Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.
De genetische opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) via amber stop codon onderdrukking is een krachtige techniek om te installeren van kunstmatige sondes en reactieve wordt op eiwitten rechtstreeks in de levende cel. Elke ncAA is verwerkt door een speciale orthogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) paar die is geïmporteerd in het ontvangende organisme. De efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs kan sterk verschillen, en in sommige gevallen ontoereikend. Orthogonale paren kunnen worden verbeterd door het manipuleren van de jaarlijkse Activiteitenverslagen van of het tRNA. Gerichte evolutie van tRNA of jaarlijkse Activiteitenverslagen met behulp van grote bibliotheken en dood/levend Selectiemethoden zijn echter niet haalbaar in zoogdiercellen. Hier, wordt een facile en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling aan de evaluatie van de doeltreffendheid van orthogonale paren in zoogdiercellen gepresenteerd. De bepaling kan screening van tientallen tot honderden varianten van de jaarlijkse Activiteitenverslagen/tRNA met een matige inspanning en binnen een redelijke termijn. Gebruik van deze test voor het genereren van nieuwe tRNAs die aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de orthogonale systeem van pyrrolysine wordt beschreven, samen met de toepassing van ncAAs aan de studie van de G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs), die zijn uitdagend objecten voor ncAA mutagenese. Ten eerste, door het systematisch opnemen van een foto-crosslinking ncAA gedurende het extracellulaire oppervlak van een receptor, bandplaatsen van verschillende liganden op de intact receptor worden toegewezen rechtstreeks in de levende cel. Ten tweede, door de integratie van ncAAs van de laatste generatie in een GPCR, ultrasnelle catalyst-gratis receptor labelen met een fluorescente kleurstof wordt aangetoond, die exploiteert bioorthogonal stam-bevorderd inverse Diels-Alder cycloadditie (SPIEDAC) op de levende cel. Als ncAAs kan over het algemeen worden toegepast op elke proteïne onafhankelijk van de grootte, is de methode van algemeen belang voor een aantal toepassingen. Bovendien, ncAA opname niet vereist geen speciale apparatuur en gemakkelijk in standaard biochemie labs wordt uitgevoerd.
De genetische opneming van chemische sondes in eiwitten is een krachtige methode om onderzoek van structurele en dynamische aspecten van eiwitfunctie rechtstreeks in de oorspronkelijke context van de levende cel. Tegenwoordig kunnen honderden niet-canonieke aminozuren (ncAAs) uitgerust met de meest uiteenlopende chemische groepen worden site-specifically opgenomen in eiwitten door biosynthese1,,2,,3,4. Tussen hen, vindt men lichtgevoelig ncAAs zoals foto-crosslinkers5, foto-caged,6,7,8,9 en foto-schakelbare aminozuren10, 11, aminozuren, rekening houdend met gespannen alkenen en alkynen voor catalyst-gratis bioorthogonal chemie2,12,13,14,15,16 ,17, uitvoering dansyl18en cumarine9,19prodan20,21 fluorophores aminozuren en aminozuren uitgerust met andere biofysische sondes als goed zoals met post vertalende wijzigingen1,2,3,4,22,23,24,25.
De genetische codering van een ncAA is ingeschakeld door een toegewijde amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) gekoppeld aan een cognaat suppressor-tRNA, waarin de ncAA in reactie op een amber stop codon tijdens de reguliere ribosomal synthese. ncAARS/tRNA paren zijn ontworpen zodanig orthogonale in het ontvangende organisme, dat wil zeggen niet cross-talk met de endogene paren. De techniek is goed ingeburgerd, zowel in de prokaryote en eukaryote hosts en gemakkelijk toepasbare aan zoogdieren cellen. Paren voor ncAA opneming in zoogdiercellen zijn gebaseerd op de drie belangrijkste orthogonale systemen: het tyrosyl-systeem, dat de TyrRS van E. coli26 met een suppressor tyrosyl amber van B. stearothermophilus27 (EG combineert TyrRS /BstYam paar), de E. coli leucyl systeem (EGLeuRS/tRNALeuCUA paar)6,18,28 en de archaeële pyrrolysyl systeem (PylRS/tRNA Pyl paar)3, waarbij het tRNAPyl is een natuurlijke amber suppressor. In het algemeen wordt elke ncAA herkend door een gespecialiseerde ncAARS. Afhankelijk van de structuur van de ncAA, wordt de ncAARS verkregen via gerichte evolutie van TyrRS, LeuRS of PylRS, hoewel sommige synthetases meer dan één ncAA kunnen aanvaarden.
Door eenvoudig met behulp van een plasmide vector wordt de orthogonale paar ingevoerd in de cellen. Meest voorkomende en efficiënte plasmiden zijn bicistronic en coderen van zowel voor de synthetase en de vorming van de orthogonale paar29tRNA. Een tweede plasmide-codering voor de proteïne van rentedragende een amber codon op de site voor wijziging aangewezen is mede-transfected. De ncAA is gewoon toegevoegd aan het groeimedium cel. Echter, verschillende gespecialiseerde clientgroepen gebruiken vaak verschillende varianten van plasmide constructies zelfs voor de opneming van de dezelfde ncAA. Constructies verschillen in de rangschikking van de genen in de vector, de aard van de synthetase, de codon gebruik in de synthetase gen, de promotor gebruik, de variant van het tRNA en aantal tRNA expressie cassettes. Bovendien kan de efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs drastisch variëren als gevolg van de verschillende katalytische efficiëntie van de verschillende synthetases, de kwaliteit van het tRNA, en andere factoren-30. Daarom is het belangrijk om bij de hand hebben een snelle en betrouwbare methode om te evalueren van de doeltreffendheid van een orthogonale paar, zowel om te kiezen van het meest geschikte systeem voor een gewenste toepassing en voor het uitvoeren van sommige optimization stappen dat verbetering van de algehele eiwit expressie opbrengsten.
We hebben een eenvoudige en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling om te evalueren van de doeltreffendheid van orthogonale paren29 (Figuur 1) opgericht. In de analyse, cellen zijn mede transfected met de plasmide-codering voor de orthogonale paar, samen met een bicistronic verslaggever plasmide codering zowel voor de groen fluorescente proteïne, rekening houdend met een amber stop codon op een tolerante positie (EGFPTAG) en de mCherry gen. Rode en groene fluorescentie van geheel-cel lysates worden gelezen in afzonderlijke kanalen op een afleesapparaat in een 96-wells-plaat. De intensiteit van de groene fluorescentie direct correleert met de efficiëntie van amber onderdrukking, overwegende dat de intensiteit van de rode fluorescentie een directe schatting van de grootte van het te meten monster en de efficiëntie van de transfectie geeft. Met betrekking tot soortgelijke testen op basis van fluorescentie voorlezen geassisteerde cell sorting (FACS)31,32, de bepaling geeft een onmiddellijke en uitgebreide beoordeling van eiwit expressie in de cel van de hele bevolking, die meer is representatief zijn voor de gebruikelijke proefomstandigheden, en biedt een eenvoudiger data acquisitie en verwerking met standaard software. Globaal, is het belangrijkste voordeel van de bepaling dat een middellange tot een groot aantal monsters kan worden geanalyseerd in parallel. Met behulp van deze test, hebben wij een rationeel ontworpen bibliotheek van suppressor-tRNAs ter verbetering van de efficiëntie van de Pyl orthogonale systeem30gescreend. Dit werk beschrijft het experimentele protocol om het uitvoeren van deze test en voorbeelden van de toepassing ervan, met inbegrip van de optimalisering van de orthogonale paar voor de opneming van de foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanine (Azi) en de vergelijking van de efficiëntie van de integratie van verschillende aminozuren (Figuur 2).
De laatste jaren heeft ncAA tools hebben bewezen zeer krachtig te onderzoeken van structurele en functionele aspecten van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs)33,34,35,,36,,37 , 38. bij de mens, GPCRs vormen een grote familie van membraan receptoren (800 leden) en hoofddoelen voor therapeutische drugs vertegenwoordigen. Directe structurele karakterisering van GPCRs is nog uitdagend en complementaire biochemische methoden zijn zeer nodig voor hun onderzoek. We hebben een pionier in het gebruik van foto-crosslinking ncAAs kaart GPCR oppervlakken en ontdek ligand bindende zakken34. Via ons geoptimaliseerde systeem voor Azi inbouw, wij stelselmatig Azi opgenomen in het domein van de hele juxtamembrane van een GPCR rechtstreeks in de cellen van levende zoogdieren. Bij UV-bestraling vormt Azi een zeer reactieve nitrene soorten die covalent naburige moleculen vangt. Wanneer de ligand wordt toegevoegd aan het systeem, fungeert Azi als een sonde van de nabijheid te onthullen welke posities van de receptor komen dicht bij de afhankelijke ligand. Op deze manier werd de bindende wijze van het neuropeptide hormoon Urocortin (Ucn1) op de klasse B GPCR corticotropin-releasing-factor receptor itype 1 (CRF1R)33 voor het eerst onthuld. De laatste tijd hebben we verschillende bindende patronen van agonisten en antagonisten op de dezelfde receptor38vermeld. Een soortgelijke aanpak is toegepast door anderen te onthullen van de orthosteric en allosteric bandplaatsen van andere peptides en klein molecuul liganden op andere GPCRs39,40,41,42. Dit manuscript beschrijft het experimentele protocol toegepast in ons lab voor foto-crosslinking toewijzing van GPCR oppervlakken. De methode is relatief snel, eenvoudig en vereist geen speciale apparatuur, zodat zij is van toepassing in standaard biochemie labs. Nog belangrijker is, de aanpak biedt een waardevol instrument, niet alleen om te identificeren ligand bandplaatsen waar 3D Landeninformatie schaars zijn, maar ook ter aanvulling van de bestaande in vitro gegevens met informatie van volledig post-translationally gemodificeerde receptoren in de fysiologische omgeving van de levende cel.
De recente ontwikkeling van roman ncAAs invloed op de kant keten chemische groepen geschikt voor ultrasnelle katalysator-vrije bioorthogonal chemie heeft opengesteld van de mogelijkheid om te installeren van de laatste generatie fluorophores voor super-resolutie beeldvorming in eiwitten direct aan de levende cellen2,43. Dergelijke chemische ankers zijn gespannen cyclooctyne in SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne in BCNK12,17, en trans-cyclooctenes in TCO * K13,15,17 onder andere ncAAs herbergen een Norborneen16,17,44 of cyclopropeen45,46 deel daarvan. Omvangrijk ncAAs voor de bioorthogonal scheikunde middels een variant van de PylRS meestal aangeduid als PylRSAF zijn opgenomen (die aangeeft mutatie Y271A en Y349F in de M. barkeri PylRS), maar ook door andere ad hoc geëvolueerd ncAARSs17 , 44. de ankers van bioorthogonal reageren met tetrazine reagentia47 via omgekeerde elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie geven hoge labeling opbrengsten binnen een paar minuten43,48. Toepassing van deze krachtige aanpak op etiket GPCRs heeft echter zijn uitdagend als gevolg van een lage algemene efficiëntie van de orthogonale ncAA opneming systeem. Via ons uitgebreide Pyl systeem, hebben we onlangs aangetoond hoog rendement opneming van dergelijke aminozuren in GPCRs en ultrasnelle GPCR etiketten op het oppervlak van levende cellen van zoogdieren30. Gelabelde receptoren waren nog steeds functioneel, als ze fysiologisch geïnternaliseerd bij het activeren van de receptor met een agonist. Het experimentele protocol voor de opneming van bioorthogonal ankers in GPCRs en labeling volgt worden hier beschreven. GPCRs met kleine heldere fluorophores om uit te rusten is de eerste essentiële stap naar de studie van GPCR structurele dynamica in de levende cel via geavanceerde microscopie technieken.
Het protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare test om te beoordelen van de efficiëntie van orthogonale paren voor de opneming van ncAAs in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. Het belangrijkste voordeel van deze methode met betrekking tot de gebruikte testen op basis van FACS is dat het maakt het mogelijk gelijktijdig voorbereiding en meting van grotere aantallen monsters, en gegevens die gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van een gewone software levert. De beschikbaarheid van een middellange-doorvoer-…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk is opgericht door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onder subsidies CO822/2-1 (Emmy Noether programma) en CO822/3-1 I.C.
Chemicals | |||
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) | Carl Roth | 3029.1 | |
Ammonium persulfate (APS) | Carl Roth | 9592.2 | |
p-Azidophenylalanine (Azi) | Bachem | F-3075.0001 | |
Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | |
Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
Bovine serum albumine (BSA) | Carl Roth | 8076.2 | |
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) | NovaBiochem | 8540430100 | |
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) | Sichem | SC-8000 | |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
DTT | Carl Roth | 6908.1 | |
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) | home-made | 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal] | |
EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
EGTA | Carl Roth | 3054.1 | |
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) | Sichem | SC-8014 | |
FBS | Thermo Fisher (Gibco) | 10270106 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher (Gibco) | A1896701 | |
Glycerol | Carl Roth | 7533.1 | |
Glycin | Carl Roth | 3908.3 | |
HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
KCl | Carl Roth | 6781.3 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668019 | |
Luminol | Applichem | A2185,0005 | |
Methanol | Carl Roth | 0082.3 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.2 | |
NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
Na-Lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
NaOH | Grüssing | 121551000 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
p-Coumaric acid | Sigma-Aldrich | C9008-1G | |
poly-D-lysine hydrobromide | Corning | 354210 | |
PEI | Polysciences | 23966 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher (Gibco) | 11548876 (15140-122) | |
PMSF | Carl Roth | 6367.1 | |
PNGase F | NEB | P0704L | |
Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | |
PVDF membrane Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
Skim Milk Powder | Sigma | 70166 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Carl Roth | CN30.2 | |
Tetrazine-Cy3 | Jena Bioscience | CLK-014-05 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Carl Roth | 2367.3 | |
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) | Sichem | SC-8008 | |
TRIS | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
Trypsin 2.5% | Thermo Fisher (Gibco) | 15090046 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.2 | |
Wasserstoffperoxid (30%) | Merck | 1.07210.0250 | |
Cell lines | |||
HEK293 cells | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) | ACC-305 | |
HEK293T cells | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) | ACC-635 | |
Equipment | |||
Crosslinker Bio-Link 365 nm | Bio-Budget Technologies GmbH | 40-BLX-E365 | 5 x 8 Watt tubes |
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega | BMG LABTECH | ||
Plasmids | |||
Plasmid E2AziRS | The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) | Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter | |
POI-TAG mutant plasmids | Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position | ||
CRF1R-95TAG-EGFP | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | ||
HA-PTH1R-79TAG-CFP | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | ||
Arrestin3-FLAG | Synthesized by Genart (Life Technologies) | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | |
Antibodies | |||
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate | Sigma-Aldrich | A8592 | monoclonal, produced in mouse clone M2 |
Goat-anti-rabbit-HRP antibody | Santa Cruz | sc-2004 | |
Rabbit-anti-CRF antibody | home-made | PBL #rC69 | polyclonal [Turnbull] |
Rabbit-anti-Ucn1 antibody | home-made | PBL #5779 | polyclonal [Turnbull] |