Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Оптимизации генетическим включение химического зондов в GPCR для фото сшивки картирования и Bioorthogonal химии в живых клетках млекопитающих

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57069
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences, University of Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Легковесные флуоресценции пробирного представлен для оценки эффективности амино ацил тРНКГлу синтетаза/tRNA пар включению белков в клетках млекопитающих неканонических амино кислот (ncAAs). Описывается применение ncAAs учиться G-протеин рецепторов (GPCR), включая фото сшивки отображение привязки сайтов и bioorthogonal GPCR маркировки на живые клетки.

Abstract

Генетическая включение неканонических аминокислот (ncAAs) через желтый остановка кодон подавления является мощный метод для установки искусственных зондов и реактивной постановление на белки непосредственно в живой клетке. Каждый ncAA включены выделенный ортогональных подавитель tRNA/амино ацил ТРНК синтетазы (ОРСЕ) пару, которая импортируется в организме хозяина. Включение эффективность различных ncAAs может значительно отличаются и неудовлетворительным в некоторых случаях. Ортогональные пар может быть улучшена путем манипулирования ОРСЕ или тРНК. Однако направленной эволюции tRNA или ОРСЕ, использование больших библиотек и методы выбора мертвых/жив не осуществимо в mammalian клетках. Здесь представлен поверхностным и надежной основе флуоресценции пробирного для оценки эффективности ортогональных пар в mammalian клетках. Assay позволяет скрининг десятков до сотен вариантов ОРСЕ/tRNA с умеренным усилием и в разумные сроки. Использование этого анализа для создания новых tRNAs, которые значительно улучшают эффективность системы ортогональных Пирролизин описан, наряду с применением ncAAs к изучению G-белка в сочетании рецепторов (GPCR), которые являются сложными объектами для ncAA мутагенез. Во-первых путем систематического включения фото сшивки ncAA по всей поверхности внеклеточного рецептора, сайтов связывания различных лигандов на нетронутыми рецептор сопоставляются непосредственно в живой клетке. Во-вторых, путем включения последнего поколения ncAAs в GPCR, сверхскоростной катализатор свободных рецепторов маркировки с флуоресцентной краской свидетельствует, который эксплуатирует bioorthogonal штамма повышен обратная Дильс ольха циклоприсоединения (SPIEDAC) на живую клетку. Как ncAAs правило может применяться к любой белок, независимо от его размера, метод имеет общий интерес для ряда приложений. Кроме того ncAA включение не требует никакого специального оборудования и легко выполняется в лабораториях стандартных биохимии.

Introduction

Генетических включение химических зондов в белки это мощный метод для содействия расследованию структурных и динамических аспектов белков функции непосредственно в собственном контексте живой клетки. В настоящее время сотни неканонических аминокислот (ncAAs) оснащены наиболее разрозненные химических групп могут быть site-specifically включены в белки биосинтез1,2,3,4. Между ними, один находит Фото чувствительных ncAAs такие фото сшиватели5, Фото клетке6,,78,9 и фото переключаемый аминокислоты10, 11, аминокислоты, учитывая напряженные алкенов и алкинам бесплатно катализатор bioorthogonal химии2,12,13,14,15,16 ,17, аминокислоты, перевозящих Дансил18, кумарина9,19и21 флуорофоров продан20,и аминокислот с другими биофизических зонды как Ну как с поста поступательные изменения1,2,3,4,,2223,24,25.

Генетического кодирования ncAA включена на выделенный амино ацил тРНК синтетаза (ОРСЕ) паре родственных подавитель тРНК, который включает ncAA в ответ янтаря стоп-кодон во время регулярных рибосомных синтеза. ncAARS/tRNA пар спроектированы таким образом, чтобы быть ортогональные в организме хозяина, т.е. не кросс разговор с эндогенного парами. Методика является хорошо установленным в прокариот и эукариот хостов и легко применимые к mammalian клеток. Пар для включения ncAA в mammalian клетках основываются на трех основных систем ортогональных: тирозил системы, которая объединяет TyrRS E. coli26 с супрессор тирозил янтаря с б. stearothermophilus27 (Ec TyrRS /BstЯм пара),18,6, E. coli лейцил системы (Ecих/tRNAлеиCUA пара)28 и архей pyrrolysyl системы (PylRS/тРНК Пыль пара)3, whereby tRNAпыль природного янтаря супрессор. В общем каждый ncAA признается специализированных ncAARS. В зависимости от структуры ncAA ncAARS получается через направленной эволюции TyrRS, их или PylRS, хотя некоторые синтетаз может принимать более одного ncAA.

Ортогональные пара импортируется в клетки, просто используя вектор плазмиды. Наиболее распространенных и эффективных плазмид являются bicistronic и кодирования для синтетаза и тРНК, образуя ортогональных пара29. Второй плазмида кодировки для белка процентные янтаря кодон на сайте, предназначенные для модификации совместно transfected. NcAA просто добавляется к среднего роста клеток. Однако различные специализированные группы часто используют различные варианты конструкций плазмида даже для включения же ncAA. Конструкции отличаются расположения генов в вектор, тип синтетаза, использование кодон в синтетаза гена, Чистая Промоутер, вариант тРНК и количество кассет выражений тРНКГлу. Кроме того включение эффективность различных ncAAs могут сильно варьироваться из-за различных каталитической эффективности различных синтетаз, качество tRNA и другие факторы30. Таким образом важно иметь под рукой быстрый и надежный метод для оценки эффективности ортогональных пары, как выбрать наиболее подходящую систему для нужного приложения, так и для выполнения некоторых шагов оптимизации, которые улучшают общее выражение протеина урожайность.

Мы создали простой и надежной основе флуоресценции пробирного для оценки эффективности ортогональных пар29 (рис. 1). В assay клетки совместно transfected с кодировкой плазмиду для ортогональных пары, вместе с bicistronic репортер плазмида кодирования для зеленого флуоресцентного белка, принимая янтаря стоп-кодон в либеральной позиции (тегEGFP) и mCherry ген. Красный и зеленый флуоресценции целом-lysates клетки считываются в отдельных каналов на пластины читателя в 96-луночных пластине. Интенсивность флуоресценции зеленый напрямую коррелирует с эффективности работы автожелтого подавления, тогда как интенсивность флуоресценции Красного дает прямую оценку размера измеряемых образца и эффективность трансфекции. В отношении подобных анализов на основе флуоресценции вспомогательной ячейки, сортируя (FACS) зачитывает31,32, assay дает немедленное и всеобъемлющей оценки экспрессии белков клеточных населения, которая больше Представитель обычно экспериментальных условиях и предлагает упростить сбор и обработка данных со стандартным программным обеспечением. В целом основным преимуществом assay является, что от среднего до большого числа проб могут быть проанализированы параллельно. Используя этот assay, мы экранированный рационально разработан библиотека подавитель tRNAs для повышения эффективности Pyl ортогональные системы30. Эта работа описывает экспериментальный протокол для выполнения этот assay и показать примеры его применения, включая оптимизацию ортогональных пары для включения фото сшивки ncAA p-azido-L-фенилаланин (Ази) и сравнение Включение эффективность различных аминокислот (рис. 2).

За последние годы ncAA инструменты доказали очень мощный для изучения структурных и функциональных аспектов G-белка в сочетании рецепторов (GPCR)33,34,35,,3637 , 38. в организме человека, GPCR образуют большой семьи мембранных рецепторов (800 членов) и представляют собой главных мишеней для лекарственных средств. Прямые структурных характеристик GPCR еще сложной и весьма взаимодополняющими биохимические методы необходимы для их расследования. Мы первыми начали использовать Фото сшивки ncAAs карта GPCR поверхностей и обнаружить лигандом привязки карманы34. Используя наши оптимизированные системы для включения Ази, мы систематически учитываются Azi на протяжении всей juxtamembrane области GPCR непосредственно в живых клетках млекопитающих. После УФ-облучения Ази образует Высокореактивная nitrene видов, которые ковалентно захватывает соседних молекул. Когда лигандом добавляется к системе, Ази служит близость зонд выявить, какие позиции рецептора близко связанных лигандов. Таким образом режим привязки гормон нейропептида Urocortin I (Ucn1) на класс B GPCR АКТГ выпуская фактор рецептор типа 1 (CRF1R)33 был впервые открыт. В последнее время мы раскрыли собственный привязки шаблонов агонисты и антагонисты на же рецептора38. Аналогичный подход применяется другими раскрыть orthosteric и аллостерический привязки сайтов других пептидов и малых молекул лигандов на других GPCR39,40,,4142. Эта рукопись описывает экспериментальный протокол, применяется в нашей лаборатории для фото сшивки сопоставления GPCR поверхностей. Метод относительно быстро, просто и не требует никакого специального оборудования, так что это применимо в лабораториях стандартных биохимии. Важно отметить, что этот подход обеспечивает ценный инструмент не только для идентификации сайтов связывания лиганд, где 3D структурных данных не хватает, но и дополнить существующие в vitro данные с информацией от полностью post-translationally модифицированных рецепторов в физиологической среды живой клетки.

Недавнее развитие Роман ncAAs подшипника на стороне цепочки химических групп подходит для сверхбыстрой бесплатно катализатор bioorthogonal химии открыло возможность установки последнего поколения флуорофоров для супер-резолюции изображений в белки непосредственно на живой клетки2,43. Такие химические анкеры включают напряженными cyclooctyne в SCOK14, nonyne бицикло [6.1.0] в BCNK12,17и транс cyclooctenes в ТШО * K13,15,17 среди других ncAAs укрывательство норборненом16,17,44 или cyclopropene45,группу в составе46 . Громоздкие ncAAs bioorthogonal химии, включаются в вариант PylRS, обычно обозначается как PylRSAF (указанием мутации Y271A и Y349F в . м. barkeri PylRS), а также других специальных развивались ncAARSs17 , 44. анкер bioorthogonal реагируют с тетразина реагенты47 через обратные электрон спрос Дильса-Альдера циклоприсоединения давать высокие урожаи маркировки в течение нескольких минут43,48. Однако применение этого мощного подхода к этикетке GPCR была сложной из-за низкой общей эффективности системы ортогональных ncAA включение. С помощью нашей усовершенствованной системы пыль, мы недавно продемонстрировали высокодоходные включение таких аминокислот в GPCR и сверхскоростной GPCR маркировки на поверхности живой клетки млекопитающих30. Приклеенные этикетку рецепторы были до сих пор функциональна, как они физиологически внутреннюю активировав с агонистом рецепторов. Экспериментальный протокол для включения bioorthogonal якоря в GPCR и следующие маркировки шаги описаны здесь. Оснащение GPCR небольшие яркие флуорофоров является первый основной шаг к изучению GPCR структурной динамики в живой клетке через микроскопии передовых методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. на основе флуоресценции скрининг эффективности включения (рис. 1)

  1. Сохранить HEK293 клеток в среде Дульбекко изменение орла (DMEM; высокие глюкоза, 4 мм глутамина, пируват) с 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO2.
  2. Семян за день до transfection клетки.
    1. Отсоедините клетки для 5 минут при 37 ° C в 0,05%, которые трипсина/PBS с 0,5 мм ЭДТА. Используете 1 мл трипсина/ЭДТА 10 см блюдо. Утоляйте 10 томах полного среднего и Ресуспензируйте клетки, закупорить. Подсчитать количество клеток в суспензии с помощью Горяева49.
    2. Семя 6.0 x 105 HEK293 клеток на хорошо 6-ну плит в полный рост среднего 2 мл. Подготовьте столько скважин как количество образцов и два дополнительных скважин для EGFP одичал тип и макет transfected образец, соответственно.
  3. Контроль слияния (площадь, занимаемая клетки) под микроскопом. Transfect клетки при впадении ~ 70% с помощью реагента полиэтиленимина (PEI).
    1. 1 час до трансфекции, добавьте соответствующее количество свежеприготовленный раствор ncAA для всех скважин для конечной концентрации ncAA 0,25-0,5 мм. Добавьте ncAA всех скважин, включая положительный контроль одичал тип и макет transfected клеток, чтобы предотвратить различия в флуоресценции сигналы, которые могут быть вызваны эффекты ncAA на клеточного роста.
      Примечание: Подготовить акций решения, распустить ncAA на 0,1-0,5 М с помощью 0,2-0,5 М NaOH. Однако некоторые ncAAs может потребоваться начальный солюбилизация в ДМСО и/или нейтрализация четыре тома 1 м HEPES (рН 7,4) перед использованием. Обычно производитель рекомендует Протокол подготовить раствор.
    2. В пробки microcentrifuge смешайте 1 мкг плазмида ДНК кодирования для ncAARS/tRNA пары, чтобы быть протестированы с 1 мкг репортер плазмидной ДНК (183TAG- mCherry pcDNA3.0-EGFP). В отдельных труб Подготовьте идентичные трансфекции, используя ссылку EGFP одичал тип и макет transfection.
      Примечание: Количество копий tRNA кассеты, встроенных в плазмиду кодировку для пары ncAARS/tRNA зависит от приложения. Чтобы облегчить клонирование, 1 tRNA копии рекомендуется при отборе различных tRNAs, тогда как 4 копии рекомендуется (хотя и не обязательно) когда тестирования различных ncAARS или включение различных ncAAs же ортогональных парой.
    3. Каждая трубка содержащие ДНК добавьте 100 мкл лактата буферизации физраствора (LBS), содержащий Лактат натрия 20 мм на pH 4.0 и 150 мм NaCl. Перемешать кратко.
    4. В каждую пробирку содержащую ДНК в фунтов мкл 6 1 мкг/мкл PEI в фунтов (соотношение PEI/ДНК = 3/1 Вт/w) и вихрь немедленно. Инкубируйте на RT для 10-15 мин.
    5. Возьмите 400 мкл клеток средних от каждой скважины и добавить его в смесь ДНК-Пей для нейтрализации pH. Капать ДНК смесь на клетки.
      Примечание: DMEM обычно содержит фенола Красного как индикатор пэ-аша. Во время шага нейтрализации цвет смеси, добавил в трубке будет меняться от желтого (кислой) красный (нейтральный). Хотя формирование комплексов ДНК в фунтов на кислой рН дает высокие урожаи трансфекции50, комплексов ДНК-Пей в качестве альтернативы может быть сформирован непосредственно на рН 7,4 (например в сыворотке бесплатно DMEM). Если с помощью DMEM формы ДНК комплексы, пропустите шаг нейтрализации 1.3.5. В любом случае важно, что не сыворотки присутствует в смеси при формировании комплексы.
  4. Урожай после transfection клетки 48 ч.
    1. Аспирационная среднего и промойте клетки один раз с 2 мл подогретым PBS (37 ° C). 800 мкл PBS, дополнена 0,5 мм ЭДТА и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C. Отсоединение и приостановить клетки, закупорить вверх и вниз.
    2. Перенесите суспензию клеток в 1,5 мл пробирки, содержащие 200 мкл PBS, дополнена 5 мм MgCl2.
    3. Центрифуга для 2 мин на 800 x g и удалить супернатант.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. В этом случае флэш замораживание окатышей в жидкости N2 и хранить при температуре-80 ° C на срок до одного месяца. Всегда надевайте очки защита глаз.
  5. Добавить 100 мкл буфера lysis трис (50 мм трис-HCl рН 8,0, 150 мм NaCl, 1% X-100 Тритон, 1 мм ЭДТА и свежезаваренным добавлен PMSF) клеток гранул и инкубировать на льду за 30 мин. Для облегчения лизиса, вихревой каждые 5 мин.
  6. Спин вниз ячейки мусор за 10 мин при 4 ° C и g 14.000 x и перевести 90 мкл супернатант в черный 96-луночных пластины. Мера EGFP и mCherry с помощью читатель пластины оснащен модулем флуоресценции флуоресценции.
    Примечание: Используйте соответствующие фильтры возбуждения и выбросов для EGFP (λabs: 488 нм; λЭм: 509 Нм) и mCherry (λabs: 588 Нм; λЭм: 611 Нм). Измеренные значения EGFP охватит в диапазоне от минимального значения, полученные от МОК transfected клеток и максимальное значение, которое обычно получается из EGFP одичал типа. Позаботьтесь о настройке окна правильного измерения в документе.
  7. Эффективность ncAA включение рассчитывается как соотношение между флуоресценции образца и флуоресценции, полученные из выражения EGFP одичал типа. Все значения нормализованы в mCherry флуоресценции.
    Equation 1

2. генетические включения ncAAs GPCR для фото сшивки, сопоставление из взаимодействия лиганд-ХВГФ (рис. 3)

  1. Сохранить HEK293T клеток в среде DMEM дополнена 10% (v/v) FBS, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO2.
  2. Клетки семян за день до transfection.
    1. Отсоедините клетки для 5 минут при 37 ° C в 0,05%, которые трипсина/PBS с 0,5 мм ЭДТА. Используете 1 мл трипсина/ЭДТА 10 см блюдо. Утоляйте 10 томах полного среднего и Ресуспензируйте клетки, закупорить вверх и вниз. Подсчитать количество клеток в суспензии с помощью Горяева49.
    2. Семя 5.0 x 105 293T клеток на скважину в полный рост среднего 2 мл в 6-ну пластины. Для каждой позиции быть проверены Подготовьте 1 хорошо за лигандом плюс один колодец для привязки элемента управления33,38. Дополнительные хорошо чтобы transfected с рецепторами одичал тип (wt) могут быть включены проверить уровень экспрессии мутант.
  3. На следующий день после, контролировать слияния (площадь, занимаемая клетки) под микроскопом. Transfect клетки при впадении ~ 70% с помощью пей.
    1. 1 час до трансфекции, добавьте Azi всех скважин до конечной концентрации 0,5 мм.
      1. Подготовьте 0,5 М Стоковый раствор Ази. За 6-ну тарелку, взвесить 1.2 мг Ази в трубку и растворить его в 15 мкл 0.5 M NaOH. Разбавить раствор в 1,2 мл полного среднего и 200 мкл смеси для каждой скважины.
        Примечание: Подготовьте свежие Стоковый раствор Azi для каждого эксперимента. Азид остаток имеет короткий период полураспада в водных растворах, особенно на базовых pH, и AziRS включает в себя нетронутыми, но и деградированных формы.
    2. Transfect на общую сумму 2 мкг ДНК на хорошо: 1 мкг плазмида кодирования для флага тегами GPCR, принимая кодоном тег в нужное положение и 1 мкг плазмида кодировки для ортогональных пары, посвященный Azi (E2AziRS51 и 4 копии Когнаты подавитель tRNA Bstям)33,38.
      Примечание: При включении wt сравнения для проверки уровней выражение, transfect меньшее количество плазмидной ДНК для wt рецептора. В зависимости от GPCR, 0,2-0,5 мкг плазмида кодирования wt рецептор доходность аналогичных уровнях как 1,0 мкг мутант плазмиды. Transfect же количество ДНК на всех скважинах, заполнив недостающие ДНК с макет (например пустой вектор).
    3. Действуйте, как описано в 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 ч после трансфекции, продолжить либо с шаг 2.4 для фото сшивки лигандами или перейдите к шагу 2.5 для прямого сбора и анализа для проверки экспрессии рецепторов.
  4. Фото сшивки лиганд.
    1. Подготовка 1000 x лигандом Стоковый раствор. Растворите пептидных лигандов в концентрации 100 мкм в ДМСО.
      Примечание: Лиганд концентрация зависит от KD взаимодействие лиганд GPCR Константа диссоциации. Конечная концентрация 100 x KD рекомендуется. Если пептидных лигандов соль trifluoroacetic кислоты (ТФК), рассмотрим вес TFA при расчете молекулярная масса (1 x TFA за основные аминокислоты в пептида). Кроме того считают, что в целом гигроскопических пептиды. Избегать повторного замораживания порошковых пептида и никогда не открывайте контейнер пептид, до тех пор, пока она не достигла комнатной температуре.
    2. Разбавить раствор 1:1,000 лиганд в буфере привязки, состоящие из 0,1% BSA, 0,01% Тритон-X 100, 5 мм MgCl2 в HEPES диссоциации буфера (HDB), содержащий 12,5 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES)-HCl рН 7,4, 140 мм NaCl и 5 мм KCl. Подготовка 1 мл на Ази-GPCR мутант. Замените средой клеток с 1 мл раствора лиганда. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT.
      Примечание: Отрегулируйте время инкубации для конкретных GPCR, приходится лигандом кинетики и рецептор интернализации. Продлевая время инкубации не повысить урожайность сшивки.
    3. Облучить образцы для 20 мин в УФ сшивателя на 365 Нм с 5 x 8 Вт трубки и ~ 5 см расстояние до клетки. Отсоединить клетки, закупорить и перенести их в 1,5 мл реакции. Пелле клетки на 3 мин на 800 x g и удалить супернатант.
    4. Растворите таблетку ингибитора протеазы (PI) коктейль в 1 мл 25 мм ЭДТА/H2O сделать Стоковый раствор 50 x. Аликвота PI складе решения и хранить его при-20 ° C. Разбавить 50 x запас 1:25 в HDB и Ресуспензируйте клетки окатышей в 50 мкл 2 х пи в HDB. Флэш замораживание клеток в жидкости N2.
      Примечание: Носите очки защита глаз. На данный момент образцы могут храниться при температуре-80 ° C на срок до одного месяца. Перейдите к шагу 2.6.
  5. Урожай прямой клеток.
    1. Аспирационная среды. Мкл 800 0,5 мм ЭДТА в HDB. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT или на льду.
    2. Отсоедините клетки, закупорить вверх и вниз и перевести их в 1,5 мл реакции. Добавьте 200 мкл 5 мм MgCl2 в HDB. Пелле клетки на 3 мин на 800 x g и удалить супернатант.
    3. Ресуспензируйте клетки окатышей в 50 мкл 2 х пи в HDB и вспышки заморозить в жидкости N2. Носите очки защита глаз.
      Примечание: На данный момент образцы могут храниться при температуре-80 ° C до 1 месяца.
  6. Лизис клеток.
    1. Оттепель в клетки в водяной бане при 37 ° C за 30-45 s и вихревой кратко. Теперь держите холодной образцов. Пелле мембраны на 2500 x g и 4 ° C на 10 мин отбросить супернатанта, который содержит основную часть цитозольной белков.
    2. Ресуспензируйте гранулы 50 мкл HEPES литического буфера, содержащий 50 мм HEPES-HCl рН 7,5, 150 мм NaCl, 10% глицерина, 1% тритон X-100, 1,5 мм MgCl2, 1 мм EGTA, 1 мм DTT и свежезаваренным добавлены 2 х пи коктейль. Тщательно перемешать. Лизируйте клетки 30 мин на льду и вихревой каждые 5 мин.
    3. Спин вниз ячейки мусор за 10 мин в 14.000 x g и 4 ° C. Немедленно перевести супернатант в трубу свежие реакции.
      Примечание: Продолжите анализ сразу. Лизатов может храниться при температуре-20 ° C, однако, каждый цикл замораживания оттаивания ухудшает качество результатов.
  7. Западный анализ помаркой.
    1. Чтобы подготовить образец, взять 3-5 мкл lysate и заполнить его до 7 мкл с H2O. добавить 2 мкл 1 М DTT и 4 x 3 мкл пример буфер, содержащий 63 мм трис-HCl рН 6,8, SDS 2%, 10% глицерина и 0,04% bromphenol синий. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
    2. Когда ХВГФ гликозилированного и слабый или смазывают полосы являются проблемой, образцы deglycosylate с PNGase F для увеличения интенсивности сигнала и точить полос. Использование 3-5 мкл lysate и deglycosylate в общем объеме 10 мкл после поставщика протокола. Мкл 3 4 x буфер образца.
      Примечание: Мембранные белки часто являются гликозилированного в нескольких сайтов и государства, которая ухудшает качество резолюции в анализе SDS-PAGE. Однако делать не deglycosylate образцы для анализа выражения уровня мутантов Ази-GPCR, с использованием антител анти флаг, потому что он имеет отношение к оценить часть полностью гликозилированного, Зрелые рецептором на поверхности клетки.
    3. Разрешить образцы через стандартный SDS-PAGE и промокните передачи белки PVDF мембрану.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Акриламид нейротоксическое. Надевайте перчатки и защитные очки.
    4. Блокировать мембрана для 1 h на RT или на ночь при 4 ° C в 5% обезжиренное молоко в TBS-T, содержащий 20 мм трис-HCl рН 7,4, 0,15 М NaCl и 0.1% 20 анимации.
    5. Зонд мембраны с антитела анти лигандом следуют вторичное антитело проспряганное ПХ. В период между промыть TBS-T. Чтобы определить уровень экспрессии Ази-GPCR, зонд мембраны с коммерческой HRP антитела (см. Таблицу материалы).
    6. Выполните увеличенная хемолюминесценция (ЭСЛ) реакции с помощью домашнего ECL реагента и обнаружить сигналы за 5 мин в темноте.

3. Сверхбыстрая Bioorthogonal маркировки GPCR на живой клетки млекопитающих

Примечание: Протокол оптимизирован для 4-ну патрон coverslips (хорошо площадь = 2,2 см2). Для различных размеров хорошо протокол должен быть расширены соответственно.

  1. Поверхность покрытия скольжениях микроскопа. Осуществляют всю процедуру под капотом стерильные.
    1. Подготовить поли D-лизин гидробромида (MW = 500-550 кДа) раствор (PDL) в концентрации 1 мг/мл в 50 мм Борат буфере (рН 8,5). Хранить при 4 ° C на срок до 6 месяцев. Не замораживать.
    2. Разбавить раствор 1:40 PDL в стерильных ультра-чистой воде до конечной концентрации 25 мкг/мл (рабочий раствор), а затем фильтр решение через 0,22 мкм стерильным фильтром.
      Примечание: Рабочий раствор может храниться при температуре 4 ° C на срок до 3 месяцев.
    3. Полностью охватывают в нижней части каждой скважины микроскопии слайд с 500 мкл рабочего раствора PDL. Проинкубируйте втечение 20 мин в RT и аспирационная PDL рабочего раствора.
      Примечание: PDL рабочего раствора может использоваться до трех раз. Если решение необходимо повторно использовать, передавать используемое решение с покрытием слайды на свежие стерильную пробирку и этикетке трубки соответственно. Никогда не смешивайте рециркулированных решение с свежий раствор.
    4. Промойте каждый хорошо 3 x с ~ 700 мкл стерильные ультра-чистой водой и высушить для по крайней мере 1 час.
      Примечание: Это очень важно Промыть лунки точно, как остатки раствора PDL токсичны для клеток. Покрытые слайды могут быть использованы сразу для микроскопии или хранящиеся на срок до одной недели при 4 ° C.
  2. Сохранить HEK293T клеток в среде DMEM дополнена 10% (v/v) FBS, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO2.
  3. Клетки семян за день до transfection.
    1. Отсоедините клетки для 5 минут при 37 ° C в 0,05%, которые трипсина/PBS с 0,5 мм ЭДТА. Используете 1 мл трипсина/ЭДТА 10 см блюдо. Утоляйте 10 томах полного среднего и Ресуспензируйте клетки, закупорить. Подсчитать количество клеток в суспензии с помощью Горяева49.
    2. Семя 1.0 x 105 HEK293T клеток на колодец (площадь 2.2 см²) в 600 мкл красителя свободной полный DMEM.
      Примечание: Для визуализации целей, это очень удобно для работы с самого начала в среде, которая не содержит каких-либо красителей. Краситель бесплатные DMEM формулировки являются коммерчески доступными.
  4. Контроль слияния (площадь, занимаемая клетки) под микроскопом и transfect при впадении ~ 70% с помощью реагент на основе липидов transfection клетки.
    1. 1 час до трансфекции, подготовить свежая 100 мм Стоковый раствор ТШО * K 0,2 М NaOH и 15% (v/v) ДМСО.
    2. В Ну, смешать 3 мкл TCO * K Стоковый раствор с 12 мкл 1 М HEPES рН 7,4. Аккуратно добавить решение в колодцы для окончательного TCO * K концентрация 0,5 мм.
    3. Подготовьте общее количество 500 нг ДНК в колодец. В пробки microcentrifuge, разбавить 200 нг pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 нг плазмида кодировку для MbPylRSAF/tRNAпыль ортогональных пара (четыре кассеты tRNAM15) и 100 нг pcDNA3.1_Arrestin3 плазмида в 50 мкл среднего (краситель бесплатно, сыворотка бесплатно, антибиотик бесплатно).
      Примечание: В общем, Сопредседатель transfection Arrestin нет необходимости соблюдать GPCR интернализации. Однако, совместно transfecting Arrestin3 ускоряет интернализации CRF1R, что очень удобно при анализе интернализации многих мутантов.
    4. Разбавить 1,25 мкл Реагента липидных трансфекции (2,5 мкл на 1 мкг ДНК) в среде 50 мкл (краситель бесплатно, сыворотка бесплатно, антибиотик бесплатно) и добавить решение в смеси ДНК. Вихрь немедленно и инкубировать 5-10 мин на RT. Add ДНК липидных комплексов в клетки.
      Примечание: По нашему опыту морфологию клеток transfected с помощью трансфекции липидных выглядит более физиологичен по сравнению с которые клеток transfected с пей. Как ПЭЙ дает более высокую эффективность трансфекции, пей предпочтение следует течению приложений, как Западная помарка, в то время как на основе липидов трансфекции является лучшим выбором для transfect клеток для визуализации экспериментов.
  5. 24 ч после трансфекции, метка рецепторов с флуоресцентными красителями.
    1. Подготовить 0,5 мм краска тетразина раствор в ДМСО и 10 мг/мл ДНК, окрашивание Стоковый раствор красителя в ультра-чистой H2O.
    2. Перевести 100 мкл среднего от каждой скважины в 1,5 мл реакции. Добавление 1.8 мкл Стоковый раствор красителя тетразина и 0,3 мкл ДНК, окрашивание Стоковый раствор красителя. Перевести носитель содержит красители обратно в скважину и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
      Примечание: Тетразина оранжевый Люминесцентная краска имеет конечная концентрация 1,5 мкм.
    3. Аспирационная среднего и осторожно промойте клетки дважды с PBS для удаления избыточного красителя. 600 мкл полный краска, свободный рост среднего разогретую до 37 ° C.
  6. Люминесцентная микроскопия и рецепторов интернализации.
    1. Визуализировать помечены рецепторов до 63 x (или аналогичный) масштаб с помощью фильтров для GFP (λabs: 488 нм; λЭм: 509 Нм), краситель оранжево люминесцентные (λabs: 550 Нм; λЭм: 570 Нм) и ДНК, окрашивание краситель (λ АБС: 350 Нм; ΛЭм: 461 Нм). Сделайте снимок с каждым фильтром до активации рецептора.
    2. Содействие интернализации рецепторов, используя 200 Нм Ucn1.
      1. Подготовка 1000 Стоковый раствор x Ucn1 200 мкм в ДМСО.
        Примечание: В зависимости от растворимости пептида вы может быть в состоянии подготовить запас в чистой воде или буфера.
      2. Перевести 100 мкл среднего из колодца в 1,5 мл реакции и 0,6 мкл пептид агонист Стоковый раствор. Передачи средних обратно в скважину.
      3. Наблюдать за интернализации под микроскопом. Возьмите фотографии после явно обнаруживаемая возникновение интернализации (10-15 мин до часа, в зависимости от рецепторов и Гиперэкспрессия Arrestins) с помощью фильтров, упомянутых ранее.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наброски флуоресценции assay изображен на рисунке 1. В трех приложениях используется assay. В первую очередь проверяются несколько вариантов tRNA для включения Lys(Boc) пыль ортогональных парой. Lys(Boc) это аминокислота труднодоступных похож на пыль. Как пыль не является коммерчески доступных, Lys(Boc) обычно используется как стандартный субстрат для PylRS. Экранированный tRNAs основаны на tRNAпыль. Каждый вариант tRNA несет мутации одного баз или пар оснований в петли и стебли, рационально разработан для улучшения tRNA стабильности и совместимости с эукариотической трансляционного оборудования. Все подробности о tRNA дизайн описаны в нашей недавней работы30. Типичные результаты описаны в рисунке 2A: различные tRNAs дают различные подавления эффективность, которая ясно отражена сумме измерений флуоресценции. Небольшая ошибка бары биологических triplicates показывают, что значения высокую воспроизводимость. На втором месте оцениваются два варианты гена E2AziRS26,51, который включает фото сшивателя p-azido Пхе (Ази). E2AziRS является производным от TyrRS E. coli . Один вариант гена работает родной E. coli кодон использования, тогда как второй кодон оптимизирован для использования в H. sapiens. Assay флуоресценции показывает, что кодон оптимизированный вариант дает высокие урожаи белка (рис. 2B). Наконец, уровень включения различных аминокислот для bioorthogonal нажмите химии являются по сравнению (рис. 2 c). Все представленные здесь ncAAs (BCNK, TCO * K и SCOK) включены по той же паре ортогональных MbPylRSAF/tRNAPyl. Lys(Z) также включены с этой пары и был использован в качестве позитивного элемента управления. Чтобы проиллюстрировать надежность флуоресценции assay, параллельные ncAA включение эксперименты были проведены на GPCR, CRF1R. Вестерн-блот анализ был проведен для оценки выражения ХВГФ (Рисунок 2Б, C). С CRF1R наблюдались те же тенденции, наблюдается с EGFP в assay флуоресценции. Примечательно, Ази включения в CRF1R высоко повышалась при использовании по сравнению с родной гена, показаны, что даже умеренное улучшение 1,5-2 раза для растворимого белка (EGFP) согласно флуоресценции assay может иметь гена E2AziRS кодон оптимизированный большее влияние на уровень экспрессии более сложной мембранных белков (рис. 2B). Как общее замечание в отношении количество tRNA кассет, которые будут использоваться для каждого приложения только один tRNA кассеты рекомендуется при отборе различных tRNAs для облегчения процедуры клонирования. При отборе различных ncAARS или включение эффективность различных ncAAs же ортогональных парой, четыре тандемные повторы из tRNA, кассета предпочтительны для достижения высоких урожаев ncAA включение.

Оптимизированные системы для включения Ази, включая гуманизированные E2AziRS ген был развернут в карту привязки карман CRF1R и определить пути привязки 5 различных лигандов: два пептида агонисты Ucn1 и ОФД и три пептид антагонисты Ucn1(8-40), ОФД (9-41) и dFXCRF(12-41) (рис. 3). В то время как эффективность Azi включения ранее был показан снижаться при приближении GPCR C-конечная33,34, наши оптимизированные системы для включения Ази позволяет сопоставимых выражение уровня Ази мутантов с TAG-сайтов в разных частях гена ХВГФ (рис. 4A). Результаты в рисунке 4В показывают скрининг внеклеточная петля 2 (ECL2) и спирали V CRF1R представительной частью карман лиганд привязки. Полоса на правильный размер продукта сшивки показывает, что позиция лежит в близости лиганда внутри комплекса лиганд рецепторов, то есть он является частью карманных привязка. Несколько сшивки хитов были обнаружены все лигандами тестирование, выявление различных привязки шаблонов для пептида агонистов и антагонистов. В частности модель сшивки хитов предоставляет сведения о структурных элементах рецептора. Ряд последовательных хитов, как отмечалось в ECL2 (позиций F260-R263 в сочетании с антагонистами) предполагает Гибкая петля региона. Шаблон хитов, каждые три-четыре остатков как найдено в спирали V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) подсказки к спиральной структуры. Экран может быть продлен для всех соответствующих доменов GPCR. Если существует 3D структура или модель молекулярной рецептора, лигандом следы могут быть визуализированы, выделив сшивки показов для каждого лиганда (рис. 5).

Флуоресценции и Западная помарка данных (рис. 2 c) показывают, что TCO * K является ncAA bioorthogonal химии, которая получает включена с высокой эффективностью MbPylRSAF. Различные PylRS мутантов может дать более высокие урожаи включение других нажмите ncAAs17, но они не были проверены в этом исследовании. TCO * K была включена в CRF1R-EGFP синтез белка и включена установка через SPIEDAC химии (рис. 6A) маленький яркий Флюорофор на рецептор (Рисунок 6B). Как доказательство конкретных маркировки, флуоресцентной метки должны быть видны только в клетках, выражая рецептор (зеленые клетки в рисунке 6B) и не в темных клеток, которые таким образом обеспечивают внутреннего отрицательного контроля в каждом эксперименте. Рецепторы, помечены с помощью сверхбыстрого SPIEDAC химии по-прежнему функционируют. После добавления агонист пептид, флуоресцентный отсеков были замечены в цитозоле, раскрывая физиологический процесс ХВГФ интернализации (рис. 6 c). Сигналы плавленого EGFP, совместно локализованы с флуоресцентной краской во все времена, подтверждающий селективного биортогональный маркировки ХВГФ.

Figure 1
Рисунок 1: на основе флуоресценции анализа для оценки эффективности стоп-кодон подавления. HEK293 клетки совместно transfected с двумя плазмид в присутствии ncAA. Один плазмида кодирует для желаемого ncAARS и подавитель тРНК. Второй плазмида кодирует ген EGFP, принимая кодоном стоп тег в разрешительной сайте вместе с элементом управления mCherry. Через два дня после трансфекции, зеленой и красной флуоресценцией целом-lysates клетки измеряются в тарелку читателя. Как EGFP N-сегмента вверх по течению стоп-кодон (серый) не является флуоресцентные, выход полнометражного EGFP (зеленый) напрямую коррелирует эффективности ncAA включение, в то время как mCherry (красный) обеспечивает независимый справочник для нормализации. Эффективность системы ортогональных определяется соотношение между суммой EGFP, полученные через подавление кодон стоп и количество одичал тип EGFP, полученные путем регулярного перевода (не янтарь подавления). Этот показатель изменяется от Serfling, р. и монеты, я; Включение неестественные аминокислоты в белки, выраженные в Mammalian клетках, методы в энзимологии, 2016, 580, 89-107. 29 воспроизведение было разрешено центр Распродажа авторских Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель применения флуоресценции assay. (A) скрининг tRNAPyl варианты30. HEK293 клетки были совместно transfected с репортер плазмиды и плазмиды, кодирование для пары PylRS/tRNA Mb(одна копия тРНК). Бары представляют собой относительное флуоресценции EGFP, полученные от включения Lys(Boc), по сравнению с EGFP одичал типа. (B) Оценка влияния кодон-использования для ncAARS генов. (левая панель) Transfected пробирного флуоресценции клеток с двумя вариантами различных генов E2AziRS. (1) кодон использование от кишечной палочки и (2) гуманизированные гена. (правая панель) Вестерн-блот анализ CRF1R95Azi-флаг. Полнометражный рецептор обнаруживается антитело против флага. Актин β был использован в качестве загрузки элемента управления. (C) Оценка эффективности включения трех ncAAs предназначен для bioorthogonal химии. (левая панель) Структуры ncAAs, используемых в этом эксперименте. (1) LysZ, который был использован в качестве позитивного управления, (2) BCNK, (3) TCO * K и (4) SCOK. (Центральная панель) Transfected пробирного флуоресценции клеток HEK293 с плазмида кодировки для MbPylRSAF и четыре копии tRNA15 от (A) включить (1), (2), (3) и (4). (правая панель) Западной помарке анализ CRF1R-флаг мутант, принимая один из четырех ncAAs позиции 95. Актин β был использован в качестве загрузки элемента управления. Группа A был адаптирован от Serfling, R. et al. дизайнер tRNAs для эффективного включения неканонических аминокислот Пирролизин системой в mammalian клетках нуклеиновые кислоты Res. 46 (1), 1-10 (2018) и воспроизводятся согласно Creative Commons Присвоение лицензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Схематическое изображение карт фото сшивки Ази опосредованной. Фото активируемых azido функции (желтая звезда) помещается в определенной позиции в пределах рецептор (серый). Когда группа azido расположен проксимальнее привязанного лиганда (красный), ковалентных сшивки продукт образуется после УФ облучения (желтый кружок указывает сайт сшивки). Включение группы azido в различных позициях рецептора раскрывает привязки поверхности (фиолетовый) лигандом, который представляет привязку карман. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Включение Azi во всем CRF1R для отображения фото сшивки карманных привязка. (A) сравнение уровней выражение Ази-CRF1R-флаг мутантов к одичал типа рецепторов. Azi включения сайты распределяются в течение всего рецептор как указано в верхнем ряду. Показываются анти флаг западных помарках целом-lysates клетки. Актин β был использован в качестве загрузки элемента управления. (B) западных помарках исследован с либо анти ОФД или показаны антитела анти Ucn1. Остатков, заменены Azi указаны в верхнем ряду. Клетки инкубировали с лигандами, перечисленных справа, после облучения УФ 365 Нм и lysis. Образцы были урегулированы на 10% SDS-PAGE, deglycosylated с помощью PNGase F и проанализирован Западный blotting. Deglycosylated лиганд CRF1R комплекс работает на очевидной МВт ~ 40 кДа33. Не сшитый лигандом является не обнаружены (~ 3-4 МВт кДа). Обе панели этой фигуры были изменены из Зейделя, L. et al. структурных проницательность в активация G-белка сочетании рецептора класса B по пептидных гормонов в живых клетках человека. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 и они воспроизведены согласно лицензии Creative Commons Attribution. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Контуры пептид агонистов и антагонистов в классе B GPCR CRF1R. Поверхности представление трансмембранного домена CRF1R. Позиции CRF1R что высокоструктурированные подсвечены лиганда при замене Ази. Следы пептид агонисты ОФД и Ucn1, выделены пурпурный, следы антагонистов ОФД (9-41) и Ucn1(8-40) синим цветом. След антагонист dFXCRF(12-41) выделен оранжевым цветом. Семь трансмембранных спиралей I-VII обозначаются римскими номерами. (A, B) Боковой вид привязки карман от плоскости мембраны. Вид в карман привязки со стороны внеклеточного сверху (C) . Перепечатано из Зейделя, L. et al. структурных проницательность в активация G-белка сочетании рецептора класса B по пептидных гормонов в живых клетках человека. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 и они воспроизведены согласно лицензии Creative Commons Attribution. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : SPIEDAC маркировки CRF1R на живые клетки. (A) схема реакции Дильса-Альдера циклоприсоединения штамм способствует обратная электрон спрос (SPIEDAC): группа Транс цикло-2-octene ncAA TCO * K реагирует с группой тетразина связан с Флюорофор Cy3. (B, C) HEK293T клетки, выражая CRF1R95TCO * K- EGFP. Представитель изображений зеленого, красного и синего канала. Размер линейки шкалы-10 мкм. (B) клетки лечили тетразина Cy3 (1,5 мкм) за 5 мин. Только ячейки, выражая рецептор (зеленый) показывают возникновение маркировки (красный). (C) клетки обрабатывали 200 Нм Ucn1 и отображаемого после 15 мин внутриклеточных везикулы соответствуют внутренним рецептора. Панели, B и C изменяются от Serfling, R. et al. дизайнер tRNAs для эффективного включения неканонических аминокислот Пирролизин системой в mammalian клетках Нуклеиновые кислоты Res. 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) и являются воспроизводится в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол описывает простой и надежный анализа для оценки эффективности ортогональных пар для включения ncAAs в белки, выраженные в mammalian клетках. Главное преимущество этого метода в отношении широко используемых анализов на основе СУИМ является, что она позволяет одновременной подготовки и измерение большего числа образцов и предоставляет данные, которые легко анализируется с помощью обычного программного обеспечения. Доступность метода средне-пропускная способность анализировать ортогональных пар в клетках млекопитающих очень важно для развития новых ортогональных пар и совершенствование уже существующих. Действительно это не позволяет выполнить направленной эволюции ортогональных пар через поколения больших случайных библиотек и мертвых/жив отбора в системах млекопитающих. Assay позволяет скрининг малого размера библиотеки (сотни членов), инвестируя разумные экспериментальные усилия в течение относительно короткого времени. Путем проведения скрининга рационально разработаны наборы tRNA через этот assay, мы могли бы генерировать Роман tRNAs, которые значительно повышают эффективность системы Пирролизин30. Классическое сочетание EGFP/mCherry используется для флуоресцентных считывания, whereby EGFP служит репортер эффективности включения и mCherry как внутреннего контроля. Репортер EGFP и mCherry управления укрывал в же плазмида но внедряются в две отдельные выражения кассеты, принимая два независимых промоутеров. Таким образом mCherry выражение относится к трансфекции эффективность и клеток, но независимо от выражения EGFP, так что измеренных зеленой флуоресценцией может быть нормированы красной флуоресценцией. Это точно не касается других репортеров, построенный как тандем двух белков, таких как EGFP-тег mCherry7 и iRFP-GFPY39TAG (с iRFP, обозначающий инфракрасный флуоресцентный белок)52. В таких конструкций как белки на же стенограмма мРНК. У эукариот мРНК, учитывая преждевременное стоп-кодонов проходят наблюдения и деградации нонсенс опосредованной распада (NMD) механизм53. Таким образом последовательность репортер и управления одновременно деградированных и экспрессии генов, два не строго независимыми. Подобные анализы, основанный на репортера Люцифераза вместо флуоресценции репортер были описаны другие5554,. В то время как ферментативные люминесценции предлагает выше чувствительность, чем измерения флуоресценции, последний показал выше воспроизводимость между сериями различных клеток.

Надежные системы для включения ncAA в mammalian клетках абсолютно необходимы при работе с требованием белковых мишеней как мембранных белков и низкой обильные протеины. Мы показали здесь оптимизированный ортогональных пара для надежного включения фото активируемых ncAA Ази в GPCR. Система дает однородной Azi включения ставки на протяжении всей рецептор, который позволяет для систематического сопоставления фото сшивки всего GPCR поверхностей и идентификации сайтов связывания лиганда. Две основные моменты силы метода, что различные лигандов могут быть проанализированы на же рецептора параллельно и что данные являются производными от рецепторов в живой клетке, которая дополняет информацию, полученную от подходов в пробирке . Метод в принципе применима к любой цели белка и подходит также для сопоставления топологий белок белковых взаимодействий. Кроме того заданного подмножества высокоструктурированные позиций далее могут быть проанализированы с 2D сшивки в точечные межмолекулярных пар проксимальной аминокислот в связанный комплекс33,38. Такие пары аминокислоты обеспечивают пространственные ограничения, которые применяются в silico экспериментов строить точные молекулярные модели взаимодействия33,38. С методической точки зрения это стоит заметив, что следует рассматривать только положительные результаты от сшивки экспериментов. Позиция, что сделал не crosslink все еще может быть в пределах критического радиуса от лиганд. Ложные негативов может произойти при мутации, представленный сшивателя препятствует родной взаимодействия, но также может возникнуть при сшивки остаток очков от лиганд, или является закаленном растворителя либо подвергается внутримолекулярной сшивки. Важной частью метода является как обнаружить возникновение сшивки. В первую очередь всего-lysates клетки разрешаются на SDS-PAGE для разделения лиганд, привязанный не ковалентно с рецептором. Во-вторых комплекс ковалентных лиганд рецептор обнаруживается через западный blotting, используя антитело против лиганда. Для пептидные лиганды высокоспецифичных Поликлональные антитела против лигандом являются оптимальным выбором. В качестве альтернативы пептидные лиганды могут оснащаться флаг тегов в либеральной позиции, условии тег делается доступным для антитела анти флага через подходящий заполнитель. Биотин Теги может также использоваться, хотя результаты могут быть трудно интерпретировать фоне эндогенного биотинилированного белков. Малые молекулы лигандов обычно radiolabeled, хотя тег маркировки также может быть возможным56,57. Протоколы для включения Azi GPCR были также опубликованы другими57,,5859. Однако, эти протоколы включают использование трех плазмиды для включения Ази, в то время как мы используем простой системы двух плазмиды, включая гуманизированные гена для E2AziRS, который дает лучший результат в отношении кодон неоптимизированных один (рис. 2B).

Современные микроскопии методы требуют установки очень яркие и эффективной флуорофоров в протеин интереса, как генетически закодированный белка флуорофоров такие как классический EGFP, не подходят для мощных приложений. Таким образом есть непрерывный поиск методов, которые позволяют установку органических флуорофоров на белки, которая привела к разработке Популярные SNAP60 и61 Теги Halo, между другими. Однако такие теги по-прежнему имеют размер нескольких кДа, который может нарушить функции целевого белка и оставить достаточно большие неопределенности о точное положение Флюорофор. С минимальным размером в нескольких аминокислот tetracysteine мотив представляет собой меньший альтернативу для более точной маркировки с помощью флуоресцеин или resorufin мышьяковистых соединений (FlAsH, ReAsH)62,63. Хотя этот подход очень успешно применяется также к ХВГФ исследования64,65,66, он требует обширных Стиральная шаги с тиолами, он часто болеет высоким фона, и в любом случае, это не позволяет позиционирование этикетка с одного остатка резолюции. Вместо этого ncAAs оснащены bioorthogonal якорей предлагают возможность установки флуоресцентные метки на позиции одной аминокислоты, таким образом к минимуму риск вмешательства с родной конформации и функциональностью целевого белка. NcAAs последнего поколения для bioorthogonal химии, как TCO * K13 работают здесь, позволили белка маркировки непосредственно на живые клетки17,43. Этот метод применим к белковых мишеней на поверхности клетки, но и на внутриклеточные цели, условии, что подходящих клеток проницаемой красители являются наличие17,,6768. SPIEDAC химия несколько порядков быстрее в отношении штамм повышен azido алкины циклоприсоединения (SPAAC) и Штаудингера Bertozzi перешнуровок на азид якоря2,13. В самом деле были опубликованы несколько протоколов для маркировки на генетически GPCR включены Ази, но они применимы только к изолированным следственный GPCR в vitro37,,5969. Вместо этого, мы продемонстрировали здесь гладкие, bioorthogonal Маркировка функциональных GPCR на живую клетку. Наш протокол похож на существующие протоколы, используя же химии43,48,70, но наш оптимизированный ncAA включение системы расширяет сферу метод ХВГФ исследований. Важнейшим шагом в экспериментальной процедуры является выбор позиции быть обменянным с ТШО * K, как не все позиции в пределах рецептор разрешительной для замены или доступным для флуоресцентных красителей. Таким образом ряд должностей должны быть проверены в предварительном экран, чтобы найти наиболее подходящий.

В заключение эта работа представляет инструменты для общего применения ncAAs, включая приложения для сложных белковых мишеней например GPCR. Мы ожидаем, что фото сшивки картирования и bioorthogonal, маркировки, в настоящее время основные области применения ncAAs ХВГФ исследований, найдут много будущих приложений как раскрыть топологий GPCR взаимодействий с лигандами или других белков и учиться ХВГФ Структурная динамика в живой клетке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют конфликты не объявить.

Acknowledgments

Эта работа была основана на Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) под гранты CO822/2-1 (Эмми Нётер программы) и CO822/3-1-I.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

Химия выпуск 134 Non канонические аминокислоты (ncAA) янтарь стоп кодон подавление эффективности включения ортогональные амино ацил тРНКГлу синтетаза/tRNA пар Фото сшивки сопоставления интерфейсы связывания белков bioorthogonal химии микроскопии флуоресцирования
Оптимизации генетическим включение химического зондов в GPCR для фото сшивки картирования и Bioorthogonal химии в живых клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Serfling, R., Seidel, L.,… More

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter