Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57069
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences, University of Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Abstract

De genetische opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) via amber stop codon onderdrukking is een krachtige techniek om te installeren van kunstmatige sondes en reactieve wordt op eiwitten rechtstreeks in de levende cel. Elke ncAA is verwerkt door een speciale orthogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) paar die is geïmporteerd in het ontvangende organisme. De efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs kan sterk verschillen, en in sommige gevallen ontoereikend. Orthogonale paren kunnen worden verbeterd door het manipuleren van de jaarlijkse Activiteitenverslagen van of het tRNA. Gerichte evolutie van tRNA of jaarlijkse Activiteitenverslagen met behulp van grote bibliotheken en dood/levend Selectiemethoden zijn echter niet haalbaar in zoogdiercellen. Hier, wordt een facile en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling aan de evaluatie van de doeltreffendheid van orthogonale paren in zoogdiercellen gepresenteerd. De bepaling kan screening van tientallen tot honderden varianten van de jaarlijkse Activiteitenverslagen/tRNA met een matige inspanning en binnen een redelijke termijn. Gebruik van deze test voor het genereren van nieuwe tRNAs die aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de orthogonale systeem van pyrrolysine wordt beschreven, samen met de toepassing van ncAAs aan de studie van de G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs), die zijn uitdagend objecten voor ncAA mutagenese. Ten eerste, door het systematisch opnemen van een foto-crosslinking ncAA gedurende het extracellulaire oppervlak van een receptor, bandplaatsen van verschillende liganden op de intact receptor worden toegewezen rechtstreeks in de levende cel. Ten tweede, door de integratie van ncAAs van de laatste generatie in een GPCR, ultrasnelle catalyst-gratis receptor labelen met een fluorescente kleurstof wordt aangetoond, die exploiteert bioorthogonal stam-bevorderd inverse Diels-Alder cycloadditie (SPIEDAC) op de levende cel. Als ncAAs kan over het algemeen worden toegepast op elke proteïne onafhankelijk van de grootte, is de methode van algemeen belang voor een aantal toepassingen. Bovendien, ncAA opname niet vereist geen speciale apparatuur en gemakkelijk in standaard biochemie labs wordt uitgevoerd.

Introduction

De genetische opneming van chemische sondes in eiwitten is een krachtige methode om onderzoek van structurele en dynamische aspecten van eiwitfunctie rechtstreeks in de oorspronkelijke context van de levende cel. Tegenwoordig kunnen honderden niet-canonieke aminozuren (ncAAs) uitgerust met de meest uiteenlopende chemische groepen worden site-specifically opgenomen in eiwitten door biosynthese1,,2,,3,4. Tussen hen, vindt men lichtgevoelig ncAAs zoals foto-crosslinkers5, foto-caged,6,7,8,9 en foto-schakelbare aminozuren10, 11, aminozuren, rekening houdend met gespannen alkenen en alkynen voor catalyst-gratis bioorthogonal chemie2,12,13,14,15,16 ,17, uitvoering dansyl18en cumarine9,19prodan20,21 fluorophores aminozuren en aminozuren uitgerust met andere biofysische sondes als goed zoals met post vertalende wijzigingen1,2,3,4,22,23,24,25.

De genetische codering van een ncAA is ingeschakeld door een toegewijde amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) gekoppeld aan een cognaat suppressor-tRNA, waarin de ncAA in reactie op een amber stop codon tijdens de reguliere ribosomal synthese. ncAARS/tRNA paren zijn ontworpen zodanig orthogonale in het ontvangende organisme, dat wil zeggen niet cross-talk met de endogene paren. De techniek is goed ingeburgerd, zowel in de prokaryote en eukaryote hosts en gemakkelijk toepasbare aan zoogdieren cellen. Paren voor ncAA opneming in zoogdiercellen zijn gebaseerd op de drie belangrijkste orthogonale systemen: het tyrosyl-systeem, dat de TyrRS van E. coli26 met een suppressor tyrosyl amber van B. stearothermophilus27 (EG combineert TyrRS /BstYam paar), de E. coli leucyl systeem (EGLeuRS/tRNALeuCUA paar)6,18,28 en de archaeële pyrrolysyl systeem (PylRS/tRNA Pyl paar)3, waarbij het tRNAPyl is een natuurlijke amber suppressor. In het algemeen wordt elke ncAA herkend door een gespecialiseerde ncAARS. Afhankelijk van de structuur van de ncAA, wordt de ncAARS verkregen via gerichte evolutie van TyrRS, LeuRS of PylRS, hoewel sommige synthetases meer dan één ncAA kunnen aanvaarden.

Door eenvoudig met behulp van een plasmide vector wordt de orthogonale paar ingevoerd in de cellen. Meest voorkomende en efficiënte plasmiden zijn bicistronic en coderen van zowel voor de synthetase en de vorming van de orthogonale paar29tRNA. Een tweede plasmide-codering voor de proteïne van rentedragende een amber codon op de site voor wijziging aangewezen is mede-transfected. De ncAA is gewoon toegevoegd aan het groeimedium cel. Echter, verschillende gespecialiseerde clientgroepen gebruiken vaak verschillende varianten van plasmide constructies zelfs voor de opneming van de dezelfde ncAA. Constructies verschillen in de rangschikking van de genen in de vector, de aard van de synthetase, de codon gebruik in de synthetase gen, de promotor gebruik, de variant van het tRNA en aantal tRNA expressie cassettes. Bovendien kan de efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs drastisch variëren als gevolg van de verschillende katalytische efficiëntie van de verschillende synthetases, de kwaliteit van het tRNA, en andere factoren-30. Daarom is het belangrijk om bij de hand hebben een snelle en betrouwbare methode om te evalueren van de doeltreffendheid van een orthogonale paar, zowel om te kiezen van het meest geschikte systeem voor een gewenste toepassing en voor het uitvoeren van sommige optimization stappen dat verbetering van de algehele eiwit expressie opbrengsten.

We hebben een eenvoudige en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling om te evalueren van de doeltreffendheid van orthogonale paren29 (Figuur 1) opgericht. In de analyse, cellen zijn mede transfected met de plasmide-codering voor de orthogonale paar, samen met een bicistronic verslaggever plasmide codering zowel voor de groen fluorescente proteïne, rekening houdend met een amber stop codon op een tolerante positie (EGFPTAG) en de mCherry gen. Rode en groene fluorescentie van geheel-cel lysates worden gelezen in afzonderlijke kanalen op een afleesapparaat in een 96-wells-plaat. De intensiteit van de groene fluorescentie direct correleert met de efficiëntie van amber onderdrukking, overwegende dat de intensiteit van de rode fluorescentie een directe schatting van de grootte van het te meten monster en de efficiëntie van de transfectie geeft. Met betrekking tot soortgelijke testen op basis van fluorescentie voorlezen geassisteerde cell sorting (FACS)31,32, de bepaling geeft een onmiddellijke en uitgebreide beoordeling van eiwit expressie in de cel van de hele bevolking, die meer is representatief zijn voor de gebruikelijke proefomstandigheden, en biedt een eenvoudiger data acquisitie en verwerking met standaard software. Globaal, is het belangrijkste voordeel van de bepaling dat een middellange tot een groot aantal monsters kan worden geanalyseerd in parallel. Met behulp van deze test, hebben wij een rationeel ontworpen bibliotheek van suppressor-tRNAs ter verbetering van de efficiëntie van de Pyl orthogonale systeem30gescreend. Dit werk beschrijft het experimentele protocol om het uitvoeren van deze test en voorbeelden van de toepassing ervan, met inbegrip van de optimalisering van de orthogonale paar voor de opneming van de foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanine (Azi) en de vergelijking van de efficiëntie van de integratie van verschillende aminozuren (Figuur 2).

De laatste jaren heeft ncAA tools hebben bewezen zeer krachtig te onderzoeken van structurele en functionele aspecten van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs)33,34,35,,36,,37 , 38. bij de mens, GPCRs vormen een grote familie van membraan receptoren (800 leden) en hoofddoelen voor therapeutische drugs vertegenwoordigen. Directe structurele karakterisering van GPCRs is nog uitdagend en complementaire biochemische methoden zijn zeer nodig voor hun onderzoek. We hebben een pionier in het gebruik van foto-crosslinking ncAAs kaart GPCR oppervlakken en ontdek ligand bindende zakken34. Via ons geoptimaliseerde systeem voor Azi inbouw, wij stelselmatig Azi opgenomen in het domein van de hele juxtamembrane van een GPCR rechtstreeks in de cellen van levende zoogdieren. Bij UV-bestraling vormt Azi een zeer reactieve nitrene soorten die covalent naburige moleculen vangt. Wanneer de ligand wordt toegevoegd aan het systeem, fungeert Azi als een sonde van de nabijheid te onthullen welke posities van de receptor komen dicht bij de afhankelijke ligand. Op deze manier werd de bindende wijze van het neuropeptide hormoon Urocortin (Ucn1) op de klasse B GPCR corticotropin-releasing-factor receptor itype 1 (CRF1R)33 voor het eerst onthuld. De laatste tijd hebben we verschillende bindende patronen van agonisten en antagonisten op de dezelfde receptor38vermeld. Een soortgelijke aanpak is toegepast door anderen te onthullen van de orthosteric en allosteric bandplaatsen van andere peptides en klein molecuul liganden op andere GPCRs39,40,41,42. Dit manuscript beschrijft het experimentele protocol toegepast in ons lab voor foto-crosslinking toewijzing van GPCR oppervlakken. De methode is relatief snel, eenvoudig en vereist geen speciale apparatuur, zodat zij is van toepassing in standaard biochemie labs. Nog belangrijker is, de aanpak biedt een waardevol instrument, niet alleen om te identificeren ligand bandplaatsen waar 3D Landeninformatie schaars zijn, maar ook ter aanvulling van de bestaande in vitro gegevens met informatie van volledig post-translationally gemodificeerde receptoren in de fysiologische omgeving van de levende cel.

De recente ontwikkeling van roman ncAAs invloed op de kant keten chemische groepen geschikt voor ultrasnelle katalysator-vrije bioorthogonal chemie heeft opengesteld van de mogelijkheid om te installeren van de laatste generatie fluorophores voor super-resolutie beeldvorming in eiwitten direct aan de levende cellen2,43. Dergelijke chemische ankers zijn gespannen cyclooctyne in SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne in BCNK12,17, en trans-cyclooctenes in TCO * K13,15,17 onder andere ncAAs herbergen een Norborneen16,17,44 of cyclopropeen45,46 deel daarvan. Omvangrijk ncAAs voor de bioorthogonal scheikunde middels een variant van de PylRS meestal aangeduid als PylRSAF zijn opgenomen (die aangeeft mutatie Y271A en Y349F in de M. barkeri PylRS), maar ook door andere ad hoc geëvolueerd ncAARSs17 , 44. de ankers van bioorthogonal reageren met tetrazine reagentia47 via omgekeerde elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie geven hoge labeling opbrengsten binnen een paar minuten43,48. Toepassing van deze krachtige aanpak op etiket GPCRs heeft echter zijn uitdagend als gevolg van een lage algemene efficiëntie van de orthogonale ncAA opneming systeem. Via ons uitgebreide Pyl systeem, hebben we onlangs aangetoond hoog rendement opneming van dergelijke aminozuren in GPCRs en ultrasnelle GPCR etiketten op het oppervlak van levende cellen van zoogdieren30. Gelabelde receptoren waren nog steeds functioneel, als ze fysiologisch geïnternaliseerd bij het activeren van de receptor met een agonist. Het experimentele protocol voor de opneming van bioorthogonal ankers in GPCRs en labeling volgt worden hier beschreven. GPCRs met kleine heldere fluorophores om uit te rusten is de eerste essentiële stap naar de studie van GPCR structurele dynamica in de levende cel via geavanceerde microscopie technieken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fluorescentie gebaseerde Screening van opneming efficiencyverbeteringen (Figuur 1)

  1. Handhaven van HEK293 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM; hoge glucose, 4 mM glutamine, pyruvaat) aangevuld met 100 U/mL penicilline, 10% (v/v) foetale runderserum (FBS) en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO2.
  2. Zaad de cellen eergisteren transfectie.
    1. Loskoppelen van de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C in 0.05% trypsine/PBS aangevuld met 0,5 mM EDTA. Gebruik 1 mL trypsine/EDTA voor een 10-cm schotel. Doven met 10 volumes van volledige medium en resuspendeer de cellen door pipetteren. Het aantal cellen in de opschorting die met behulp van een hemocytometer-49.
    2. Zaad 6.0 x 105 HEK293 cellen per putje van 6-Wells-platen in 2 mL volledige groeimedium. Voorbereiden op zoveel wells als hetaantal monsters en twee extra wells de wild-type EGFP en een mock-transfected monster, respectievelijk.
  3. Controle samenvloeiing (gebied bezet door de cellen) onder een microscoop. Transfect cellen aan ~ 70% samenvloeiing met behulp van polyethyleneimine (PEI) reagens.
    1. 1 uur vóór de transfectie, breng de geschikte hoeveelheid van een versbereide ncAA stockoplossing in alle putjes voor een ncAA eindconcentratie van 0,25-0,5 mM. Voeg de ncAA toe aan alle putjes, met inbegrip van de wild-type positieve controle en mock-transfected cellen, om te voorkomen dat verschillen in fluorescentie signalen die kunnen worden veroorzaakt door effecten van de ncAA op cellulaire groei.
      Opmerking: Om voor te bereiden van stamoplossingen, Los de ncAA naar 0,1-0,5 M met 0,2-0,5 M NaOH. Sommige ncAAs kunnen evenwel eisen eerste solubilisatie in DMSO en/of neutralisatie door vier volumes van 1 M HEPES (pH 7.4) vóór gebruik. Algemeen, raadt de fabrikant een protocol bij het bereiden van een stamoplossing.
    2. Meng in een microcentrifuge buis, 1 µg plasmide DNA-codering voor de ncAARS/tRNA paar te beproeven met 1 µg verslaggever plasmide DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry). In afzonderlijke buizen, moet u een identieke transfectie met de EGFP wild-type verwijzing en een mock transfectie voorbereiden.
      Opmerking: Aantal exemplaren van het tRNA cassette ingebed in de plasmide codering voor de paar ncAARS/tRNA, is afhankelijk van de toepassing. Ter vergemakkelijking van klonen, 1 tRNA kopie is aanbevolen wanneer screening van verschillende tRNAs, overwegende dat 4 exemplaren zijn aanbevolen (zij het niet strikt noodzakelijk) wanneer testen verschillende ncAARS of de opneming van verschillende ncAAs door dezelfde orthogonale paar.
    3. Naar elke buis bevattende de DNA Voeg 100 µL lactate gebufferde zoutoplossing (LBS) met 20 mM natrium lactaat bij pH 4.0 en 150 mM NaCl. Meng kort.
    4. Aan elke buis waarin het DNA in LBS Voeg 6 µL van 1 µg/µL PEI in LBS (verhouding PEI/DNA = 3/1 w/w) en vortex onmiddellijk. Incubeer bij RT gedurende 10-15 min.
    5. Neem 400 µL cel medium uit elk putje en toe te voegen aan het mengsel van de DNA-PEI te neutraliseren de pH. Dribbelen van het DNA-mengsel op de cellen.
      Opmerking: DMEM bevat meestal fenol rood als pH-indicator. Tijdens de neutralisatie stap verandert de kleur van het mengsel toegevoegd in de buis van geel (zure) op rood (neutraal). Hoewel vormen het DNA complexen in LBS bij zure pH de hoogste transfectie opbrengsten50 geeft, kunnen DNA-PEI complexen als alternatief worden gevormd direct bij pH 7.4 (bijvoorbeeld in serumvrij DMEM). Als u DMEM voor formulier DNA complexen, het overslaan neutralisatie 1.3.5. In ieder geval is het essentieel dat geen serum aanwezig in het mengsel is bij de vorming van de complexen.
  4. Oogsten van cellen 48u na transfectie.
    1. Het medium gecombineerd en spoel de cellen een keer met 2 mL voorverwarmde PBS (37 ° C). Voeg 800 µL van PBS aangevuld met 0,5 mM EDTA en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Loskoppelen en het opschorten van de cellen door pipetteren omhoog en omlaag.
    2. Breng de celsuspensie in 1,5 mL tubes met 200 µL PBS aangevuld met 5 mM MgCl2.
    3. Centrifugeer gedurende 2 min op 800 x g en verwijder het supernatant.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. In dit geval, flash-freeze de pellets in vloeistof N2 en opslaan bij-80 ° C voor maximaal een maand. Draag altijd oog bescherming bril.
  5. Voeg 100 µL Tris lysis-buffermengsel (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA en vers toegevoegde PMSF) naar de cel pellets en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Ter vergemakkelijking van lysis, vortex elke 5 min.
  6. Spin down het puin van de cel voor 10 min bij 4 ° C en 14.000 x g en Pipetteer 90 µL van het supernatant in zwarte 96-wells-platen. Maatregel EGFP en mCherry fluorescentie met behulp van een afleesapparaat uitgerust met een fluorescentie-module.
    Opmerking: Gebruik van geschikte filters voor excitatie en emissie voor EGFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) en mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). Meetwaarden EGFP wordt verdeeld over een bereik tussen de mock-transfected cellen verkregen minimumwaarde en een maximumwaarde, die wordt meestal opgehaald uit wild-type EGFP. Zorgen voor het instellen van het venster van de correcte meting in het instrument.
  7. De efficiëntie van de ncAA beleggingsmaatschappij wordt berekend als de verhouding tussen de fluorescentie van het monster en de expressie van EGFP wild-type verkregen fluorescentie. Alle waarden zijn genormaliseerd naar mCherry fluorescentie.
    Equation 1

2. genetische opneming van ncAAs in GPCRs voor foto-crosslinking Mapping van Ligand-GPCR interacties (Figuur 3)

  1. Het handhaven van HEK293T cellen in DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO2.
  2. Zaad-cellen eergisteren transfectie.
    1. Loskoppelen van de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C in 0.05% trypsine/PBS aangevuld met 0,5 mM EDTA. Gebruik 1 mL trypsine/EDTA voor een 10-cm schotel. Doven met 10 volumes van volledige medium en resuspendeer de cellen door pipetteren omhoog en omlaag. Het aantal cellen in de opschorting die met behulp van een hemocytometer-49.
    2. Zaad 5.0 x 105 293T cellen per putje in 2 mL volledige groeimedium in 6-Wells-platen. Voor elke positie worden vertoond, wordt 1 goed per ligand plus één goed voorbereiden door de bindende controle33,38. Een extra goed om te zijn transfected met de wild-type (wt) receptor kan worden opgenomen om te controleren van het niveau van de expressie van de mutant.
  3. Overmorgen, controle samenvloeiing (gebied bezet door de cellen) onder een microscoop. Transfect cellen aan ~ 70% samenvloeiing met behulp van PEI.
    1. 1 uur vóór de transfectie, breng Azi in alle putjes met een eindconcentratie van 0,5 mM.
      1. Voorbereiden van een stamoplossing van 0,5 M van Azi. Per 6-well plaat, weeg 1,2 mg Azi in een buis en ontbinden in 15 µL 0,5 M NaOH. Verdun de stockoplossing in 1.2 mL volledige middellange en voeg 200 µL van het mengsel aan elk putje.
        Opmerking: Een verse stockoplossing van Azi voorbereiden op elk experiment. De azide deel daarvan heeft een korte halfwaardetijd in waterige oplossingen, met name bij fundamentele pH, en de AziRS omvat de intact, maar ook de aangetaste vorm.
    2. Transfect van een totaalbedrag van 2 µg DNA per putje: 1 µg plasmide codering voor de vlag-gelabeld GPCR rekening houdend met een TAG codon op de gewenste positie en 1 µg de plasmide codering voor de orthogonale paar gewijd aan Azi (E2AziRS51 en 4 exemplaren van de cognaat suppressor-tRNA BstYam)33,,38.
      Opmerking: Wanneer met inbegrip van een vergelijking van de wt om te controleren van expressie niveaus, transfect een lagere hoeveelheid plasmide DNA voor de wt-receptor. Afhankelijk van de GPCR, 0,2-0,5 µg plasmide codering van de wt receptor opbrengst vergelijkbare niveaus als 1.0 µg van de mutant plasmide. Transfect dezelfde hoeveelheid DNA in alle putjes, vullen het ontbrekende DNA met een mock (bijvoorbeeld een lege vector).
    3. Ga verder zoals beschreven in 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 h na transfectie, gaat u verder met stap 2.4 voor foto-crosslinking van de liganden of gaat u naar stap 2.5 voor directe oogsten en analyse voor het verifiëren van de receptor expressie.
  4. Foto-crosslinking van het ligand.
    1. Voorbereiden van een stamoplossing van 1.000 x ligand. Los de peptide ligand bij een concentratie van 100 µM in DMSO.
      Opmerking: De concentratie van het ligand, hangt af van de dissociatieconstante KD van de ligand-GPCR interactie. Een eindconcentratie van 100 x KD is aan te bevelen. Als het ligand peptide is een zout van trifluorazijnzuur (TFA), kunt u overwegen het gewicht van TFA bij de berekening van het molecuulgewicht (1 x TFA per fundamentele aminozuur in het peptide). Bedenk ook dat peptiden over het algemeen hygroscopisch zijn. Vermijd herhaalde bevriezing van peptide poeder en open nooit een peptide-container totdat het kamertemperatuur niet heeft bereikt.
    2. De 1:1,000 van de stockoplossing ligand in bindende buffer bestaande uit 0,1% BSA, 0,01% verdund Triton-X 100, 5 mM MgCl2 HEPES dissociatie buffer (HDB) met 12.5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES)-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl en 5 mM KCl. voorbereiden 1 mL per Azi-GPCR mutant. Het medium van de cel vervangen door 1 mL van de oplossing van het ligand. Incubeer gedurende 10 min op RT.
      Opmerking: Pas de incubatietijd naar de specifieke GPCR, administratieve verwerking van ligand kinetiek en receptor internalisering. Verlenging van de incubatietijd verbetert niet crosslinking opbrengsten.
    3. Bestralen van de monsters gedurende 20 minuten in een UV crosslinker op 365 nm met 5 x 8 W buizen en ~ 5 cm afstand aan de cellen. Loskoppelen van de cellen door pipetteren en ze vervolgens overbrengen naar een 1,5 mL reactiebuis. De cellen gedurende 3 minuten op 800 x g pellet en verwijder het supernatant.
    4. Ontbinden van een tablet van proteaseinhibitor (PI) in 1 mL 25 mM EDTA/H2O te maken van een stamoplossing van 50 x cocktail. Aliquot de PI stockoplossing en opslaan bij-20 ° C. Verdun de voorraad van 50 x 1:25 in HDB en resuspendeer de cel pellets in 50 µL van 2 x PI in HDB. Flash-freeze cellen in vloeistof N2.
      Opmerking: Draag oog bescherming bril. Op dit punt kunnen de monsters worden opgeslagen bij-80 ° C voor maximaal een maand. Ga verder met stap 2.6.
  5. Directe cel oogst.
    1. Het medium gecombineerd. Voeg 800 µL van 0.5 mM EDTA in HDB. Incubeer gedurende 10 min op RT of op ijs.
    2. Loskoppelen van de cellen door pipetteren op en neer en ze vervolgens overbrengen naar een 1,5 mL reactiebuis. Voeg 200 µL van 5 mM MgCl2 in HDB. De cellen gedurende 3 minuten op 800 x g pellet en verwijder het supernatant.
    3. Resuspendeer de cel pellets in 50 µL van 2 x PI in HDB en flash bevriezing in vloeistof N2. Draag oog bescherming bril.
      Opmerking: Op dit moment kunnen de monsters worden opgeslagen bij-80 ° C voor maximaal 1 maand.
  6. Lysis van de cel.
    1. Ontdooi de cellen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30-45 s en vortex kort. Houd monsters van nu af aan koude. Pellet membranen op 2.500 x g- en 4 ° C voor 10 min. Verwijder het supernatant, waarin het grootste deel van cytosolische eiwitten.
    2. Resuspendeer de pellets in 50 µL HEPES lysis-buffermengsel met 50 mM HEPES-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT en vers toegevoegd 2 x PI cocktail. Meng grondig. Lyse de cellen 30 min op ijs en vortex elke 5 min.
    3. Spin down het puin van de cel voor 10 min bij 14.000 x g- en 4 ° C. Onmiddellijk overbrengen in het supernatant een verse reactiebuis.
      Opmerking: Gaat u verder met de analyse meteen. De lysates kan worden achtergelaten bij-20 ° C, echter elke freeze-dooi cyclus schaadt de kwaliteit van de resultaten.
  7. Westelijke vlekkenanalyse.
    1. Te bereiden van het monster, neem 3-5 µL lysate en vul het maximaal 7 µL met H2O. toevoegen 2 µL 1 M DTT en 3 µL 4 x monster buffer met 63 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol en bromphenol van 0,04% blauw. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    2. Wanneer de GPCR is geglycosyleerde en vaag of vlekkerig bands zijn een probleem, deglycosylate monsters met PNGase F te verhogen van signaalsterkte en verscherpen de bands. Gebruik 3-5 µL lysate en deglycosylate in een totaal volume van 10 µL volgens protocol van de leverancier. Voeg 3 µL 4 x monster buffer.
      Opmerking: Membraaneiwitten zijn vaak geglycosyleerde in meerdere sites en Staten, die de kwaliteit van de resolutie in SDS-pagina analyse schaadt. Echter, niet niet deglycosylate de monsters voor analyse van het niveau van de expressie van de Azi-GPCR mutanten met Anti-Flag antilichamen omdat het is relevant voor het evalueren van het gedeelte van het volledig geglycosyleerde, volwassen receptor op het celoppervlak.
    3. Los van de monsters via standaard SDS-pagina en overdracht eiwitten naar een membraan PVDF vlek.
      Let op: Acrylamide is neurotoxisch. Draag handschoenen en oogbescherming.
    4. Blokkeren van het membraan voor 1 h op RT of 's nachts bij 4 ° C in 5% magere melk in TBS-T met 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 0,15 M NaCl en 0,1% Tween 20.
    5. Sonde het membraan met een anti-ligand antilichaam gevolgd door de HRP-geconjugeerde secundair antilichaam. Tussendoor wassen met TBS-T. U wilt opsporen van het niveau van de expressie van de Azi-GPCR, sonde het membraan met een commerciële HRP-antilichaam (Zie Tabel van materialen).
    6. Het uitvoeren van zelfgemaakte reagens van ECL-Verbeterde Chemiluminescentie (ECL) reactie en detecteren signalen voor 5 min. in het donker.

3. ultrasnelle Bioorthogonal Labeling van GPCRs op levende cellen van zoogdieren

Opmerking: Het protocol is geoptimaliseerd voor 4-well chambered coverslips (goed gebied = 2,2 cm2). Voor verschillende goed maten, moet het protocol dienovereenkomstig worden aangepast.

  1. Oppervlaktelaag van Microscoop dia's. De hele procedure onder de motorkap van een steriele uit te voeren.
    1. Voorbereiden van een hydrobromide van de poly-D-lysine (MW = 500-550 kDa) stockoplossing (PDL) met een concentratie van 1 mg/mL in 50 mM boraat buffer (pH 8,5). Bewaren bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden. Niet invriezen.
    2. Verdun de PDL stockoplossing 1:40 in steriele Ultra zuiver water met een eindconcentratie van 25 µg Mo/mL (werkende oplossing) en filtreer de oplossing door een 0,22 µm steriele filter.
      Opmerking: De werkoplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 3 maanden.
    3. Onder aan elk putje van de microscopie dia met 500 µL van de PDL werkoplossing volledig te dekken. Incubeer gedurende 20 min op RT en de PDL-werkoplossing gecombineerd.
      Opmerking: De werkoplossing PDL kan maximaal drie keer worden gebruikt. Als de oplossing opnieuw worden gebruikt moet, de gebruikte oplossing uit de gecoate dia's overbrengen in een verse steriele buis en label de buis dienovereenkomstig. Nooit mengen de gerecycled solution met verse oplossing.
    4. Spoel elke goed 3 x met ~ 700 µl steriele Ultra zuiver water en laat drogen voor minimaal 1 uur.
      Opmerking: Het is zeer belangrijk om te spoelen van de putten nauwkeurig, zoals residuen van de PDL-oplossing giftig voor de cellen zijn. De gecoate dia's kunnen worden gebruikt meteen voor microscopie of opgeslagen voor tot een week bij 4 ° C.
  2. Het handhaven van HEK293T cellen in DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO2.
  3. Zaad-cellen eergisteren transfectie.
    1. Loskoppelen van de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C in 0.05% trypsine/PBS aangevuld met 0,5 mM EDTA. Gebruik 1 mL trypsine/EDTA voor een 10-cm schotel. Doven met 10 volumes van volledige medium en resuspendeer de cellen door pipetteren. Het aantal cellen in de opschorting die met behulp van een hemocytometer-49.
    2. Zaad 1.0 x 105 HEK293T cellen per putje (gebied 2.2 cm²) in 600 µL kleurstof vrij compleet DMEM.
      Opmerking: Voor imaging-doeleinden, is het erg handig om te werken vanaf het begin in een medium dat niet elke kleurstof bevat. Kleurstof vrij DMEM formuleringen zijn commercieel verkrijgbaar.
  4. Controle over samenloop (gebied bezet door de cellen) onder een microscoop en transfect van de cellen aan ~ 70% samenvloeiing met behulp van een lipide gebaseerde transfectiereagens.
    1. 1 uur vóór de transfectie, bereiden een vers 100 mM stockoplossing van TCO * K in 0,2 M NaOH en 15% (v/v) DMSO.
    2. Per putje, Meng 3 µl van de TCO * K stockoplossing met 12 µL van 1 M HEPES pH 7.4. Voeg de oplossing voorzichtig toe aan de putjes voor een definitieve TCO * K concentratie van 0,5 mM.
    3. Bereiden een totaalbedrag van 500 ng DNA per putje. In een microcentrifuge buis, Verdun 200 ng van pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng van de plasmide codering voor de MbPylRSAF/tRNAPyl orthogonale paar (vier cassettes van tRNAM15) en 100 ng van pcDNA3.1_Arrestin3 plasmide in 50 µL medium (kleurstof vrij, serumvrij, antibioticum gratis).
      Opmerking: In het algemeen is mede transfectie van Arrestin niet nodig te observeren GPCR internalisering. Echter, mede transfecting Arrestin3 versnelt internalisering van de CRF1R, die is erg handig bij het analyseren van de internalisering van veel mutanten.
    4. Verdun 1,25 µL van het lipide gebaseerde transfectiereagens (2,5 µL per 1 µg van DNA) in 50 µL medium (kleurstof vrij, serumvrij, antibioticum gratis) en voeg de oplossing aan het DNA-mengsel. Vortex onmiddellijk en 5-10 min op RT. toevoegen-lipide-DNA complexen op de cellen uit te broeden.
      Opmerking: In onze ervaring transfected de morfologie van cellen lipide gebaseerde transfectie looks meer fysiologische vergeleken met die van cellen transfected met PEI. Als PEI hogere efficiëntie van de transfectie geeft, PEI de voorkeur verdient voor downstream toepassingen zoals Western blot, overwegende dat lipide gebaseerde transfectie een betere keuze is voor transfect van cellen voor imaging-experimenten.
  5. 24u na transfectie, label de receptor met fluorescente kleurstoffen.
    1. Bereiden van een 0,5 mM kleurstof-tetrazine-stockoplossing in DMSO en een 10 mg/mL kleurstofoplossing kleurstof voorraad in ultra zuivere H2O. DNA
    2. Pipetteer 100 µL medium uit elk putje in de reactiebuis van een 1,5 mL. 1.8 µL van de kleurstof-tetrazine-stockoplossing en 0,3 µL van het DNA voorraad kleurstofoplossing kleurstof toevoegen. Breng het medium met de kleurstoffen terug naar de put en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
      Opmerking: Tetrazine-oranje-belichting fluorescerende kleurstof heeft een eindconcentratie van 1,5 µM.
    3. Het medium gecombineerd en zachtjes spoel de cellen tweemaal met PBS te verwijderen overtollige van kleurstof. Voeg 600 µL van volledige kleurstof vrij groeimedium voorverwarmd tot 37 ° C.
  6. Fluorescentie microscopie en receptor internalisering.
    1. Visualiseren van de gelabelde receptoren onder 63 x (of soortgelijke) vergroting met behulp van filters die geschikt zijn voor GFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), oranje-belichting fluorescerende kleurstof (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) en DNA kleuring kleurstof (λ ABS: 350 nm; Λem: 461 nm). Een foto nemen met elk filter voor het activeren van de receptor.
    2. Bevordering van de receptor internalisering met behulp van 200 nM van Ucn1.
      1. Bereiden een 1000 x Ucn1 stockoplossing van 200 µM in DMSO.
        Opmerking: Afhankelijk van de oplosbaarheid van de peptide, mei u zitten kundig voor voorbereiden van de voorraad in zuiver water of buffer.
      2. Pipetteer 100 µL medium uit een put in de reactiebuis van een 1,5 mL en Voeg 0.6 µL van de stockoplossing van de agonist peptide. Breng de middellange terug in de put.
      3. Observeer de internalisering onder de Microscoop. Foto's nemen na het duidelijk aantoonbaar vóórkomen van internalisering (10-15 minuten tot uren, afhankelijk van de receptor en overexpressie van Arrestins) met behulp van de filters die eerder vermeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De omtrek van de fluorescentie-bepaling is afgebeeld in Figuur 1. De bepaling is werkzaam in drie toepassingen. Op de eerste plaats, worden een aantal tRNA varianten voor opneming van Lys(Boc) door de Pyl orthogonale paar gescreend. Lys(BOC) is een sterically vergelijkbaar met Pyl aminozuur. Zoals Pyl niet commercieel beschikbaar is, wordt Lys(Boc) meestal gebruikt als een standaard substraat voor de PylRS. De afgeschermde tRNAs zijn gebaseerd op het tRNAPyl. Elke variant tRNA draagt mutaties afzonderlijke basen of base-paar in de lussen en stengels rationeel ter verbetering van tRNA stabiliteit en compatibiliteit met de eukaryote vertalende machine. Alle details over tRNA design zijn beschreven in ons recente werk30. Typische resultaten worden beschreven in figuur 2A: verschillende tRNAs geven verschillende onderdrukking efficiëntie, dat komt duidelijk tot uiting in de hoeveelheid gemeten fluorescentie. De kleine foutbalken van biologische triplicates blijkt dat de waarden zeer reproduceerbaar. Op de tweede plaats, worden twee varianten van de gen van de E2AziRS26,51, waarin de foto-crosslinker p-azido-Phe (Azi), geëvalueerd. E2AziRS is afgeleid van het TyrRS E. coli . Één gen variant werkzaam inheemse E. coli codon gebruik, terwijl de tweede codon-geoptimaliseerd voor het gebruik in de H. sapiens was. De bepaling van de fluorescentie blijkt dat de codon-geoptimaliseerde variant hogere eiwit opbrengsten (figuur 2B geeft). Ten slotte, het bijmengingsgehalte van verschillende aminozuren voor de bioorthogonal Klik scheikunde zijn ten opzichte van (figuur 2C). Alle ncAAs die hier gepresenteerd (BCNK, TCO * K en SCOK) door de dezelfde orthogonale MbPylRSAF/tRNAPyl combinatie zijn opgenomen. Lys(Z) is ook opgenomen door dit paar en werd gebruikt als positieve controle. Ter illustratie van de betrouwbaarheid van de fluorescentie-assay, werden parallelle ncAA opneming experimenten uitgevoerd op een GPCR, de CRF1R. Westelijke vlekkenanalyse werd uitgevoerd om te schatten GPCR expressie (figuur 2B, C). Dezelfde trends geobserveerd met EGFP in de bepaling van de fluorescentie werden waargenomen met de CRF1R. Met name Azi opneming in CRF1R was zeer verbeterd bij het gebruik van het codon-geoptimaliseerde E2AziRS gen ten opzichte van de oorspronkelijke gen, waaruit blijkt dat zelfs een matige verbetering van 1,5-2-voudige voor een oplosbaar eiwit (EGFP) volgens de fluorescentie-bepaling kan hebben een grotere impact op het niveau van de expressie van meer uitdagende membraaneiwitten (figuur 2B). Als algemene opmerking, met betrekking tot het aantal tRNA cassettes worden gebruikt voor elke toepassing, wordt slechts één tRNA cassette aanbevolen wanneer screening van verschillende tRNAs ter vergemakkelijking van klonen procedures. Wanneer verschillende ncAARS of de efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs door dezelfde orthogonale paar screening, herhalingen vier tandem van de cassette zijn voorkeur te bereiken van de hoogste opbrengsten ncAA statuten tRNA.

Het geoptimaliseerde systeem voor Azi inbouw met inbegrip van het gehumaniseerd E2AziRS gen werd ingezet om de bindende zak van de CRF1R in kaart en definiëren van de binding-paden van 5 verschillende liganden: de twee peptide agonisten Ucn1 en CRF en de drie peptide-antagonisten Ucn1(8-40), CRF (9-41) en dFXCRF(12-41) (Figuur 3). Terwijl de efficiëntie van Azi opname eerder te zien was om te verlagen bij het naderen van de GPCR C-terminus33,34, kunnen onze geoptimaliseerde systeem voor Azi inbouw vergelijkbare expressie niveaus van Azi-mutanten met TAG-sites in verschillende delen van het gen GPCR (figuur 4A). De resultaten in figuur 4B Toon de screening van het extracellulaire lus 2 (ECL2) en helix V van CRF1R als een representatief gedeelte van het ligand-bindende zak. Een band op de juiste grootte van het crosslinking product blijkt dat de positie ligt in de nabijheid van het ligand in de ligand-receptor complex, dat wil zeggen het is onderdeel van de bindende zak. Meerdere crosslinking hits werden gevonden met alle liganden getest, onthullen verschillende bindende patronen voor de peptide-agonisten en de antagonisten. Het patroon van crosslinking hits bevat met name informatie over structurele elementen van de receptor. Een aantal opeenvolgende honkslagen, zoals waargenomen in de ECL2 (posities F260-R263 in combinatie met antagonisten) suggereert een flexibele lus-regio. Een patroon van hits elke drie tot vier residuen als in helix V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) hints richting een spiraalvormige structuur gevonden. Het scherm kan worden uitgebreid tot alle relevante domeinen van de GPCR. Als een 3D-structuur of een moleculair model van de receptor bestaat, kunnen ligand voetafdrukken worden gevisualiseerd door te wijzen op het crosslinking hits voor elke ligand (Figuur 5).

Zowel de fluorescentie en de westelijke vlek gegevens (figuur 2C) suggereren dat TCO * K is de ncAA voor bioorthogonal chemie die wordt opgenomen met de hoogste efficiëntie door de MbPylRSAF. Verschillende PylRS mutanten hogere opbrengsten van de opneming van andere klik ncAAs17zou kunnen geven, maar zij werden niet getest in deze studie. TCO * K werd opgenomen in een CRF1R-EGFP fusieproteïne en ingeschakeld installeren via SPIEDAC chemie (figuur 6A) een kleine lichte fluorophore op de receptor (figuur 6B). Als een bewijs van specifieke labeling, de fluorescentie van het label zichtbaar moet zijn alleen in de cellen, uiting geven aan de receptor (groene cellen in figuur 6B) en niet in de donkere cellen, die dus een interne negatieve controle in elk experiment. Receptoren label ultrasnelle SPIEDAC chemie met zijn nog steeds functioneel. Na het toevoegen van een peptide-agonist, werden fluorescerende compartimenten waargenomen gedurende het cytosol, onthullen de fysiologische proces van GPCR internalisering (Figuur 6 c). De signalen van de gesmolten EGFP samen met de fluorescente kleurstof te allen tijde, bevestigen de selectieve biorthogonal labeling van de GPCR gelokaliseerd.

Figure 1
Figuur 1: fluorescentie gebaseerde bepaling aan de evaluatie van de doeltreffendheid van een stop codon onderdrukking. HEK293 cellen zijn mede transfected met twee plasmiden in aanwezigheid van de ncAA. Een plasmide wordt gecodeerd voor de gewenste ncAARS en suppressor-tRNA. De tweede plasmide codeert voor het dragen van een TAG stop codon op een tolerante site samen met een mCherry-besturingselement EGFP-gen. Twee dagen na de transfectie, de groene en rode fluorescentie van geheel-cel lysates worden gemeten in een afleesapparaat. Als de EGFP N-segment stroomopwaarts die de stop codon (grijs) niet is TL, het rendement van full-length EGFP (groen) direct correleert met de efficiëntie van de opneming van de ncAA, terwijl mCherry (rood) een onafhankelijke verwijzing voor normalisatie biedt. De efficiëntie van de orthogonale systeem wordt gegeven door de verhouding tussen de hoeveelheid EGFP verkregen via stop codon onderdrukking en het bedrag van de wild-type EGFP verkregen door regelmatige vertaling (geen amber onderdrukking). De figuur wordt gewijzigd van Serfling, R. & munt, I; Opneming van onnatuurlijke aminozuren in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen methoden in enzymologie, 2016, 580, 89-107. 29 reproductie werd toegestaan door de auteursrecht Clearance Center van Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Representatieve toepassingen van de fluorescentie-bepaling. (A) Screening van tRNAPyl varianten30. HEK293 cellen werden mede transfected met de verslaggever plasmide en plasmiden codering voor het paar MbPylRS/tRNA (één exemplaar tRNA). In de staven van de relatieve fluorescentie van EGFP verkregen van de opneming van Lys(Boc) in vergelijking met wild-type EGFP. (B) de evaluatie van de invloed van codon-gebruik voor ncAARS genen. (linker paneel) Fluorescentie assay van cellen transfected met twee verschillende gene varianten van E2AziRS. (1) codon gebruik van E. coli en (2) gehumaniseerd gen. (rechtervenster) Westelijke vlekkenanalyse van CRF1R95Azi-vlag. De full-length receptor wordt gedetecteerd door een antilichaam Dizzee RASCAL. Actin β werd gebruikt als het laden van de controle. (C) de evaluatie van de efficiëntie van de opneming van drie ncAAs ontworpen voor de bioorthogonal scheikunde. (linker paneel) Structuren van ncAAs gebruikt in dit experiment. (1) LysZ, die werd gebruikt als positieve controle, (2) BCNK, (3) TCO * K en (4) SCOK. (centrale paneel) Fluorescentie kwantitatieve analyse van de HEK293 cellen transfected met een plasmide codering voor MbPylRSAF en vier kopieën van tRNA15 van (A) om op te nemen (1), (2), (3) en (4). (rechtervenster) Western blot analyse van een CRF1R-vlag mutant waarop één van de vier ncAAs op positie 95. Actin β werd gebruikt als het laden van de controle. Deelvenster A werd aangepast van Serfling, R. et al. Designer tRNAs voor efficiënte opname van niet-canonieke aminozuren door het systeem van de pyrrolysine in zoogdiercellen Nucleic Acids Res. 46 (1), 1-10 (2018) en zijn weergegeven volgens de Creative Commons Attribution licentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Schematische weergave van de foto-crosslinking Azi-gemedieerde toewijzing. Een foto-gevechts azido functie (gele ster) wordt geplaatst in een bepaalde positie binnen de receptor (grijs). Wanneer de azido-groep ligt proximaal aan de afhankelijke ligand (rood), een covalente crosslinking product wordt gevormd op UV-bestraling (gele cirkel geeft crosslinking site). De opneming van de azido groep in verschillende posities van de receptor onthult het bindende oppervlak (paars) van het ligand, waarmee de bindende zak. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Opname van Azi in de gehele CRF1R voor foto-crosslinking toewijzing van de bindende zak. (A) vergelijking van expressie niveaus van Azi-CRF1R-FLAG mutanten naar wild-type receptor. De Azi opneming sites zijn verspreid over de hele receptor zoals aangegeven in de bovenste rij. Dizzee RASCAL Western blots van geheel-cel lysates worden weergegeven. Actin β werd gebruikt als het laden van de controle. (B) Western blots gesondeerd met beide anti-CRF of anti-Ucn1 antilichamen worden weergegeven. De residuen vervangen door Azi zijn aangegeven in de bovenste rij. De cellen werden geïncubeerd met de liganden vermeld aan de rechterkant, gevolgd door UV-bestraling bij 365 nm en lysis. De monsters werden opgelost op 10% SDS-pagina, deglycosylated met behulp van PNGase F en geanalyseerd door het westelijke bevlekken. Het complex deglycosylated ligand-CRF1R wordt uitgevoerd op een zichtbaar MW van ~ 40 kDa33. De niet-kruisverwijzende ligand is niet gevonden (MW ~ 3-4 kDa). Beide panelen van dit cijfer zijn gewijzigd van Seidel, L. et al. Structural inzicht in de activering van een klasse B G-eiwit-gekoppelde receptor door peptide hormonen in levende menselijke cellen. Cleven. 6 10.7554/eLife.27711 en zijn gereproduceerd volgens de Creative Commons Attribution-licentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Voetafdrukken van peptide agonisten en antagonisten op de klasse B GPCR CRF1R. Vertegenwoordiging van de oppervlakte van de transmembrane domein van CRF1R. Standpunten van CRF1R dat kruisverwijzende de ligand wanneer vervangen door Azi worden gemarkeerd. Voetafdrukken van de peptide-agonisten CRF en Ucn1 zijn in magenta, voetafdrukken van de antagonisten CRF (9-41) en Ucn1(8-40) in het blauw gemarkeerd. De voetafdruk van de antagonist dFXCRF(12-41) wordt gemarkeerd in oranje. De zeven transmembraan helices ik-VII worden aangeduid met Romeinse cijfers. (A, B) Zijaanzicht van de zak van de binding van het membraan-vliegtuig. (C) Top weergave in de zak van de binding van de extracellulaire kant. Herdruk van Seidel, L. et al. Structural inzicht in de activering van een klasse B G-eiwit-gekoppelde receptor door peptide hormonen in levende menselijke cellen. Cleven. 6 10.7554/eLife.27711 en zijn gereproduceerd volgens de Creative Commons Attribution-licentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : SPIEDAC labeling van CRF1R op levende cellen. (A) reactie regeling van de spanning-bevorderd inverse elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie (SPIEDAC): de trans-cyclo-2-octene-groep van de ncAA TCO * K reageert met de tetrazine-groep gekoppeld aan de fluorophore Cy3. (B, C) HEK293T cellen uiten van CRF1R95TCO * K- EGFP. Beelden van de vertegenwoordiger van de groene, rode en blauwe kanaal. De grootte van de balk schaal is 10 µm. (B) cellen werden behandeld met tetrazine-Cy3 (1,5 µM) gedurende 5 minuten. Alleen cellen die uiting geven aan de receptor (groen) Toon vóórkomen van labeling (rood). (C) cellen werden behandeld met 200 nM Ucn1 en beeld na 15 min. intracellulaire vesikels komen met de verinnerlijkte receptor overeen. Panelen B en C zijn aangepast ten opzichte van Serfling, R. et al. Designer tRNAs voor efficiënte opname van niet-canonieke aminozuren door het systeem van de pyrrolysine bij zoogdiercellen Nucleïnezuur Res. 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) en zijn weergegeven volgens de Creative Commons Attribution-licentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare test om te beoordelen van de efficiëntie van orthogonale paren voor de opneming van ncAAs in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. Het belangrijkste voordeel van deze methode met betrekking tot de gebruikte testen op basis van FACS is dat het maakt het mogelijk gelijktijdig voorbereiding en meting van grotere aantallen monsters, en gegevens die gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van een gewone software levert. De beschikbaarheid van een middellange-doorvoer-methode voor het analyseren van orthogonale paren in zoogdiercellen is zeer belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe orthogonale paren en de verbetering van bestaande producten. Inderdaad, het is niet mogelijk voor het uitvoeren van gerichte evolutie van orthogonale paren via de generatie van grote willekeurige bibliotheken en dood/levend selectie in zoogdieren systemen. De bepaling kan screening kleine formaat bibliotheken (honderden leden) door een redelijke experimentele inspanning investeren binnen een relatief korte tijd. Door screening rationeel ontworpen tRNA sets via deze test, kunnen we genereren roman tRNAs, die de efficiëntie van de pyrrolysine systeem30aanzienlijk te versterken. De klassieke combinatie EGFP/mCherry wordt gebruikt voor de fluorescerende uitlezing, waarbij EGFP als verslaggever van de efficiëntie van de opname en mCherry als de interne controle fungeert. De verslaggever EGFP en de controle van de mCherry in de dezelfde plasmide zijn harbored maar zijn ingesloten in twee aparte expressie cassettes met twee onafhankelijke initiatiefnemers. Op deze manier mCherry uitdrukking heeft betrekking op de efficiëntie van de transfectie en cellen, maar is onafhankelijk van de expressie van EGFP, zodat de gemeten groene fluorescentie kan worden genormaliseerd naar de rode fluorescentie. Dit is niet precies het geval van andere verslaggevers gebouwd als een tandem van de twee eiwitten zoals EGFP-TAG-mCherry7 en iRFP-GFPY39TAG (met iRFP ter aanduiding van de infrarood fluorescent proteïne)52. In dergelijke constructies zijn beide eiwitten op de dezelfde transcriptie van mRNA. In eukaryoten ondergaan mRNAs rekening houdend met de voortijdige stop codonen surveillance en afbraak door de onzin-gemedieerde verval (NMD) mechanisme53. Daarom zowel de volgorde van de verslaggever en het besturingselement zijn tegelijkertijd aangetaste en expressie van de twee genen is niet strikt onafhankelijk. Soortgelijke testen op basis van een verslaggever luciferase in plaats van een verslaggever van de fluorescentie geweest beschreven door anderen54,55. Hoewel enzymatische luminescentie hogere gevoeligheid dan fluorescentie metingen biedt, bleek de laatste hoger reproduceerbaarheid tussen verschillende cel batches.

Robuuste systemen voor ncAA opneming in zoogdiercellen zijn absoluut nodig bij het werken met veeleisende eiwit doelen zoals membraaneiwitten en lage overvloedige eiwitten. We hebben hier laten zien een geoptimaliseerde orthogonale paar voor robuuste opneming van de foto-gevechts ncAA Azi in GPCRs. Het systeem geeft homogene Azi opneming tarieven gedurende de hele receptor waarmee voor de systematische toewijzing van de foto-crosslinking van hele GPCR oppervlakken en identificatie van ligand bandplaatsen. De twee hoofdpunten van de sterkte van de methode zijn dat verschillende liganden op de dezelfde receptor parallel kunnen worden geanalyseerd en dat de gegevens zijn ontleend aan de receptor in de levende cel, ter aanvulling van de in vitro methoden verkregen informatie. De methode is in principe van toepassing op geen eiwit-doelstelling, en leent zich ook om topologieën voor eiwit-eiwitinteractie in kaart. Bovendien kan de geïdentificeerde subset van kruisverwijzende posities verder worden geanalyseerd met 2D crosslinking naar pin-point intermoleculaire paren van proximale aminozuren in de bijbehorende complexe33,-38. Zo'n aminozuur paren bieden ruimtelijke beperkingen die zijn toegepast in silico experimenten om te bouwen van accurate moleculaire modellen van de interactie33,38. Vanuit het methodisch oogpunt is het waard te merken dat enige positieve resultaten uit crosslinking experimenten moeten worden beschouwd. Een standpunt dat deed niet dwarslijn kunnen nog steeds binnen de kritische straal van het ligand. Valse negatieven kunnen optreden wanneer de mutatie geïntroduceerd door de crosslinker de inheemse interactie belemmert, maar ook optreden kan wanneer het crosslinking of deel daarvan ofwel uit de buurt van het ligand wijst, of door het oplosmiddel is uitgeblust, intramoleculaire crosslinking ondergaat. Een cruciaal onderdeel van de methode is hoe te het vóórkomen van crosslinking detecteren. In de eerste plaats, worden geheel-cel lysates opgelost op SDS-pagina om te scheiden van een ligand die niet covalent aan de receptor gebonden is. Ten tweede, de covalente ligand-receptor-complex wordt gedetecteerd via het westelijke bevlekken met behulp van een anti-ligand antilichaam. Voor peptide liganden zijn hoge-affiniteit polyclonal antilichamen de ligand ingebracht de optimale keuze. Als alternatief, kunnen peptide liganden worden uitgerust met een vlag-tag op een tolerante positie, mits de tag toegankelijk voor het antilichaam Dizzee RASCAL door middel van een geschikt spacer gemaakt is. Biotine tags kunnen ook worden gebruikt, hoewel de resultaten kunnen moeilijk te interpreteren als gevolg van de achtergrond door endogene biotinyleerd eiwitten. Klein molecuul liganden zijn meestal radiolabeled, hoewel tag-labeling ook mogelijk56,,57 wellicht. Protocollen voor Azi inbouw in GPCRs zijn ook gepubliceerd door anderen57,58,59. Echter deze protocollen houdt het gebruik van drie plasmiden voor Azi opneming, terwijl we een eenvoudiger systeem voor twee-plasmide, met inbegrip van een gehumaniseerd gen voor E2AziRS, waardoor een beter resultaat met betrekking tot de niet-codon-geoptimaliseerde gebruiken één (figuur 2B).

Moderne microscopie technieken vereisen zeer heldere en efficiënte fluorophores installeren in de proteïne van belang, als genetisch gecodeerde eiwit fluorophores, zoals de klassieke EGFP zijn niet geschikt voor high-end toepassingen. Daarom is er een continue zoektocht van methoden waarmee het installeren van organische fluorophores op eiwitten, die heeft geleid tot de ontwikkeling van de populaire module60 en Halo61 tags, tussen anderen. Deze labels hebben echter nog een aantal verschillende kDa, die kan erover van de functie van het eiwit van de doelgroep en laat vrij een grote onzekerheid over de exacte positie van de fluorophore. Met een minimale grootte van een paar aminozuren vertegenwoordigt het tetracysteine motief een kleiner alternatief voor het nauwkeuriger labelen met behulp van fluoresce¨ une of resorufin arsenical verbindingen (FlAsH, ReAsH)62,63. Hoewel deze benadering is vereffend met veel succes ook GPCR studies64,65,66, het vereist uitgebreide wassen stappen met thiolen, het vaak lijdt aan hoge achtergrond, en in ieder geval niet toe positionering van het etiket met één residu resolutie. In plaats daarvan, voorzien van bioorthogonal ankers ncAAs bieden de mogelijkheid van het installeren van fluorescerende etiketten op een één aminozuur positie, dus het minimaliseren van het risico van inmenging met de inheemse bevleesdheid en de functionaliteit van het target-eiwit. Laatste generatie ncAAs voor de bioorthogonal scheikunde, zoals de TCO * K13 hier, in dienst hebt ingeschakeld eiwit etiketten rechtstreeks op levende cellen17,43. De methode is toepasbaar op de doelstellingen van de eiwitten op het celoppervlak, maar ook op de intracellulaire doelwitten, mits geschikt cel-permeabele kleurstoffen beschikbaar17,67,68 zijn. SPIEDAC chemie is verschillende ordes van grootte sneller met betrekking tot stam-bevorderd azido-alkyn cycloadditie (SPAAC) en Staudinger Bertozzi ligations op azide verankert2,,13. In feite, zijn verscheidene protocollen gepubliceerd voor GPCR etiketten op genetisch Azi opgenomen, maar ze alleen van toepassing op geïsoleerde GPCRs in vitro37,59,69 zijn. In plaats daarvan hebben wij aangetoond hier glad bioorthogonal etikettering van functionele GPCRs op de levende cel. Ons protocol is vergelijkbaar met de bestaande protocollen met behulp van de dezelfde chemie43,48,70, maar onze geoptimaliseerde ncAA opneming systeem breidt de reikwijdte van de methode GPCR studies. Een cruciale stap in de experimentele procedure is de keuze van de positie worden uitgewisseld met TCO * K, als niet alle posities binnen de receptor zijn toegankelijk voor de fluorescente kleurstof of vrijblijvend naar een vervanger. Daarom, verscheidene posities moeten worden beproefd in een voorlopige scherm te vinden meest geschikt.

Kortom, geeft dit werk gereedschappen voor algemene toepassing van ncAAs, met inbegrip van de toepassing op uitdagende eiwit doelen zoals GPCRs. Wij verwachten dat foto-crosslinking mapping en bioorthogonal etikettering, tegenwoordig de belangrijkste toepassingen van ncAAs aan GPCR studies, vele toekomstige toepassingen beide vindt te onthullen topologieën van GPCR interacties met liganden of andere eiwitten en te bestuderen GPCR structurele dynamica in de levende cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs er geen conflicten optreden te verklaren.

Acknowledgments

Dit werk is opgericht door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onder subsidies CO822/2-1 (Emmy Noether programma) en CO822/3-1 I.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

Chemie kwestie 134 niet-canonieke aminozuur (ncAA) amber stop codon onderdrukking opneming efficiëntie orthogonale amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren foto-crosslinking toewijzing eiwit bindende interfaces bioorthogonal chemie fluorescentie microscopie
Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Serfling, R., Seidel, L.,… More

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter