملزمة مميزة ليضع الببتيد والخصوم. جدير بالذكر أن نمط يضرب crosslinking يوفر معلومات حول العناصر الهيكلية للمستقبلات. وتقترح عددا من الزيارات المتتالية، كما لاحظ في ECL2 (مواقع F260-R263 في تركيبة مع الخصوم) منطقة حلقة مرنة. نمط مرات العثور على كل مخلفات ثلاثة أو أربعة كما في تلميحات الخامس (D269/Y270، Y272/Q273، I277) الحلزون نحو بنية حلزونية. يمكن توسيع الشاشة لكافة المجالات ذات الصلة لهذه العملية. إذا كانت بنية ثلاثية الأبعاد أو نموذج جزيئي للمستقبلات موجودة، يمكن تصور أقدام يجند بتسليط الضوء على يضرب كروسلينكينج لكل يجند (الشكل 5).

الأسفار وبيانات لطخة غربية (الشكل 2) تشير إلى أن تكلفة الامتلاك الكلية * K هو نكا للكيمياء بيورثوجونال أن يحصل أدخلها بيلرس ميغابايتAFبكفاءة أعلى. مختلفة بيلرس طفرات قد تعطي غلات التأسيس الأخرى ncAAs انقر فوق17، ولكن التي لم يتم اختبار في هذه الدراسة. تكلفة الامتلاك الكلية * K أدمجت في بروتين انصهار CRF1R-اجفب، وتمكين تثبيت عبر سبدك الكيمياء (الشكل 6A) فلوروفوري مشرق صغيرة على المستقبلات (الشكل 6B). كدليل على تسمية محددة، الأسفار التسمية يجب أن تكون مرئية فقط في خلايا التعبير عن المستقبلات (الخلايا الخضراء في الشكل 6B) وليس في الزنزانات المظلمة، وبالتالي توفر رقابة داخلية سلبية في كل تجربة. مستقبلات المسمى باستخدام الكيمياء سبيداك فائق السرعة لا تزال وظيفية. بعد إضافة مؤثر ببتيد، لوحظت المقصورات الفلورسنت طوال سيتوسول، الكشف عن هذه العملية الفسيولوجية لاستيعاب هذه العملية (الشكل 6). إشارات اجفب تنصهر مترجمة شارك مع صبغة الفلورسنت في جميع الأوقات، تؤكد العلامات بيورثوجونال انتقائية لهذه العملية.

Figure 1
الشكل 1: التحليل القائم على الأسفار لتقييم كفاءة قمع كودون التوقف. خلايا HEK293 المشترك transfected مع والبلازميدات هما حضور ncAA. بلازميد واحد يشفر نكارس المرجوة والقامع-الحمض الريبي النووي النقال. بلازميد الثانية ترميز للجينات اجفب تحمل كودون وقف علامة في موقع متساهلة مع عنصر تحكم مشري. يومين بعد تعداء، ومضان أخضر وأحمر من ليساتيس كامل الخلية تقاس في قارئ لوحة. ك N اجفب-الجزء المنبع كودون التوقف (رمادي) لا فلوري، العائد من طول اجفب (الأخضر) مباشرة يرتبط بكفاءة نكا التأسيس، بينما متشيري (أحمر) يوفر مرجع مستقل للتطبيع. كفاءة نظام متعامد تعطي النسبة بين مبلغ اجفب التي تم الحصول عليها عن طريق قمع كودون التوقف ومقدار البرية من نوع اجفب التي تم الحصول عليها من الترجمة العادية (لا قمع العنبر). يتم تعديل هذا الرقم من سيرفلينج, R. & عمله، الأول؛ إدراج غير طبيعي من الأحماض الأمينية في البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات، طرق في علم الإنزيمات، 2016، 580، 89-107. 29 يسمح بالاستنساخ "مركز إزالة حقوق الطبع والنشر للسفير". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تطبيقات تمثيلية للمقايسة الأسفار. (أ) فحص للحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس المتغيرات30. خلايا HEK293 تم transfected اشتركت مع بلازميد مراسل ووالبلازميدات ترميز لزوج بيلرس/الحمض الريبي النووي النقال ميغابايت(إحدى نسخ الحمض الريبي النووي النقال). تمثل الأشرطة fluorescence النسبي من اجفب التي تم الحصول عليها من إدراج Lys(Boc) مقارنة بالبرية من نوع اجفب. (ب) تقييم تأثير استخدام كودون للجينات نكارس. (اللوحة اليمنى) الأسفار بالانزيم من الخلايا transfected مع الخيارين جينات مختلفة من E2AziRS. (1) كودون الاستخدام من كولاي والجينات (2) أنسنة. (اللوحة اليمنى) تحليل لطخة غربية CRF1R95Azi-العلم. تم الكشف عن مستقبلات كامل طول بجسم المضادة علم. أكتين استخدمت بيتا كتحميل عنصر التحكم. (ج) تقييم فعالية إدماج ثلاثة ncAAs مصممة للكيمياء بيورثوجونال. (اللوحة اليمنى) هياكل ncAAs المستخدمة في هذه التجربة. (1)، الذي كان يستخدم كمراقبة إيجابية، (2) بكنك، (3) تكلفة الامتلاك الكلية * K وسوك (4). (لوحة المركزية) الأسفار بالانزيم من الخلايا HEK293 transfected مع بلازميد ترميز بيلرس ميغابايتAF وأربع نسخ من tRNA15 من (أ) إلى إدراج (1)، (2)، (3) و (4). (اللوحة اليمنى) الغربية لطخة تحليل متحولة CRF1R-علم تحمل أحد ncAAs الأربعة في موقف 95. أكتين استخدمت بيتا كتحميل عنصر التحكم. الفريق ألف كان مقتبس من سيرفلينج، ترنس R. et al. مصمم لإدراج كفاءة من الأحماض الأمينية غير المقبول بنظام بيروليسيني في خلايا الثدييات "الأحماض النووية القرار" 46 (1)، 1-10 (2018) وترد وفقا جميل إسناد رخصة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : التمثيل التخطيطي لتعيين صور crosslinking عُزي بوساطة- دالة أزيدو صور--أكتيفاتابل (نجمة صفراء) يوضع في موضع محدد داخل المستقبلات (رمادي). عندما يقع الفريق أزيدو الدانية ليجند منضم (أحمر)، منتج crosslinking التساهمية تتكون عند إشعاع الأشعة فوق البنفسجية (دائرة صفراء تشير إلى الموقع كروسلينكينج). دمج مجموعة أزيدو في المواقف المختلفة للمستقبلات يكشف سطح ملزم (الأرجواني) [ليغند]، الذي يمثل جيب ملزم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : إدراج عُزي في جميع أنحاء CRF1R لرسم الخرائط crosslinking صور جيب ملزم. (أ) مقارنة مستويات التعبير من طفرات عُزي-CRF1R-علم نحو مستقبلات البرية من نوع. يتم توزيع المواقع إدراج عُزي طوال مستقبلات أكمله كما هو مبين في الصف العلوي. تظهر البقع الغربية المناهضة العلم من ليساتيس كامل الخلية. أكتين استخدمت بيتا كتحميل عنصر التحكم. (ب) سبر البقع الغربية مع أما مكافحة-نموذج الإبلاغ الموحد أو تظهر الأجسام المضادة Ucn1. يتم الإشارة إلى بقايا محله عُزي في الصف العلوي. كانت المحتضنة الخلايا مع يغاندس المسرودة على اليمين، يليه إشعاع الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر وتحلل. كانت تحل هذه العينات على 10% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، ديجليكوسيلاتيد باستخدام بنجاسي و وتحليلها بواسطة النشاف الغربية. يمتد المجمع يجند-CRF1R ديجليكوسيلاتيد في ميغاواط الظاهر ~ 40 كاتشين33. ولا يجند كروسلينكيد غير المكتشفة (كاتشين ميغاواط ~ 3-4). تم تعديل كلا الفريقين لهذا الشكل من سيدل، L. et al. الهيكلية من التبصر في تفعيل مستقبل فئة ب ز-البروتين-مقرونة بالهرمونات الببتيد في الخلايا البشرية يعيش. Elife- 6 10.7554/eLife.27711، وهي مستنسخة وفقا للترخيص "الإبداعي العموم الإسناد". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : آثار أقدام يضع الببتيد والخصوم على الفئة ب GPCR CRF1R. تمثيل المجال ترانسميمبراني CRF1R السطحية. مواقف CRF1R كروسلينكيد أن يسلط الضوء على يجند عند استبدال بواسطة عُزي. ويبرز آثار أقدام ليضع الببتيد Ucn1 ونموذج الإبلاغ الموحد أرجواني، آثار أقدام الخصوم نموذج الإبلاغ الموحد (9-41) و Ucn1(8-40) باللون الأزرق. يتم تمييز البصمة من خصم dFXCRF(12-41) اللون البرتقالي. يتم الإشارة إلى سبعة لوالب transmembrane من الأولى إلى السابعة بأرقام رومانية. (أ) (ب) آراء الجانب جيب ملزم من الطائرة الغشاء. (ج) أعلى طريقة العرض إلى جيب ملزم من الجانب خارج الخلية. طبع من سيدل، L. et al. الهيكلية من التبصر في تفعيل مستقبل فئة ب ز-البروتين-مقرونة بالهرمونات الببتيد في الخلايا البشرية يعيش. Elife- 6 10.7554/eLife.27711، وهي مستنسخة وفقا للترخيص "الإبداعي العموم الإسناد". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : وسم سبدك من CRF1R على الخلايا الحية. (أ) رد فعل مخطط من سيكلواديتيون ديلز-الدر تروج لها سلالة معكوس إلكترون-الطلب (سبيداك): مجموعة ترانس-سيكلو-2-الأوكتين نكا TCO * ترتبط ك يتفاعل مع مجموعة تيترازيني فلوروفوري Cy3. (ب، ج) خلايا HEK293T التعبير عن CRF1R95TCO * K-اجفب. صور الممثل لقناة الأخضر والأحمر والأزرق. حجم شريط مقياس من 10 ميكرون. (ب) الخلايا تعامل مع تيترازيني-Cy3 (1.5 ميكرومتر) لمدة 5 دقائق. إظهار الخلايا فقط التعبير عن المستقبلات (الأخضر) حدوث وضع العلامات (أحمر). (ج) الخلايا تعامل مع 200 نانومتر Ucn1 وتصويرها بعد 15 دقيقة داخل الخلايا حويصلات تتوافق مع مستقبلات المدخلة. يتم تعديل لوحات ب وج من سيرفلينج، ترنس R. et al. مصمم لإدراج كفاءة من الأحماض الأمينية غير المقبول بنظام بيروليسيني في خلايا الثدييات القرار الحمض النووي 46 (1) 1-10 (2018) (مطبعة جامعة أكسفورد)، وهي مستنسخة وفقا للترخيص "الإبداعي العموم الإسناد". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويصف البروتوكول مقايسة بسيطة وموثوق بها تقييم الكفاءة لأزواج متعامد لإدماج ncAAs في البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب فيما يتعلق بالاختبارات المستخدمة على نطاق واسع يستند إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية هو أنه يسمح بإعداد المتزامنة وقياس لعدد أكبر من العينات، ويوفر البيانات التي يتم تحليلها بسهولة باستخدام برامج عادية. توفر أسلوب الإنتاجية المتوسطة لتحليل أزواج متعامد في خلايا الثدييات مهم جداً لتطوير أزواج متعامد جديدة وتحسين القائم منها. وفي الواقع، من غير الممكن القيام بالتطور الموجه لأزواج المتعامدة عن طريق توليد مكتبات عشوائية كبيرة واختيار الميت/على قيد الحياة في نظم الثدييات. يسمح الفحص المكتبات الفرز الصغيرة الحجم (مئات من أعضاء) باستثمار جهد معقول تجريبية خلال فترة زمنية قصيرة نسبيا. بفرز مجموعات الحمض الريبي النووي النقال عقلانية المصممة عن طريق هذا التحليل، يمكن أن تتولد لدينا ترنس الرواية التي تعزز إلى حد كبير كفاءة نظام بيروليسيني30. يتم استخدام تركيبة كلاسيكية اجفب/مشري للقراءة الفلورسنت، حيث اجفب يعمل كمراسل لإدماج الكفاءة ومشري كالمراقبة الداخلية. المراسل اجفب ومراقبة متشيري هي كان يؤوي في بلازميد نفس ولكن تكمن في اثنين من أشرطة الكاسيت التعبير منفصلة تحمل اثنين من المروجين مستقلة. وبهذه الطريقة، التعبير مشري تتعلق بالكفاءة تعداء وعدد الخلايا، ولكن هو مستقلة عن التعبير اجفب، بحيث يمكن تطبيعها الفلورية الخضراء المقاسة للأسفار أحمر. وهذا ليس بالضبط حالة الصحفيين أخرى بنيت جنبا إلى جنب من البروتينات هما مثل اجفب-العلامة-مشري7 والتجارة والنقل إيرفبY39TAG (مع إيرفب تدل على بروتين فلوري الأشعة تحت الحمراء)52. في هذه الثوابت، البروتينات على حد سواء على نفس النسخة مرناً. في حقيقيات النوى، الخضوع مرناس واضعة codons أوقفوا سابقا لأوانه المراقبة وتدهور ب الآلية تسوس هراء بوساطة (القذائف)53. ولذلك، كل تسلسل المراسل والمراقبة المتدهورة في وقت واحد والتعبير عن اثنين من الجينات ليست مستقلة تماما. كانت فحوصات مماثلة استناداً إلى مراسل لوسيفراس بدلاً من مراسل الأسفار ووصف آخرون54،55. بينما يقدم التﻷلؤ الانزيمية حساسية أعلى من قياسات الأسفار، هذا الأخير أظهر إمكانية تكرار نتائج أعلى بين مجموعات مختلفة من الخلية.

نظم قوية لإدراج نكا في خلايا الثدييات ضرورية على الإطلاق عند العمل مع مطالبين بأهداف البروتين مثل البروتينات الغشاء والبروتينات وفيرة منخفضة. وقد أظهرنا هنا زوج متعامد أمثل لإدماج قوية من نكا الصور أكتيفاتابل عُزي إلى جبكرس. ويعطي النظام عُزي إدراج معدلات متجانسة في جميع أنحاء مستقبلات أكمله تسمح لرسم خرائط صور crosslinking منهجي كامل GPCR الأسطح وتحديد مواقع ملزم يجند. هي النقاط الرئيسية اثنين من قوة الأسلوب أن يغاندس مختلفة يمكن تحليلها على مستقبلات نفسه في نفس الوقت، وأن البيانات مستمدة من المستقبلات في الخلية الحية، التي تكمل المعلومات التي تم الحصول عليها من النهج في المختبر . الأسلوب هو في المبدأ الذي ينطبق على أي هدف البروتين، وهي مناسبة أيضا لتعيين طبولوجيا لتفاعلات البروتين البروتين. وعلاوة على ذلك، يمكن زيادة تحليل مجموعة فرعية محددة من المواقف كروسلينكيد مع كروسلينكينج ثنائي الأبعاد الجزيئات أزواج من الأحماض الأمينية الدانية نقطة دبوس في المعقدة المرتبطة بها33،38. توفير أزواج من الأحماض الأمينية مثل هذه القيود المكانية التي يتم تطبيقها على تجارب في السيليكون لبناء نماذج جزيئية دقيقة من33،التفاعل38. من وجهة نظر منهجية، تجدر الملاحظة أنه ينبغي النظر في النتائج الإيجابية الوحيدة من التجارب كروسلينكينج. يمكن أن تكون موقفا ولم لا التشعب داخل دائرة نصف قطرها الحرجة من يجند. يمكن أن تحدث سلبيات كاذبة عند الطفرة عرضته crosslinker يعوق التفاعل الأصلي، ولكن يمكن أن يحدث أيضا عندما crosslinking moiety يشير بعيداً عن [ليغند]، أو هو مروي المذيب، أو يخضع كروسلينكينج إينتراموليكولار. جزء حاسم من الأسلوب كيفية الكشف عن حدوث كروسلينكينج. في المقام الأول، يتم حل كامل الخلية ليساتيس على صفحة الحزب الديمقراطي الصربي لفصل يجند أي التي لا ترتبط المستقبلات تساهمي. ثانيا، يتم الكشف عن مجمع مستقبلات يجند التساهمية عبر النشاف الغربية استخدام جسم يجند المضادة. يغاندس الببتيد، عالية تقارب [بولكلونل] أجسام المثارة ضد يجند هي الخيار الأمثل. وكبديل لذلك، يمكن تجهيز الببتيد يغاندس مع علامة إشارة إلى موقف متساهلة، شريطة إتاحة العلامة للأجسام المضادة العلم من خلال فاصل مناسب. يمكن أيضا استخدام العلامات البيوتين، على الرغم من أن النتائج قد يكون من الصعب تفسير سبب الخلفية بالبروتينات بيوتينيلاتيد الذاتية. عادة ما يتم راديولابيليد يغاندس جزيء صغير، على الرغم من أن العلامات علامة قد تكون أيضا ممكن56،57. بروتوكولات لإدماج عُزي في جبكرس وقد نشرت أيضا قبل الآخرين57،،من5859. ومع ذلك، هذه البروتوكولات تنطوي على استخدام والبلازميدات ثلاثة لإدماج عُزي، بينما نحن نستخدم نظام أبسط بلازميد اثنين، بما في ذلك جين أنسنة E2AziRS، الذي يعطي نتائج أفضل فيما يتعلق غير كودون-محسن واحد (الشكل 2).

تقنيات الفحص المجهري الحديثة تتطلب تثبيت fluorophores مشرقة جداً وتتسم بالكفاءة في بروتين الفائدة، ك fluorophores البروتين المرمز وراثيا مثل اجفب الكلاسيكية ليست مناسبة للتطبيقات المتطورة. ولذلك، هناك بحث مستمر للأساليب التي تمكن من تثبيت fluorophores العضوية على البروتينات، مما أدى إلى تنمية شعبية الأداة60 والعلامات61 هالو، بين آخرين. ومع ذلك، لا تزال هذه العلامات ذات حجم كاتشين عدة، مما قد التشويش وظيفة البروتين المستهدف ويترك قدرا كبيرا من عدم يقين كبيرة حول الموضع الدقيق فلوروفوري. مع حجم الحد أدنى لعدد قليل من الأحماض الأمينية، يمثل فكرة تيتراسيستيني أصغر بديل لوصف أكثر دقة باستخدام فلوريسسين أو ريسوروفين62،مركبات أرسينيكال (فلاش، ريش)63. على الرغم من أن هذا النهج قد طبق بنجاح كبير أيضا GPCR الدراسات64،،من6566، فإنه يتطلب خطوات الغسيل واسعة النطاق مع ثيولس وأنها تعاني كثيرا من خلفية عالية، وعلى أية حال، فإنه لا يسمح تعيين موضع التسمية بقرار واحد للمخلفات. بدلاً من ذلك، تقدم ncAAs مجهزة بيورثوجونال المراسي إمكانية تركيب تسميات الفلورسنت في موضع واحد من الأحماض الأمينية، وبالتالي تقليل مخاطر التدخل مع تكيف الأصلي والأداء الوظيفي للبروتين الهدف. NcAAs الجيل الأخير للكيمياء بيورثوجونال، مثل تكلفة الامتلاك الكلية * ك13 يعملون هنا، مكنت البروتين العلامات مباشرة على الخلايا الحية17،43. الأسلوب المنطبق على أهداف البروتين على سطح الخلية، ولكن أيضا على أهداف داخل الخلايا، شريطة أن تكون الأصباغ نفاذية الخلية المناسبة المتاحة17،،من6768. كيمياء سبدك عدة أوامر من حجم أسرع فيما يتعلق بتشجيع سلالة أزيدو-ألكاين سيكلواديشن (سباك) والمراسي ليجيشنز "بيرتوزي شتاودنغر" في أزيد2،13. وفي الواقع، قد نشرت عدة بروتوكولات لإدراج هذه العملية وضع العلامات على وراثيا عُزي، ولكنها تنطبق فقط على عزل جبكرس في المختبر37،،من5969. بدلاً من ذلك، وقد أثبتنا هنا على نحو سلس وسم بيورثوجونال من جبكرس الفنية في الخلية الحية. لدينا البروتوكول مشابه للبروتوكولات القائمة باستخدام نفس الكيمياء43،،من4870، ولكن نظامنا إدماج نكا الأمثل يوسع نطاق الأسلوب إلى دراسات هذه العملية. خطوة حاسمة في الإجراء التجريبي هو اختيار الموقف لتبادلها مع تكلفة الامتلاك الكلية * K، كما لا جميع الوظائف داخل المستقبلات متساهلة لاستبدال أو موجوداً بصبغة الفلورسنت. ولذلك، ينبغي اختبار عدة مناصب في شاشة أولى للبحث عن أنسب.

وفي الختام، يقدم هذا العمل أدوات للتطبيق العام ل ncAAs، بما في ذلك تطبيق لتحدي الأهداف البروتين مثل جبكرس. ونحن نتوقع أن خرائط الصور-crosslinking وبيورثوجونال العلامات، في أيامنا هذه التطبيقات الرئيسية ل ncAAs إلى دراسات هذه العملية، سوف تجد العديد من التطبيقات المستقبلية على حد سواء لكشف النقاب عن طبولوجيا GPCR التفاعلات مع يغاندس أو غيرها من البروتينات ودراسة هذه العملية الديناميات الهيكلية في الخلية الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب على لا تعارضات أن تعلن.

Acknowledgments

تم تأسيس هذا العمل قبل الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) ضمن المنح CO822/2-1 (برنامج إيمي نويثر) و CO822/3-1 إلى جيم

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

الكيمياء، 134 قضية، المتعارف عليه عدم قمع كودون وقف الأحماض الأمينية (نكا)، العنبر، إدماج الكفاءة، متعامد الأمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز/الحمض الريبي النووي النقال أزواج، crosslinking صور رسم الخرائط، واجهات ملزمة البروتين، والكيمياء بيورثوجونال، مجهر الأسفار
تحسين إدماج الجينية الكيميائية تحقيقات في جبكرس لرسم خرائط الصور-crosslinking والكيمياء بيورثوجونال في خلايا الثدييات الحية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Serfling, R., Seidel, L.,… More

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter