Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57069
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences, University of Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

Abstract

שילוב גנטי של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) דרך ענבר stop codon דיכוי היא טכניקה חזקה להתקין מלאכותי כשמכשיר ורובוט moieties תגובתי על גבי חלבונים ישירות בתא בשידור חי. כל המכללות מעוגנת מאת ייעודי אורתוגונלית משתיק קול-tRNA/אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר (AARS) זוג זה מיובא לתוך האורגניזם המארח. היעילות התאגדות של ncAAs שונים יכול מאוד שונים זה מזה, משביע רצון במקרים מסוימים. זוגות אורתוגונלית יכולים להשתפר על ידי מניפולציה של AARS או של tRNA. עם זאת, אבולוציה מכוונת של tRNA או AARS באמצעות ספריות גדולות ושיטות בחירה המלח/חיה אינם ריאלי בתאי יונקים. כאן, מוצג נתיישב וחזק מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית בתאי יונקים. הבדיקה מאפשרת הקרנת עשרות למאות גרסאות AARS/tRNA עם מאמץ מתון, בתוך זמן סביר. שימוש assay הזה כדי ליצור tRNAs חדשים המשפרים באופן משמעותי את היעילות של מערכת אורתוגונלית פירוליזין מתואר, יחד עם היישום של ncAAs במחקר של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), אשר הם מאתגרים אובייקטים עבור ליגת המכללות מוטגנזה מכוונת. ראשית, משלבים באופן שיטתי של ncAA צילום-crosslinking לאורך כל השטח חוץ-תאי של קולטן, אתרי קישור של ליגנדים שונים על הקולטן שלם ממופות ישירות בתא בשידור חי. השני, על ידי שילוב מהדור האחרון ncAAs GPCR, קולטן ללא זרז מרביים תיוג עם תיוג הפלורסנט הוכח, אשר מנצלת את bioorthogonal זן-קידום הפוך תגובת דילס אלדר cycloaddition (SPIEDAC) על התא בשידור חי. כפי ncAAs ניתן להחיל באופן כללי על כל חלבון באופן עצמאי על גודלו, השיטה היא עניין כללי עבור מספר יישומים. בנוסף, התאגדות המכללות אינו דורש שום ציוד מיוחד, מתבצע בקלות במעבדות לביוכימיה סטנדרטי.

Introduction

שילוב גנטי של הגששים כימי לחלבונים היא שיטה חזקה כדי להקל על החקירה של היבטים מבניים ודינאמי של פונקציה של חלבונים ישירות בהקשר מקורית של תא חי. כיום, מאות חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) מצוידים עם הקבוצות כימיים שונים ביותר שניתן site-specifically לשלב חלבונים על ידי ביוסינטזה1,2,3,4. ביניהם, אחד מוצא צילום רגיש ncAAs כגון צילום-crosslinkers5, בכלוב צילום6,-7,-8,-9 חומצות אמינו צילום-להחלפה10, 11, חומצות אמיניות הנושאים מאומצות alkenes ו alkynes bioorthogonal ללא זרז כימיה2,12,13,14,15,16 ,17חומצות אמינו נושאת dansyl18קומרין9,19, fluorophores21 prodan20,, חומצות אמינו מצויד הגששים biophysical אחרים כמו . טוב כמו עם פוסט שינויים translational1,2,3,4,22,23,24,25.

קידוד גנטי של ליגת המכללות מופעלת כברירת ייעודי אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר (AARS) לקשר של cognate משתיק קול-tRNA, אשר משלבת ncAA בתגובה ענבר stop codon במהלך הסינתזה ribosomal רגיל. ncAARS/tRNA זוגות מתוכננים כדי להיות אנכיים בתוך האורגניזם המארח, קרי לא צולבות לדבר עם זוגות אנדוגני. הטכניקה היא מבוססת היטב הן prokaryotic ו האיקריוטים המארחים והן בקלות החלים בתרבית של תאים. זוגות של התאגדות המכללות בתאים בתרבית של מבוססים על שלוש השיטות העיקריות אורתוגונלית: מערכת tyrosyl, המשלב את TyrRS של e. coli26 עם משתיקול ענבר tyrosyl מ- stearothermophilus נולד ב-27 (Ec TyrRS / זוג יםבסט), e. coli leucyl מערכת (EcLeuRS/tRNALeuצ'ואה צמד)6,18,28 ומערכת pyrrolysyl archaeal (PylRS/tRNA Pyl זוג)3, לפיה tRNAPyl זה משתיקול ענבר טבעי. באופן כללי, בכל המכללות מזוהה על-ידי ncAARS מיוחדים. בהתאם למבנה של ncAA, ncAARS, מתקבל באמצעות אבולוציה מכוונת של TyrRS, LeuRS או PylRS, למרות כמה synthetases יכול לקבל ncAA אחד או יותר.

הזוג אורתוגונלית מיובא לתוך התאים על ידי שימוש פשוט וקטור פלסמיד. פלסמידים נפוץ ויעיל ביותר bicistronic, לקודד גם את המעביר וגם את סינתזת ויוצרים זוג אורתוגונלית29. השני פלסמיד קידוד החלבון עניין הנושאת codon ענבר באתר המיועד השינוי הוא transfected משותפת. מדיום הגידול תא פשוט נוסף ncAA. עם זאת, קבוצות מיוחדות שונות מרבים להשתמש וריאציות שונות של פלסמיד בונה גם עבור שילוב של ncAA באותה. מבנים שונים בהסדר של הגנים וקטור, סוג המעביר, השימוש codon המעביר גנים, יזם שימוש, וריאנט של tRNA, מספר קלטות ביטוי tRNA. יתר על כן, היעילות התאגדות של ncAAs שונים יכול להשתנות באופן דרסטי עקב יעילות קטליטי שונים synthetases שונים, על האיכות של tRNA, ועל אחרים גורמים30. לכן חשוב שתהיה בהישג יד שיטה מהירה ואמינה כדי להעריך את היעילות של זוג אורתוגונלית, לבחור את המערכת המתאימה ביותר עבור יישום הרצויה וגם לבצע כמה פעולות אופטימיזציה לשיפור שהביטוי חלבון התשואות.

הקמנו פשוט וחזק מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית29 (איור 1). ב וזמינותו, התאים הם שיתוף transfected עם פלסמיד קידוד בשביל זוג אורתוגונלית, יחד עם פלסמיד כתב bicistronic קידוד הן חלבון פלואורסצנטי ירוק הנושאת של ענבר stop codon במיקום מתירניות (EGFPתג) ו ג'ין mCherry. קרינה פלואורסצנטית אדום וירוק של כל תא lysates נקראים בערוצים נפרדים על קורא צלחת, צלחת 96-ובכן. עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק להרכב ישירות היעילות של דיכוי ענבר, ואילו עוצמת פלואורסצנטי אדום נותן הערכה ישירה של גודל המדגם נמדד ואת היעילות תרביות תאים. לגבי מבחני דומה המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית תא בסיוע מיון (FACS) לקרוא את31,32, וזמינותו נותן הערכה מיידית ומקיפה של ביטוי חלבון באוכלוסייה התא כולו, אשר יותר הנציגה של תנאי הניסוי הרגיל, ומציע של רכישת נתונים ועיבוד קל יותר עם תוכנה רגילה. בסך הכל, היתרון העיקרי של וזמינותו היא כי ניתן לנתח בינוני למספר רב של דגימות במקביל. שימוש assay הזה, המופרות, ספריה מעוצבת בצורה רציונלית של משתיק קול-tRNAs כדי לשפר את היעילות של מערכת אורתוגונלית Pyl30. עבודה זו מתארת את נסיוני לבצע assay הזה ולהראות דוגמאות של היישום שלה, כולל אופטימיזציה של הזוג אורתוגונלית כהכנה לסיפוח צילום-crosslinking ncAA p-azido-L-פנילאלנין (עזי), השוואת התאגדות היעילות של חומצות אמינו שונות (איור 2).

במהלך השנים האחרונות, כלים ncAA הוכחו רבת עוצמה כדי לחקור מבנה ועל היבטים הפונקציונלית של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. בבני אדם, GPCRs יוצרים משפחה גדולה של קולטני ממברנה (800 חברים) והם מייצגים למטרות טיפוליות סמים. אפיון מבניים ישירה של GPCRs עדיין מאתגר, שיטות ביוכימיות משלימים יש צורך מאוד החקירה שלהם. אנחנו צריכים חלוץ השימוש ncAAs צילום-crosslinking למפות GPCR משטחים ולגלות ליגנד איגוד כיסים34. משתמש שלנו מערכת אופטימיזציה עבור עזי התאגדות, אנחנו באופן שיטתי שולבו עזי לאורך כל juxtamembrane בתחום GPCR ישירות בתאים בתרבית של חיה. בעת הקרנת UV, עזי טפסים זן nitrene תגובתי הלוכד covalently מולקולות שכנות. כאשר המערכת נוספת של ליגנד, עזי משמשת בדיקה קרבה לחשוף אילו עמדות של הקולטן להתקרב ליגנד מאוגד. בדרך זו, מצב איגוד של ההורמון neuropeptide Urocortin (Ucn1) על הקולטן class B GPCR corticotropin שחרור-פקטור שהקלדתי (CRF1R) 133 היה הראשון שנחשף. לאחרונה, חשפנו איגוד ברורים דפוסים של אגוניסטים של היריבים על קולטן זהה38. בגישה דומה הוחל על ידי אחרים כדי לחשוף את orthosteric ואת אתרי קישור allosteric של אחרים פפטידים, מולקולה קטנה ליגנדים על אחרים GPCRs39,40,41,42. כתב יד זה מתאר את נסיוני חלה במעבדה שלנו עבור צילום-crosslinking מיפוי של משטחים GPCR. השיטה היא יחסית מהירה, פשוטה, אינו דורש שום ציוד מיוחד, כך הוא ישים במעבדות לביוכימיה סטנדרטי. חשוב מכך, הגישה מספק כלי חשוב לא רק כדי לזהות אתרי קישור ליגנד שבו נתונים תלת-ממדיים מבניים נדירים, אלא גם כדי להשלים במבחנה נתונים קיימים עם מידע של רצפטורים שונה לחלוטין post-translationally סביבת פיזיולוגיים של תא חי.

ההתפתחות האחרונה של הרומן ncAAs הנושאת על שרשרת צד מתאים כימיה מרביים bioorthogonal ללא זרז כימי הקבוצות נפתחה האפשרות להתקין fluorophores מהדור האחרון עבור הדמיה ברזולוציה סופר לחלבונים ישירות על חיים תאים2,43. עוגנים כימיים לכלול מאומצות cyclooctyne SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK12,17, טרנס-cyclooctenes ב TCO * K13,15,17 בין ncAAs אחרים מחסה של norbornene16,17,44 או cyclopropene45,46 moiety. NcAAs מגושם bioorthogonal כימיה משולבים על-ידי גרסה של PylRS בדרך כלל מסומן בתור PylRSAF (המציין מוטציה Y271A ו- Y349F ב barkeri מ PylRS), וכן על ידי אחרים ncAARSs אד הוק התפתחו17 , 44. עוגנים bioorthogonal להגיב עם ריאגנטים tetrazine47 באמצעות דרישה אלקטרון הופכי cycloaddition תגובת דילס-אלדר לתת תפוקה גבוהה תיוג בתוך כמה דקות43,48. עם זאת, יישום של גישה זו עוצמה לתווית GPCRs מאתגרת עקב היעילות הכוללת נמוכה של מערכת אורתוגונלית התאגדות המכללות. באמצעות המערכת שלנו Pyl משופר, לאחרונה הראו התאגדות לתפוקה גבוהה של חומצות אמינו כזה לתוך GPCRs GPCR מרביים תיוג על פני השטח של תאים בתרבית של חיים30. קולטנים שכותרתו היו עדיין מתפקד, כפי שהם הפנימו פיזיולוגית בעת הפעלת הקולטן עם אגוניסט. פרוטוקול ניסיוני עבור שילוב של bioorthogonal עוגנים לתוך GPCRs, תיוג בשלבים הבאים מתוארים כאן. מצייד GPCRs עם fluorophores בהיר קטן הוא היסוד צעד לקראת לימוד GPCR dynamics מבניים בתא בשידור חי באמצעות טכניקות מתקדמות במיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קרינה פלואורסצנטית המבוסס על הקרנת הסרט התאגדות יעילות (איור 1)

  1. לשמור על תאים HEK293 במדיום ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM; גלוקוז גבוהות, גלוטמין 4 מ מ, פירובט) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 ב- 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו- 5% CO2.
  2. הזרע התאים יום לפני תרביות תאים.
    1. ניתוק התאים עבור 5 דקות ב 37 ° C ב- 0.05% טריפסין/PBS בתוספת 0.5 מ מ EDTA. השתמש 1 מ"ל טריפסין/EDTA מנה ס מ-10. כיבוי עם 10 כרכים בינוני מלא, resuspend את התאים על ידי pipetting. לספור את מספר התאים ההשעיה באמצעות hemocytometer49.
    2. 5 HEK293 זרע 6.0 x 10 תאים לכל טוב של הצלחות 6-ובכן מדיום הגידול מלאה 2 מ"ל. היכונו בארות רבות ככל שמספר הדגימות ולאחר שתי בארות נוספות EGFP פראי-סוג של מדגם transfected מעושה, בהתאמה.
  3. בקרת זרימה (אזור כבוש על ידי התאים) תחת מיקרוסקופ. Transfect תאים על הנהרות ~ 70% באמצעות ריאגנט polyethyleneimine (פיי).
    1. h 1 לפני תרביות תאים, להוסיף את הכמות המתאימה של פתרון מניות הטרי של ncAA כל בארות ריכוז ncAA הסופי של 0.25-0.5 מ מ. להוסיף ncAA כל בארות, כולל בקרה חיובית פראי-סוג תאים transfected מעושה, כדי למנוע הבדלי אותות פלורסצנטיות עלולה להיגרם על ידי ההשפעות של ncAA על צמיחה סלולרי.
      הערה: כדי להכין מלאי פתרונות, להמיס ncAA כדי 0.1-0.5 מ' באמצעות 0.2-0.5 מ' NaOH. עם זאת, כמה ncAAs עשויים לדרוש solubilization הראשונית ב דימתיל סולפוקסיד ו/או נטרול על ידי ארבעה כרכים של 1 מ' HEPES (pH 7.4) לפני השימוש. בדרך כלל, היצרן ממליץ על פרוטוקול להכין פתרון מניות.
    2. צינור microcentrifuge, מערבבים 1 µg של פלסמיד DNA קידוד עבור הזוג ncAARS/tRNA להיבדק עם µg 1 של כתב פלסמיד דנ א (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry). צינורות נפרדת, להכין של תרביות תאים זהים באמצעות ההפניה פראי-סוג EGFP של תרביות תאים מעושה.
      הערה: מספר העותקים של קלטת tRNA מוטבע בתוך פלסמיד קידוד עבור הזוג ncAARS/tRNA תלוי ביישום. כדי להקל על שיבוט, עותק tRNA 1 זו מומלצת לשימוש בעת הקרנת tRNAs שונים, ואילו 4 עותקים מומלץ (אם כי לא הכרחי) כאשר הבדיקה ncAARS שונים או שילוב של ncAAs שונים על ידי אותו זוג אורתוגונלית.
    3. כדי כל שפופרת המכילה ה-DNA להוסיף 100 µL לקטט במאגר תמיסת מלח (ליברות) המכיל 20 מ מ סודיום לקטט pH 4.0 ו- 150 מ"מ NaCl. מערבבים בקצרה.
    4. כדי כל שפופרת המכילה את הדנ א ב ק ג להוסיף 6 µL של µg 1/µL פיי ב- LBS (יחס פיי/DNA = 3/1 w/w) ו מערבולת מיד. דגירה-RT למשך 10-15 דקות.
    5. לקחת 400 µL תא בינוני מכל קידוח והוסף אותו לתערובת פיי דנ א כדי לנטרל. את ה-pH. לכדרר את התערובת הדנ א על התאים.
      הערה: DMEM מכיל בדרך כלל פנול אדום כמו מחוון ה-pH. במהלך השלב ניטרול תשנה הצבע של התערובת להוסיף בצינור מצהוב (חומצי) אדום (נייטרלי). למרות ויוצרים את מתחמי ה-DNA ב ק ג ב- pH חומצי נותן ה התשואות הגבוהות תרביות תאים50, ניתן ליצור DNA-פיי מתחמי לחלופין ישירות ב- pH 7.4 (למשל בללא סרום DMEM). אם משתמש DMEM טופס DNA מתחמי, לדלג על השלב ניטרול 1.3.5. בכל מקרה, זה חיוני כי אין סרום הוא נוכח התערובת כאשר ויוצרים את מתחמי.
  4. קציר תאים תקנים לאחר 48 שעות.
    1. האחות המדיום ולשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ"ל מראש ומחוממת PBS (37 מעלות צלזיוס). להוסיף µL 800 ל- PBS בתוספת 0.5 מ מ EDTA, תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C. ניתוק, להשעות את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    2. העברת התליה תא לתוך צינורות 1.5 mL המכיל 200 PBS µL בתוספת 5 מ מ MgCl2.
    3. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 800 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. במקרה זה, הקפאה כדורי נוזלי N2 ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. תמיד ללבוש משקפי הגנה העין.
  5. להוסיף 100 µL טריס פירוק מאגר (50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 1% טריטון X-100, 1 מ מ EDTA, הוסיף טרי PMSF) כדי כדורי תא דגירה על קרח למשך 30 דקות. כדי להקל על פירוק, מערבולת כל 5 דקות.
  6. ספין למטה שאריות תאים 10 דקות ב 4 ° C ו- 14,000 x g העברת µL 90 של תגובת שיקוע לוחות 96-ובכן שחור. למדוד קרינה פלואורסצנטית EGFP, mCherry, שימוש בקורא צלחת מצויד עם מודול זריחה.
    הערה: לשימוש המסננים המתאימים עירור, פליטה EGFP (λabs: 488 ננומטר; λem: 509 ננומטר) ו mCherry (λabs: 588 ננומטר; λem: 611 ננומטר). ערכים EGFP נמדד תשתרע על מגוון בין ערך מינימלי מתקבל מתאי transfected מעושה, ערך מרבי, אשר בדרך כלל מתקבל פראי-סוג EGFP. תשמרי על הגדרת החלון מדידה נכונה של הכלי.
  7. היעילות של התאגדות המכללות מחושב כיחס בין על ידי קרינה פלואורסצנטית המדגם על ידי קרינה פלואורסצנטית המתקבל ביטוי פראי-סוג EGFP. כל הערכים הם מנורמל ל mCherry זריחה.
    Equation 1

2. גנטית תיאגוד ncAAs לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי של ליגנד-GPCR אינטראקציות (איור 3)

  1. לשמור על תאים HEK293T DMEM בתוספת 10% (v/v) FBS, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 ב- 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו- 5% CO2.
  2. תאי זרע ביום שלפני תרביות תאים.
    1. ניתוק התאים עבור 5 דקות ב 37 ° C ב- 0.05% טריפסין/PBS בתוספת 0.5 מ מ EDTA. השתמש 1 מ"ל טריפסין/EDTA מנה ס מ-10. כיבוי עם 10 כרכים בינוני מלא, resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה. לספור את מספר התאים ההשעיה באמצעות hemocytometer49.
    2. 5 293T זרע 5.0 x 10 תאים לכל היטב במדיום גידול מלאה 2 מ"ל ב 6-ובכן צלחות. לכל תפקיד שיוקרנו להכין 1 טוב לכל ליגנד פלוס באר אחת איגוד פקד33,38. ובכן נוספת כדי להיות transfected עם הקולטן פראי-סוג (wt) עשויים להיות כלולים כדי לבדוק את רמת הביטוי החשבונאי.
  3. יום אחרי, בקרת זרימה (אזור כבוש על ידי התאים) תחת מיקרוסקופ. Transfect תאים על הנהרות ~ 70% באמצעות פיי.
    1. h 1 לפני תרביות תאים, להוסיף עזי כל בארות כדי ריכוז סופי של 0.5 מ מ.
      1. להכין פתרון מניות 0.5 M של עזי. לכל צלחת 6-ובכן, שוקל 1.2 מ"ג עזי לתוך צינור, לפזר זאת בתוך 15 µL 0.5 M NaOH. לדלל הפתרון מניות במדיום מלאה 1.2 מ"ל ולהוסיף 200 µL של התערובת כל טוב.
        הערה: להכין פתרון מניות טריים של עזי בכל ניסוי. Moiety אזיד יש מחצית חיים קצר בתחום פתרונות מימית, במיוחד ב- pH בסיסי, והוא AziRS משלבת את שלמה, אלא גם את הטופס מפורק.
    2. Transfect בסכום כולל של 2 µg DNA לכל טוב: 1 µg של פלסמיד קידוד עבור GPCR מתויג דגל הנושאת של codon תג במיקום הרצוי, µg 1 של פלסמיד קידוד עבור הזוג אורתוגונלית המוקדש עזי (E2AziRS51 ו 4 עותקים של cognate משתיק קול-tRNA Bstים)33,38.
      הערה: כאשר כולל השוואה wt לבדוק רמות הביטוי, transfect כמות נמוכה יותר של פלסמיד DNA עבור הקולטן wt. בהתאם GPCR, 0.2-0.5 µg של פלסמיד קידוד רמות דומות של קולטן התשואה wt כמו µg 1.0 של פלסמיד מוטציה. Transfect את אותה כמות של DNA בבארות כל, ממלא את ה-DNA חסרים עם ואימץ (למשל וקטור ריק).
    3. המשך כמתואר ב- 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 שעות לאחר תרביות תאים, להמשיך גם עם צעד 2.4 עבור צילום-crosslinking של ליגנדים או ללכת צעד 2.5 קציר ישירה וניתוח לאימות לביטוי קולטן.
  4. צילום-crosslinking של ליגנד.
    1. להכין פתרון מניות של ליגנד 1,000 x. התמוססות של ליגנד פפטיד-ריכוז של 100 מיקרומטר ב דימתיל סולפוקסיד.
      הערה: ריכוז ליגנד תלוי קבוע דיסוציאציה KD של אינטראקציה ליגנד-GPCR. ריכוז סופי של 100 x KD הוא recommendable. אם ליגנד פפטיד הוא מלח של חומצה trifluoroacetic (TFA), שקול את המשקל של TFA בעת חישוב משקל מולקולרי (1 x TFA לכל חומצת אמינו בסיסיות בפפטיד). כמו כן, שקול פפטידים נמצאים באופן כללי היגרוסקופי. להימנע הקפאה חוזרת ונשנית של פפטיד אבקת ולא לפתוח מכולת פפטיד עד זה לא הגיע לטמפרטורת החדר.
    2. לדלל את 1:1,000 פתרון מניות ליגנד במאגר איגוד המורכב מ- 0.1% BSA, 0.01% טריטון-X 100, 5 מ מ MgCl2 במאגר הדיסוציאציה HEPES (HDB) המכיל חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 12.5 מ מ 4 (HEPES)-HCl pH 7.4, 140 מ מ NaCl 5 מ מ אשלגן כלורי. הכן 1 מ"ל לכל מוטציה עזי-GPCR. החלף את המדיום תא 1 מ"ל של הפתרון ליגנד. תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.
      הערה: להתאים את זמן הדגירה GPCR ספציפיים, החשבונאי ליגנד קינטיקה של קולטן הפנמה. הארכת זמן הדגירה לא לשפר crosslinking התשואות.
    3. להאיר את הדגימות במשך 20 דקות ב- crosslinker UV-365 nm עם 5 x 8 W צינורות ו ~ מרחק 5 ס מ על התאים. לנתק את התאים באמצעות pipetting, להעביר אותם לתוך צינור התגובה 1.5 mL. גלולה התאים למשך 3 דקות ב 800 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    4. להמיס לוח של מעכב פרוטאז (PI) קוקטייל ב 1 מ"ל 25 מ מ EDTA/H2O לעשות פתרון 50 x מניות. Aliquot החוקר במניה פתרון ואחסן אותו ב-20 ° C. לדלל המניה 50 x 1:25 ב HDB, resuspend תא כדורי ב- 50 µL של 2 x PI ב HDB. תאי לנוזל N2הקפאה.
      הערה: ללבוש משקפי הגנה העין. בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. להמשיך עם שלב 2.6.
  5. תא ישירה הקציר.
    1. האחות של המדיום. להוסיף µL 800 של 0.5 מ מ EDTA HDB. תקופת דגירה של 10 דקות RT או על קרח.
    2. לנתק את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה, להעביר אותם לתוך צינור התגובה 1.5 mL. להוסיף 200 µL של 5 מ מ MgCl2 HDB. גלולה התאים למשך 3 דקות ב 800 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    3. Resuspend תא כדורי ב- 50 µL של 2 x PI HDB, הקפאת פלאש נוזלי N2. ללבוש משקפי הגנה העין.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס במשך עד חודש.
  6. פירוק התא.
    1. להפשיר את התאים בתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-45 s ו מערבולת בקצרה. לשמור דגימות קר מעכשיו. צניפה ממברנות-2,500-g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לבטל את תגובת שיקוע, אשר מכיל את עיקר החלבונים cytosolic.
    2. Resuspend כדורי 50 µL-HEPES-פירוק-מאגר המכיל 50 מ מ HEPES-HCl pH 7.5, 150 מ מ NaCl, גליצרול 10%, 1% X-100 טריטון, 1.5 mM MgCl2, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ DTT ו- 2 נוספה טרי x קוקטייל PI. מערבבים ביסודיות. Lyse התאים 30 דקות על קרח, מערבולת כל 5 דקות.
    3. ספין למטה שאריות תאים עבור 10 דקות ב 14,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. מיד להעביר את תגובת שיקוע צינור התגובה טריים.
      הערה: להמשיך עם הניתוח מיד. ניתן לאחסן את lysates ב-20 ° C, לעומת זאת, בכל מחזור הפשרת ההקפאה מחליש את איכות התוצאות.
  7. תספיג חלבון ניתוח.
    1. כדי להכין את הדגימה, לקחת 3-5 µL lysate ולמלא אותה עד 7 µL עם H2O. להוסיף 2 µL 1 מ' DTT 3 µL 4 x מדגם מאגר המכיל 63 מ מ טריס-HCl pH 6.8, 2% מרחביות, גליצרול 10% ו- 0.04% bromphenol הכחול. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. כאשר GPCR הוא glycosylated ולהקות עמומה או מרוח הם בעיה, דגימות deglycosylate עם PNGase F כדי להגביר את עוצמת האות ולחדד הלהקות. להשתמש 3-5 µL lysate ו- deglycosylate הנפח הכולל של µL 10 ע פ הפרוטוקול של הספק. הוסף µL 3 4 x דוגמת המאגר.
      הערה: קרום חלבונים הם לעתים קרובות glycosylated מרובות אתרים ובמדינות, הפוגע איכות הרזולוציה בניתוח עמוד מרחביות. עם זאת, לעשות לא deglycosylate את דגימות לבדיקה של רמת ביטוי של המוטציות עזי-GPCR באמצעות נוגדנים אנטי-דגל בגלל הרלוונטיות להעריך את החלק של מלא glycosylated, בוגר קולטן על פני התא.
    3. לפתור דגימות ויה מרחביות-דף רגיל, כתם העברת החלבונים כדי קרום PVDF.
      התראה: אקרילאמיד הוא העצבים. ללבוש כפפות והגנה העין.
    4. לחסום את הקרום עבור 1 h RT או לילה ב 4 ° C ב- 5% חלב רזה TBS-T המכיל 20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, 0.15 מ' NaCl ו- 0.1% Tween 20.
    5. בדיקה הקרום עם נוגדן אנטי-ליגנד ואחריו הנוגדן משני HRP מצומדת. לשטוף בין עם TBS-טי כדי לזהות את רמת הביטוי של עזי-GPCR, בדיקה הקרום עם נוגדן HRP מסחרי (ראה טבלה של חומרים).
    6. לבצע תגובה משופרת chemiluminescence (ECL) באמצעות ריאגנט ECL תוצרת בית, לזהות את האותות עבור 5 דקות בחושך.

3. מרביים Bioorthogonal תיוג של GPCRs על תאים בתרבית של חיים

הערה: הפרוטוקול ממוטב עבור 4-ובכן תאיים coverslips (אזור טוב = 2.2 ס"מ2). עבור טוב בגדלים שונים, הפרוטוקול חייב להיות משתנה בהתאם.

  1. ציפוי פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ. לבצע את כל התהליך ברדס סטרילי.
    1. להכין מנות של פולי-D-ליזין (MW = 500-550 kDa) פתרון מניות (PDL) ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל במאגר בוראט 50 מ מ (pH 8.5). לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים. אין להקפיא.
    2. לדלל PDL מניות פתרון 1:40 במים טהורים אולטרה סטרילי כדי ריכוז סופי של 25 µg/mL (הפתרון עובד), לאחר מכן לסנן את הפתרון דרך מסנן סטרילי 0.22 מיקרומטר.
      הערה: ניתן לאחסן את הפתרון עובד ב 4 ° C עד 3 חודשים.
    3. כיסוי מלא לכל הבאר של השקופית מיקרוסקופ עם 500 µL של הפתרון עובד PDL. תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT, וארוקן את הפתרון עובד PDL.
      הערה: הפתרון עובד PDL ניתן להשתמש עד שלוש פעמים. אם הפתרון ניתן לעשות שימוש חוזר, להעביר את הפתרון בשימוש מהשקופיות מצופה צינור סטרילי טריים ויסמנו את הצינור בהתאם. לא מערבבים את הפתרון ממוחזר עם פתרון טריים.
    4. לשטוף כל x 3 טוב עם ~ 700 µl מים אולטרא טהורים סטרילי ולתת להתייבש במשך לפחות שעה.
      הערה: . זה מאוד חשוב לשטוף את הבארות במדויק, כמו שאריות של הפתרון PDL הם רעילים לתאים. השקופיות מצופה ניתן מיד המשמש מיקרוסקופ או לאחסן עד שבוע ב 4 º C.
  2. לשמור על תאים HEK293T DMEM בתוספת 10% (v/v) FBS, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 ב- 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו- 5% CO2.
  3. תאי זרע ביום שלפני תרביות תאים.
    1. ניתוק התאים עבור 5 דקות ב 37 ° C ב- 0.05% טריפסין/PBS בתוספת 0.5 מ מ EDTA. השתמש 1 מ"ל טריפסין/EDTA מנה ס מ-10. כיבוי עם 10 כרכים בינוני מלא, resuspend את התאים על ידי pipetting. לספור את מספר התאים ההשעיה באמצעות hemocytometer49.
    2. זרע 1.0 x 10 תאים5 HEK293T לכל טוב (אזור 2.2 cm ²) ב- 600 µL צבע חינם DMEM מלאה.
      הערה: הדמיה למטרות, זה נוח מאוד לעבודה מההתחלה במדיום שאינה מכילה כל צבע. צבען ניסוחים DMEM חינם זמינים מסחרית.
  4. לשלוט הנהרות (אזור כבוש על ידי התאים) תחת מיקרוסקופ, transfect התאים-הנהרות ~ 70% באמצעות ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים.
    1. h 1 לפני תרביות תאים, להכין פתרון מלאי טרי 100 מ מ של עלות הבעלות הכוללת * K 0.2 מ' NaOH, דימתיל סולפוקסיד 15% (v/v).
    2. לכל טוב, לערבב 3 µl של עלות הבעלות הכוללת * K פתרון מניות עם 12 µL של 1 מ' HEPES pH 7.4. בעדינות להוסיף את הפתרון הבארות עבור TCO הסופי * K ריכוז של 0.5 מ מ.
    3. להכין בסכום כולל של 500 DNA ng לכל טוב. צינור microcentrifuge, לדלל 200 ng של pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng של פלסמיד הקידוד עבור /tRNAAFPylRS מגהPyl זוג אורתוגונלית (ארבע קלטות של tRNAM15) ו- 100 ננוגרם של pcDNA3.1_Arrestin3 פלסמיד µL 50 בינוני (צבע חינם, ללא סרום, אנטיביוטיקה חינם).
      הערה: באופן כללי, תרביות תאים שותף של Arrestin אין צורך להתבונן הפנמה GPCR. עם זאת, שותף transfecting Arrestin3 מאיץ הפנמה של CRF1R, אשר נוח מאוד בעת ניתוח הפנמה של מוטציות רבות.
    4. לדלל µL 1.25 מהתרכובת השומנים מבוססי תקנים (2.5 µL לכל µg 1 של ה-DNA) µL 50 בינוני (צבע חינם, ללא סרום, אנטיביוטיקה חינם) ולהוסיף את הפתרון לתערובת הדנ א. מערבולת מיד דגירה 5-10 דקות על מתחמי הוסף RT. DNA-השומנים לתאים.
      הערה: מניסיוננו, המורפולוגיה של תאי transfected באמצעות השומנים מבוססי תקנים נראה הפיזיולוגיות יותר לעומת זו של תאים transfected עם פיי. כמו פיי נותן יעילות גבוהה יותר של תרביות תאים, פיי צריך להיות המועדפת עבור יישומי הזרם כמו תספיג, ואילו השומנים מבוססי תקנים הוא בחירה טובה יותר כדי transfect תאים הדמיה ניסויים.
  5. h 24 שעות ביממה שאחרי תרביות תאים, תווית הקולטן עם צבעי פלורסנט.
    1. להכין 0.5 מ מ צבע-tetrazine פתרון מניות דימתיל סולפוקסיד ו 10 mg/mL של DNA מכתים פתרון מלאי צבע טהור אולטרה H2O.
    2. העברת 100 µL בינוני מכל קידוח לתוך צינור התגובה 1.5 mL. הוסף µL 1.8 של הפתרון מלאי צבע-tetrazine ואת µL 0.3 של ה-DNA מכתים פתרון מלאי צבע. להעביר את המדיום המכיל צבעים חזרה אל הבאר ואת תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
      הערה: Tetrazine-כתום-פלורסנט צבע יש ריכוז סופי של 1.5 מיקרומטר.
    3. האחות המדיום ולשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם PBS להסיר את עודף של צבע. להוסיף 600 µL של צבע מלא טרופה מדיום הגידול חינם ל- 37 מעלות צלזיוס.
  6. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, קולטן הפנמה.
    1. לדמיין את קולטני שכותרתו מתחת לגיל 63 x (או דומה) ההגדלה באמצעות מסננים מתאים GFP (λabs: 488 ננומטר; λem: 509 nm), צבע כתום-פלורסנט (λabs: 550 ננומטר; λem: 570 ננומטר) ודנ א מכתים צבען (λ abs: 350 ננומטר; Λem: 461 ננומטר). צלם תמונה עם כל מסנן לפני הפעלת הקולטן.
    2. לקדם את קולטן הפנמה באמצעות 200 ננומטר של Ucn1.
      1. להכין 1,000 x Ucn1 מניות פתרון של מיקרומטר 200 ב דימתיל סולפוקסיד.
        הערה: בהתאם, המסיסות של פפטיד ייתכן שתוכל להכין את מלאי מים טהורים או מאגר.
      2. העברת 100 µL בינוני מבאר לתוך צינור התגובה 1.5 mL ולהוסיף 0.6 µL של הפתרון מניות של אגוניסט פפטיד. העברת גב בינוני לתוך הבאר.
      3. להתבונן פנימה אל קרבו מתחת למיקרוסקופ. לצלם תמונות לאחר המופע לזיהוי ברור של הפנמה (10-15 דקות עד שעות, בהתאם קולטן ביטוי של Arrestins) באמצעות המסננים שהוזכר קודם לכן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קווי המתאר של קרינה פלואורסצנטית וזמינותו מתואר באיור1. שלושה יישומים מועסק וזמינותו. במקום הראשון, מוקרנים מספר גרסאות tRNA על התאגדות של Lys(Boc) על ידי הזוג אורתוגונלית Pyl. Lys(Boc) היא חומצת אמינו דומה sterically Pyl. כפי Pyl אינו זמין מסחרית, Lys(Boc) משמש בדרך – כלל מצע סטנדרטי עבור PylRS. TRNAs ממוסך מבוססים על סינתזתPyl. כל משתנה tRNA נושאת מוטציות של בסיסים יחיד או בסיסי-זוגות לולאות, נובעת באופן רציונלי שנועדו לשפר את סינתזת יציבות ותאימות עם המכונה translational האיקריוטים. כל הפרטים על עיצוב tRNA מתוארים העבודה האחרונה שלנו30. תוצאות טיפוסיות המתוארות 2A איור: tRNAs שונים לתת יעילות לדיכוי שונים, אשר משתקף בבירור בכמות קרינה פלואורסצנטית נמדד. קווי השגיאה קטנה של triplicates ביולוגית מראים כי הערכים מאוד לשחזור. במקום השני, שתי גרסאות הגנים של E2AziRS26,51, אשר משלבת את צילום-crosslinker p-azido-Phe (עזי), מוערכים. E2AziRS נגזרת של TyrRS e. coli . Variant גן אחד מועסק יליד e. coli codon השימוש, ואילו השני היה codon ממוטב לשימוש בח' סאפיינס. קרינה פלואורסצנטית וזמינותו מראה כי הגרסה הממוטבים codon נותן תשואות גבוהות של חלבון (איור 2B). לבסוף, הם שיעור התאגדות של חומצות אמינו שונות bioorthogonal לחץ על כימיה בהשוואה (איור 2C). כל ncAAs המובאת כאן (BCNK, TCO * K ו- SCOK) משולבים על-ידי אותו זוג אורתוגונלית MbPylRSAF/tRNAPyl. Lys(Z) היא גם incorporated על ידי הזוג הזה, שימש פקד חיובי. כדי להמחיש את המהימנות של וזמינותו פלורסצנטיות, נערכו ניסויים התאגדות המכללות מקבילים GPCR, CRF1R. תספיג חלבון ניתוח בוצע כדי להעריך ביטוי GPCR (איור 2B, ג). המגמות באותו שנצפתה עם EGFP וזמינותו פלורסצנטיות נצפו עם CRF1R. ראוי לציין, עזי השתלבות CRF1R שופרה מאוד בעת שימוש הגן E2AziRS הממוטבים codon לעומת הגן מקורית, מראה כי אפילו על שיפור מתון של 1.5-2-חיק על חלבון מסיס (EGFP) על פי וזמינותו פלורסצנטיות יכול לקבל השפעה גדולה יותר על רמת ביטוי של קרום מאתגר יותר חלבונים (איור 2B). בתור הערה כללית, לגבי מספר קלטות tRNA כדי לשמש עבור כל יישום, אחד בלבד tRNA קלטת זו מומלצת לשימוש בעת הקרנת tRNAs שונה על מנת להקל על הליכי שיבוט. בעת הקרנת ncAARS שונים או את היעילות התאגדות של ncAAs שונים על ידי אותו זוג אורתוגונלית, טנדם ארבע חוזר של tRNA קלטת המועדפות על מנת להשיג את התשואות הגבוהות ביותר התאגדות המכללות.

מערכת אופטימיזציה עבור התאגדות עזי כולל את הגן E2AziRS humanized נפרס כדי למפות בכיס מחייב CRF1R להגדיר נתיבים קשירה של 5 ליגנדים שונים: את שני Ucn1 של אגוניסטים פפטיד crf לניסויים קליניים, ואת את היריבים פפטיד שלושה Ucn1(8-40), Crf לניסויים קליניים (9-41), dFXCRF(12-41) (איור 3). בעוד היעילות של עזי התאגדות הוצגה קודם לכן להקטין כשאתם מתקרבים33,את GPCR קרבוקסילי34, שלנו מערכת אופטימיזציה עבור עזי ההתאגדות מאפשר רמות הביטוי המקביל של עזי-מוטציות עם תג-אתרים בחלקים שונים של הגן GPCR (איור 4A). התוצאות באיור 4B מציגות ההקרנה של הלולאה חוץ-תאית 2 (ECL2) ואת סליל V של CRF1R כחלק נציג של הכיס ליגנד מחייב. להקה בגודל הנכון של המוצר crosslinking מגלה כי המיקום טמון הקרבה של ליגנד במתחם קולטן ליגנד, כלומר זה חלק כיס כריכה. מספר רב של להיטים crosslinking נמצאו עם ליגנדים כל נבדק, לחשוף דפוסים ברורים, מחייב את אגוניסטים פפטיד, את היריבים. ראוי לציין, התבנית של להיטים crosslinking מספק מידע אודות רכיבים מבניים של הקולטן. מספר להיטים רצופים, כפי שנצפה ב ECL2 (עמדות F260-R263 בשילוב עם היריבים) מציע אזור גמיש לולאה. דפוס של להיטים כל שאריות שלושה או ארבעה כמו נמצאו רמזים V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) החורש לכיוון מבנה הסליל. המסך ניתן להרחיב בכל התחומים הרלוונטיים של GPCR. אם מבנה תלת-ממדי או דוגמנית מולקולרית של הקולטן קיים, ניתן לאבחן ליגנד עקבות על-ידי סימון את הלהיטים crosslinking עבור כל ליגנד (איור 5).

קרינה פלואורסצנטית והן תספיג נתונים (איור 2C) מראים כי עלות הבעלות הכוללת * K הוא ncAA כימיה bioorthogonal זה מקבל משולב עם היעילות הגבוהה ביותר על ידי PylRS MbAF. מוטציות PylRS שונים עשוי לתת תשואות גבוהות התאגדות של אחרים ncAAs לחץ17, אך הן לא נבדקו במחקר זה. TCO * K סופחה CRF1R-EGFP פיוז'ן חלבון וזמין התקנה באמצעות SPIEDAC כימיה (איור 6A) fluorophore בהיר קטן על הקולטן (איור 6B). כהוכחה של תיוג ספציפית, ידי קרינה פלואורסצנטית של התווית יהיו גלויים רק בתאים המבטאים את הקולטן (תאים ירוק באיור 6B) לא בתאי כהה, אשר ובכך לספק פקד פנימי שלילי ניסוי. קולטנים שכותרתו באמצעות הכימיה SPIEDAC מרביים הן עדיין מתפקד. לאחר הוספת אגוניסט פפטיד, תאים פלורסנט נצפו ברחבי ציטוזול, חשיפת תהליך פיזיולוגי של הפנמה GPCR (איור 6C). מאותת EGFP מאוחה שותף מקומי עם הפלורסנט כל הזמן, המאשר תיוג biorthogonal סלקטיבית של GPCR.

Figure 1
איור 1: מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay כדי להעריך את היעילות של stop codon דיכוי. HEK293 תאים הם שיתוף transfected עם פלסמידים 2 בנוכחות ncAA. אחד פלסמיד מקודד כדי להפוך את ncAARS הרצוי משתיק קול-tRNA. השני פלסמיד מקודד עבור הגן EGFP הנושאת codon עצירה של תג באתר מתירניות יחד עם פקד mCherry. יומיים לאחר תרביות תאים, זריחה ירוק ואדום של כל תא lysates נמדדים קורא צלחת. כמו EGFP N-קטע במעלה הזרם ש-stop codon (אפור) אינו פלורסנט, התשואה של נייר (ירוק) באורך מלא EGFP ישירות המתייחס היעילות של התאגדות המכללות, בעוד mCherry (אדום) מספק הפניה עצמאי עבור נרמול. היעילות של מערכת אורתוגונלית ניתנת על ידי היחס בין כמות EGFP להשיג באמצעות stop codon הדיכוי ואת מידת EGFP פראי-סוג מתקבל על ידי תרגום רגיל (לא טוב ענבר). האיור הוא שונה מן Serfling, ר & מטבע; התאגדות של חומצות אמינו לא טבעיות לחלבונים מבוטא בתאי יונקים, שיטות אנזימולוגיה 2016, 580, 89-107. 29 רבייה הותרה על ידי מרכז Elsevier של אישור זכויות יוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : יישומים נציג של קרינה פלואורסצנטית וזמינותו. (א) הקרנת tRNAPyl גרסאות30. התאים HEK293 היה שותף transfected עם הכתב פלסמיד, פלסמידים קידוד עבור הזוג PylRS/tRNA Mb(אחד להעתיק tRNA). העמודות מייצגות את קרינה פלואורסצנטית היחסי של EGFP המתקבל שילוב של Lys(Boc) בהשוואה EGFP פראי-סוג. (B) להעריך את ההשפעה של שימוש codon עבור גנים ncAARS. (פאנל שמאלי) קרינה פלואורסצנטית וזמינותו של תאים transfected עם שתי גרסאות הגן שונה של E2AziRS. (1) codon שימוש של e. coli ו ג'ין humanized (2). (לוח נכון) תספיג חלבון ניתוח של CRF1R95Azi-דגל. הקולטן באורך מלא הוא זוהה על ידי נוגדן אנטי-דגל. אקטין β שימש טעינת פקד. (ג) להעריך את היעילות התאגדות של שלוש ncAAs מיועד bioorthogonal כימיה. (פאנל שמאלי) מבני ncAAs השתמשו בניסוי זה. (1) LysZ, אשר שימש בקרה חיובית, (2) BCNK, (3) TCO * K ו- SCOK (4). (הפאנל המרכזי) קרינה פלואורסצנטית וזמינותו של תאים HEK293 transfected עם פלסמיד קידוד MbPylRSAF , ארבעה עותקים של tRNA15 (א) כדי לשלב (1), (2), (3) ו- (4). (לוח נכון) המערבי כתם ניתוח של מוטציה CRF1R הדגל נושא אחד ncAAs ארבע במיקום 95. אקטין β שימש טעינת פקד. פאנל A מקורי Serfling, מעצב et al. R. tRNAs עבור שילוב יעיל של חומצות אמינו קאנונית על ידי המערכת פירוליזין בימי במיל חומצות גרעין תאים בתרבית של 46 (1), 1-10 (2018) ו משוחזרות על פי Creative Commons רישיון ייחוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : ייצוג סכמטי של המיפוי צילום-crosslinking בתיווך עזי. בפונקציה צילום-activatable azido (הטלאי הצהוב) ימוקם עמדה מוגדרת בתוך הקולטן (אפור). כאשר הקבוצה azido ממוקם proximal ליגנד מאוגדת (אדום), מוצר crosslinking קוולנטיות נוצר בעת הקרנת UV (עיגול צהוב מציין אתר crosslinking). שיתוף של קבוצת azido לתוך עמדות שונות של הקולטן מגלה המשטח מחייב (סגול) של ליגנד, אשר מייצג את הכיס מחייב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : התאגדות של עזי ברחבי CRF1R עבור צילום-crosslinking מיפוי של כיס כריכה. (א) השוואה של רמות הביטוי של עזי-CRF1R-דגל מוטציות לכיוון פראי-סוג קולטן. האתרים התאגדות עזי מופצים ברחבי הקולטן כל כמצוין בשורה העליונה. דגל אנטי שהכלים המערבי של כל תא lysates מוצגים. אקטין β שימש טעינת פקד. (B) שהכלים המערבי שנבדק עם או נגד-crf לניסויים קליניים או נוגדנים anti-Ucn1 מוצגים. שאריות הוחלף עזי נקובים בשורה העליונה. התאים היו מודגרות עם ליגנדים מופיע משמאל, ולאחריה הקרנת UV 365 ננומטר, פירוק. הדגימות שנפתרו על 10% מרחביות-דף, deglycosylated באמצעות PNGase F, נותחו על ידי סופג המערבי. המתחם ליגנד-CRF1R deglycosylated פועל במהירות MW לכאורה של ~ 40 kDa33. ליגנד שאינו תפור אינה שזוהו (kDa MW ~ 3-4). שני לוחות של איור זה שונו מ סיידל, ל' ואח מבני תובנה הפעלת קולטן G-חלבון בשילוב class B על ידי פפטיד ההורמונים בתאי אדם חי. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 והם מרובה על פי רישיון מלאי ייחוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : עקבות של פפטיד אגוניסטים, היריבים במחלקה B GPCR CRF1R. ייצוג פני שטח של התחום transmembrane CRF1R. עמדות של CRF1R הזה תפור ליגנד כאשר מוחלף על ידי עזי מודגשים. עקבות אגוניסטים פפטיד ומנהל Ucn1 מסומנים במג'נטה, עקבות היריבים (9-41) ומנהל Ucn1(8-40) בכחול. טביעת רגל של אנטגוניסט dFXCRF(12-41) יסומן בכתום. שבע transmembrane helices I-VII מסומנים באמצעות מספרים רומיים. (A, B) נופים צדדיים של הכיס מחייב מהמטוס ממברנה. (ג) Top view לתוך הכיס איגוד מהצד חוץ-תאית. הודפס מחדש של סיידל, ל' ואח מבני תובנה הפעלת קולטן G-חלבון בשילוב class B על ידי פפטיד ההורמונים בתאי אדם חי. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 והם מרובה על פי רישיון מלאי ייחוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : SPIEDAC תיוג של CRF1R על תאים חיים. (א) התגובה בסכמה זן-קידום הפוך אלקטרון דרישה תגובת דילס-אלדר cycloaddition (SPIEDAC): קבוצת הטרנס-cyclo-2-octene של ncAA TCO * K מגיבה עם הקבוצה tetrazine מקושר fluorophore Cy3. (B, C) HEK293T התאים לבטא CRF1R95TCO * K- EGFP. תמונות נציג של הערוץ ירוק, אדום וכחול. הגודל של סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. (B) תאים שטופלו tetrazine-Cy3 (1.5 מיקרומטר) במשך 5 דקות. רק תאים המבטאים את הקולטן (ירוק) מציגות מופע של תיוג (אדום). (ג) תאים שטופלו 200 ננומטר Ucn1 ואת השיקוף לאחר 15 דקות שלפוחית תאיים מתאימות את הקולטן למביטה. לוחות B ו- C עוברות שינוי מן Serfling, tRNAs ר et al. מעצב עבור יעיל התאגדות של חומצות אמינו קאנונית על ידי מערכת פירוליזין בתאים בתרבית של חומצת גרעין במיל 46 (1) 1-10 (2018) (הוצאת אוניברסיטת אוקספורד) והם מרובה על פי רישיון מלאי ייחוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול מתאר של assay פשוטה ואמינה כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית כהכנה לסיפוח ncAAs לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היתרון העיקרי של שיטה זו בכל הנוגע בשימוש נרחב מבחני בהתבסס על FACS הוא שזה מאפשר מדידה של מספר גדול של דוגמאות והכנה בו זמנית, מספק נתונים בקלות מאבחנים באמצעות תוכנה רגילה. הזמינות של שיטה בינונית-תפוקה לנתח זוגות אורתוגונלית בתאים בתרבית של חשוב מאוד עבור הפיתוח של זוגות אורתוגונלית חדשות ושיפור הקיימות. אכן, אין אפשרות לבצע אבולוציה מכוונת של זוגות אורתוגונלית באמצעות הדור של ספריות אקראי גדול ומבחר המלח/חיה במערכות יונקים. וזמינותו מאפשר הקרנה קטן בגודל של ספריות (מאות חברים) על ידי השקעה ניסיוני מאמץ סביר תוך זמן קצר יחסית. על ידי הקרנת מעוצב באופן רציונלי ערכות tRNA דרך זו assay, אנו יכול לייצר tRNAs רומן זה להגביר באופן משמעותי את היעילות של המערכת פירוליזין30. השילוב הקלאסי EGFP/mCherry משמש את read-out פלורסנט, לפיה EGFP משמש כתב של התאגדות יעילות mCherry של הפקד פנימי. הכתב EGFP ואת הפקד mCherry הם טיפח בתוך פלסמיד אותו אבל מוטבעות שתי קלטות ביטוי נפרדת הנושאת שני היזמים עצמאית. בדרך זו, mCherry הביטוי מתייחס תרביות תאים והחסכון ספירת תאים, אך היא עצמאית של ביטוי EGFP, כך אפשרות לנרמל את קרינה פלואורסצנטית ירוק נמדד פלואורסצנטי אדום. . זה לא בדיוק המקרה של עיתונאים נוספים שנבנה כבית זוגיים של שני חלבונים כגון EGFP-תג-mCherry7 ו- iRFP-GFPY39TAG (עם iRFP שמשמעו החלבון הניאון אינפרא-אדום)52. מבנים כאלה, הם שני חלבונים בתעתיק mRNA זהה. ב פרוקריוטים, mRNAs הנושאת עצירה מוקדמת codons עוברים מעקב והשפלה על ידי מנגנון דעיכה בתיווך שטויות (NMD)53. לכן, הן הרצף של הכתב והפקד נמצאים בו זמנית מפורק, ביטוי של שני גנים אינה עצמאית לחלוטין. מבחני דומה המבוסס על כתב לוציפראז במקום כתב פלורסצנטיות היו שתוארו על-ידי אחרים54,55. לומינסנציה אנזימטי מציעה רגישות גבוהה יותר מאשר מדידות קרינה פלואורסצנטית, האחרון הראה הפארמצבטית גבוה יותר בין קבוצות תאים שונים.

מערכות חזקים התאגדות המכללות בתאים בתרבית של נחוצים לחלוטין בעת עבודה עם בדרישה חלבון מטרות כמו קרום חלבונים, חלבונים בשפע נמוך. שהראתי כאן זוג אורתוגונלית ממוטב עבור התאגדות חזקה של ncAA צילום-activatable עזי לתוך GPCRs. המערכת מעניקה שיעורי התאגדות עזי הומוגנית ברחבי הקולטן שלם המאפשר את המיפוי צילום-crosslinking שיטתית של כל המשטחים GPCR וזיהוי של אתרי קישור ליגנד. שתי הנקודות העיקרי של כוח של השיטה הם כי ניתן לנתח ליגנדים שונים על הקולטן אותו במקביל כי הנתונים הם נגזרת של הקולטן בתא בשידור חי, אשר משלים את המידע המתקבל במבחנה גישות. השיטה הוא עקרוני החלים על כל מטרה חלבון, מתאימה גם למיפוי טופולוגיות של אינטראקציות חלבון-חלבון. יתר על כן, להיות מנותח המשנה מזוהה של עמדות תפור עוד יותר עם 2D crosslinking לנקודת ה-pin-זוגות הבין-מולקולרי של חומצות אמינו proximal מורכבים הקשורים33,38. זוגות כאלה חומצת אמינו מספקים אילוצים המרחבי המוחלים סיליקו ניסויים כדי לבנות מודלים מולקולריים מדויק של33,האינטראקציה38. נקודת המבט שיטתי, זה שווה למורשתה חיוביים בלבד תוצאות של ניסויים crosslinking צריך להיחשב. תפקיד שעשה לא crosslink עדיין יכול להיות בתוך הרדיוס קריטי של ליגנד. התשלילים שווא יכול להתרחש כאשר המוטציה הציג את crosslinker הסלים האינטראקציה מקורי, אך יכולות להתרחש גם כאשר moiety crosslinking נקודות בלבד ליגנד, או הוא מתרצה מאת הממס, או עובר crosslinking התפלגות. חלק חיוני של השיטה היא כיצד לזהות את המופע של crosslinking. במקום הראשון, כל תא lysates נפתרות מרחביות-עמוד כדי להפריד כל ליגנד שאליה לא מאוגד covalently הקולטן. שנית, המתחם קוולנטיות קולטן ליגנד מזוהה באמצעות המערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי-ליגנד. ליגנדים פפטיד, הם נוגדנים polyclonal גבוהה-זיקה יותקף ליגנד הבחירה האופטימלית. כחלופה, פפטיד ליגנדים יכול להיות מצויד תג דגל במיקום מתירני, בתנאי התג הופכת לנגישה ל נוגדן אנטי-דגל דרך כרווח מתאימים. ביוטין תגיות יכול לשמש גם, למרות התוצאות עלולות להיות קשה לפרש בשל הרקע על ידי חלבונים biotinylated אנדוגני. מולקולה קטנה ליגנדים הם radiolabeled בדרך כלל, אף על פי תיוג-תג יכול להיות גם אפשרי56,57. פרוטוקולים עבור עזי שהשתלבה GPCRs כבר פורסם גם על ידי אחרים57,58,59. עם זאת, פרוטוקולים אלה לערב את השימוש שלושה פלסמידים עבור תאגיד עזי, ואילו אנו משתמשים במערכת דו-פלסמיד פשוטים יותר, כולל גן humanized עבור E2AziRS, אשר נותן תוצאה טובה יותר ביחס הלא codon-אופטימיזציה אחד (איור 2B).

טכניקות במיקרוסקופ המודרניים דורשים התקנת fluorophores בהיר מאוד ויעיל לתוך החלבון של עניין, כמו חלבון מקודדים גנטית fluorophores כמו EGFP קלאסי אינם מתאימים ליישומים באיכות גבוהה. לכן, אין חיפוש מתמשך של שיטות המאפשרות התקנת fluorophores אורגניים על גבי חלבונים, אשר הובילה להתפתחות של הצמד הפופולרי60 ו- Halo61 תגיות, בין היתר. עם זאת, תגים כאלה עדיין יש גודל של מספר kDa, אשר ייתכן perturb את תפקוד החלבון היעד ולהשאיר די הרבה אי ודאות גדולה לגבי המיקום המדויק של fluorophore. עם מידה מינימלית של כמה חומצות אמינו, מוטיב tetracysteine מייצג חלופה קטן יותר עבור תיוג מדויק יותר באמצעות fluorescein או resorufin arsenical תרכובות (פלאש, ReAsH)62,63. אף-על-פי גישה זו הוחלה בהצלחה רבה גם GPCR מחקרים64,65,66, זה דורש צעדים כביסה נרחב עם תיולים היא סובלת לעיתים קרובות מרקע גבוה, בכל מקרה, זה לא מתיר מיקום התווית עם רזולוציה שאריות יחיד. במקום זאת, ncAAs מצויד bioorthogonal עוגנים מציעים את האפשרות של התקנת תוויות פלורסנט במיקום חומצה אמינית בודדת, ובכך למזער את הסיכון של המפריעים קונפורמציה יליד והפונקציונליות של החלבון היעד. מהדור האחרון ncAAs bioorthogonal כימיה, אוהב את עלות הבעלות הכוללת * K13 המועסקים כאן, הפעלת חלבון תיוג ישירות על תאים חיים17,43. השיטה זו חלים על מטרות החלבון על פני התא, אלא גם על מטרות תאיים, ובלבד מתאימים צבעי תא חדיר הינם זמינים17,67,68. SPIEDAC כימיה היא במספר סדרי גודל מהר יותר בכל הנוגע אתקרב זן azido-אלקין cycloaddition (SPAAC) ועיגון Staudinger Bertozzi ligations על אזיד2,13. למעשה, מספר פרוטוקולים פורסמו GPCR תיוג על גנטית שולבו עזי, אך הם חלים רק על מבודדים GPCRs במבחנה37,59,69. במקום זאת, הראו כאן חלק bioorthogonal תיוג של GPCRs פונקציונלי על התא בשידור חי. פרוטוקול שלנו דומה הפרוטוקולים הקיימים באמצעות את אותה כימיה43,48,70, אבל שלנו מערכת אופטימיזציה של התאגדות המכללות מרחיב את היקף השיטה ללימודים GPCR. שלב קריטי בהליך ניסיוני הוא הבחירה של העמדה ויחליפו עם עלות הבעלות הכוללת * K, כמו שלא כל עמדות בתוך הקולטן הם מתירניות החלפת או להנגיש הפלורסנט. לכן, מספר תנוחות צריך להיבדק ב מסך ראשוני כדי למצוא את המתאים ביותר.

לסיכום, עבודה זו מציגה כלים ליישום כללי של ncAAs, כולל יישום מטרות מאתגרות חלבון כגון GPCRs. אנו צופים זה צילום-crosslinking מיפוי ו bioorthogonal תיוג, כיום את היישומים העיקריים של ncAAs ללימודים GPCR, תוכלו למצוא הרבה יישומים עתידיים שני לחשוף טופולוגיות מאינטראקציות GPCR ליגנדים או חלבונים אחרים וכדי ללמוד GPCR דינמיקה מבניים בתא בשידור חי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לך אין קונפליקטים להכריז.

Acknowledgments

עבודה זו הוקם על ידי דויטשה פתוח (DFG) תחת מענקים CO822/2-1 (אמי נתר תוכנית) ו- CO822/3-1 כדי אי. סי

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

כימיה בעיה 134 Non-קנונית חומצת אמינו (ncAA) ענבר stop codon דיכוי התאגדות יעילות אורתוגונלית זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA צילום-crosslinking מיפוי ממשקים מחייב חלבון כימיה bioorthogonal מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Serfling, R., Seidel, L.,… More

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter