En lättköpt fluorescens analysen presenteras för att bedöma effektiviteten av amino-acyl-tRNA-syntetas/tRNA par införliva icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) i proteiner som uttrycks i däggdjursceller. Tillämpningen av ncAAs att studera G-protein kopplade receptorer (varandra) beskrivs, inklusive foto-crosslinking kartläggning av bindande platser och bioorthogonal GPCR märkning på levande celler.
Genetiska införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) via bärnsten stop kodon dämpning är en kraftfull teknik för att installera konstgjorda sonder och reaktiva delarna på proteiner direkt i den levande cellen. Varje ncAA införlivas genom en dedikerad ortogonala suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-syntetas (AARS) par som importeras in i värd organismen. Inkorporering effektivitet av olika ncAAs kan skilja sig, och vara otillfredsställande i vissa fall. Ortogonala par kan förbättras genom att manipulera de årliga verksamhetsrapporterna eller tRNAen. Dock riktad evolution av tRNA eller AARS använder stora bibliotek och döda/levande urvalsmetoder inte är genomförbara i däggdjursceller. Här presenteras en lättköpt och robust fluorescens-baserad analys att utvärdera effektiviteten i ortogonala par i däggdjursceller. Analysen kan screening tiotals till hundratals AARS/tRNA varianter med en måttlig ansträngning och inom rimlig tid. Användning av denna analys att generera nya tRNAs att avsevärt förbättrar effektiviteten i pyrrolysine ortogonala systemet beskrivs, tillsammans med tillämpning av ncAAs på studiet av G-protein kopplade receptorer (varandra), vilket är en utmaning objekt för ncAA mutagenes. Först, genom att systematiskt införliva en foto-crosslinking ncAA i hela extracellulära ytan av en receptor, bindande platser av olika ligander på intakt receptorn mappas direkt i den levande cellen. Andra, genom att införliva senaste generationens ncAAs i en GPCR, ultrasnabb katalysator-fri receptor märkning med ett fluorescerande färgämne demonstreras, som utnyttjar bioorthogonal stam-främjade inverse Diels-Alder cykloadditionen (SPIEDAC) på den levande cellen. Som ncAAs kan tillämpas generellt på något protein självständigt på dess storlek, är metoden av allmänt intresse för ett antal applikationer. Dessutom ncAA inkorporering kräver inte någon särskild utrustning och utförs enkelt i standard biokemi labs.
Genetiska införlivandet av kemiska sonder i proteiner är en kraftfull metod för att underlätta utredningen av strukturella och dynamiska aspekterna av proteinfunktion direkt i det inhemska sammanhanget i den levande cellen. Nuförtiden, kan hundratals icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) utrustade med de mest olikartade kemiska grupperna anläggningsvis införlivas i proteiner av biosyntes1,2,3,4. Mellan dem, en finner ljuskänsliga ncAAs som foto-bindemedel5, Foto-bur6,7,8,9 och foto-omkopplingsbar aminosyror10, 11, aminosyror med ansträngda alkener och alkyner för katalysator-fri bioorthogonal kemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyror som transporterar dansyl18, kumarin9,19och prodan20,21 fluorophores och aminosyror som utrustade med övriga biofysiska sonder som väl som med post translationella modifieringar1,2,3,4,22,23,24,25.
Genetiska kodningen av en ncAA aktiveras som en dedikerad amino-acyl-tRNA-syntetas (AARS) ihopkopplade till en cognate suppressor-tRNA, vilken inlemmar ncAA som svar på en bärnstensfärgad stop kodon under regelbunden ribosomal syntesen. ncAARS/tRNA par är konstruerade så att de är ortogonala i värd organismen, dvs inte cross-talk med endogena paren. Tekniken är väl etablerade både i prokaryota och eukaryota värdar och enkelt tillämpas på däggdjurs celler. Par för ncAA inkorporering i däggdjursceller baseras på tre huvudsakliga ortogonalsystem: det tyrosyl systemet, som kombinerar TyrRS från E. coli26 med en tyrosyl bärnsten suppressor från B. stearothermophilus27 (EG TyrRS /BstYam par), i E. coli leucyl system (EGLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 och archaeal pyrrolysyl systemet (PylRS/tRNA Pyl par)3, whereby tRNAenPyl är en naturlig bärnsten suppressor. I allmänhet är varje ncAA erkänd av en specialiserad ncAARS. Beroende på ncAA struktur erhålls ncAARS genom riktad evolution av TyrRS, LeuRS eller PylRS, även om vissa synthetases kan acceptera mer än en ncAA.
Ortogonala paret importeras in i cellerna genom att bara använda en plasmid vektor. Mest gemensam och effektiv plasmider är bicistronic och koda både för kväveoxidsyntas och den tRNAen bildar den ortogonala par29. En andra plasmid kodning för proteinet av räntebärande en bärnstensfärgad kodon på den plats som utsetts för modifiering är samtidig transfekterade. NcAA är helt enkelt läggas till cell odlingsmedium. Dock använder olika specialiserade grupper ofta olika varianter av Plasmiden konstruktioner även för införlivandet av samma ncAA. Konstruktioner skiljer sig åt i arrangemanget av generna i vektor, typ av kväveoxidsyntas, kodon användning i kväveoxidsyntas genen, promotorn användning, variant av tRNA och antal tRNA uttryck kassetter. Dessutom kan införlivandet effektiviteten i olika ncAAs varierar drastiskt på grund av de olika synthetases, kvaliteten på tRNAen, och andra faktorer30olika katalytiska effektivitet. Därför är det viktigt att ha till hands en snabb och tillförlitlig metod för att bedöma effektiviteten av en ortogonal par, både att välja det lämpligaste systemet för ett önskat program och utföra vissa optimering steg som förbättrar övergripande proteinuttryck avkastning.
Vi har etablerat en enkel och robust fluorescens-baserad analys för att bedöma effektiviteten av ortogonala par29 (figur 1). I analysen, cellerna är samtidig transfekterade med plasmid kodning för rätvinkliga par, tillsammans med en bicistronic reporter plasmid kodning både för grönt fluorescerande protein med en bärnstensfärgad stop kodon vid en tillåtande position (andraTAG) och den mCherry gen. Röd och grön fluorescens av hela-cell lysates läses i separata kanaler på en tallrik läsare i en plattan med 96 brunnar. Intensiteten på den gröna fluorescensen korrelerar direkt med effektiviteten i bärnsten dämpning, medan intensiteten i röd fluorescens ger en direkt uppskattning av storleken på uppmätta provet och transfection effektivitet. Med avseende på liknande analyser baserat på fluorescens läsa assisterad cell sortering (FACS) upp31,32, analysen ger en omedelbar och omfattande bedömning av proteinuttryck i hela cellen befolkningen, som är mer representativa för vanliga experimentella förhållanden, och erbjuder en lättare datainsamling och bearbetning med standardprogramvara. Övergripande, den största fördelen med analysen är att ett medium till ett stort antal prover kan analyseras parallellt. Med denna analys, har vi ett rationellt designade bibliotek med suppressor-tRNAs att förbättra effektiviteten av Pyl ortogonala systemet30. Detta arbete beskriver det experimentellt protokollet för att utföra denna analys och visar exempel på sin ansökan, inklusive optimering av det ortogonala paret för införlivandet av den foto-crosslinking ncAA p-azid-L-fenylalanin (Azi) och jämförelse av inkorporering effektivitet av olika aminosyror (figur 2).
De senaste åren, ncAA verktyg har visat mycket kraftfullt att undersöka strukturella och funktionella aspekter av G-protein kopplade receptorer (varandra)33,34,35,36,37 , 38. i människor, varandra bildar en stor familj med membranreceptorer (800 medlemmar) och representerar huvudsakliga mål för terapeutiska läkemedel. Direkta strukturell karaktärisering av varandra är fortfarande utmanande och kompletterande biokemiska metoder behövs mycket för deras utredning. Vi har börjat använda sig av foto-crosslinking ncAAs att kartlägga GPCR ytor och upptäck ligand bindande fickor34. Använda vårt optimerade system för Azi iblandning, införlivas vi systematiskt Azi i hela domänen hela juxtamembrane av en GPCR direkt i levande däggdjursceller. Vid UV-bestrålning bildar Azi en mycket reaktiva nitrene arter som kovalent fångar närliggande molekyler. När liganden läggs till systemet, fungerar Azi som en närhet sond att avslöja vilka positioner av receptorn komma nära den bundna liganden. På detta sätt avtäcktes först bindande funktionsläget av neuropeptid hormonet Urocortin I (Ucn1) på klass B GPCR corticotropin-släppa-factor receptor typ 1 (CRF1R)33 . Nyligen, har vi lämnat ut distinkta bindande mönster av agonister och antagonister på samma receptor38. En liknande metod har tillämpats av andra att avslöja orthosteric och Alloster bindningsställen andra peptider och småmolekylära ligander på andra varandra39,40,41,42. Detta manuskript beskriver den experimentellt protokoll tillämpas i vårt labb för foto-crosslinking kartläggning av GPCR ytor. Metoden är relativt snabb och enkel och kräver inte någon särskild utrustning, så att den är tillämplig i standard biokemi labs. Allt metoden erbjuder ett värdefullt verktyg inte bara att identifiera liganden bindande platser där 3D grunddata är knappa, men också att komplettera befintliga in vitro- data med information från fullt post-translationally modifierade receptorer i den fysiologiska miljön i den levande cellen.
Den senaste utvecklingen av Roman ncAAs bär på side chain kemiska grupperna lämplig för ultrasnabb katalysator-fri bioorthogonal kemi har öppnat upp möjligheten att installera senaste generationens fluorophores för super-upplösning imaging i proteiner direkt på levande celler2,43. Sådana kemiska ankare inkluderar ansträngda cyclooctyne SCOK14, etylbicyklo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, och trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 bland andra ncAAs hysa en norbornen16,17,44 eller Otillagade45,46 biexponentiellt. Skrymmande ncAAs för bioorthogonal kemi införlivas genom en variant av den PylRS som brukar betecknas som PylRSAF (som anger mutation Y271A och Y349F i M. barkeri PylRS), as well as vid andra ad hoc- utvecklats ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankare reagerar med tetrazine reagens47 via omvänd elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen att ge märkning kickavkastningar inom några minuter43,48. Dock tillämpningen av denna kraftfulla metod till etiketten varandra har varit en utmaning på grund av en låg övergripande effektivitet ortogonala ncAA inkorporering. Med vår förbättrade Pyl-systemet, har vi nyligen visat hög avkastning införlivandet av sådana aminosyror i varandra och ultrasnabb GPCR märkning på ytan av levande däggdjursceller30. Märkt receptorer var fortfarande funktionella, som de internaliserat fysiologiskt vid aktivering av receptorn med en agonist. Det experimentella protokollet för införlivandet av bioorthogonal ankare i varandra och följande märkning steg beskrivs här. Förse varandra med små ljusa fluorophores är det första grundläggande steget mot studiet av GPCR strukturell dynamik i den levande cellen via avancerad mikroskopi tekniker.
Protokollet beskrivs ett enkelt och tillförlitligt test för att bedöma effektiviteten av ortogonala par för införlivandet av ncAAs i proteiner som uttrycks i däggdjursceller. Den största fördelen med denna metod i respekt till utbredda analyser baserat på FACS är att den tillåter samtidig beredning och mätning av större antal prover och ger data som analyseras enkelt med en vanlig programvara. Tillgången på en medium-genomströmning metod att analysera ortogonala par i däggdjursceller är mycket viktigt f…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har grundats av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) under bidrag CO822/2-1 (Emmy-Noether program) och CO822/3-1 till I.C.
Chemicals | |||
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) | Carl Roth | 3029.1 | |
Ammonium persulfate (APS) | Carl Roth | 9592.2 | |
p-Azidophenylalanine (Azi) | Bachem | F-3075.0001 | |
Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | |
Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
Bovine serum albumine (BSA) | Carl Roth | 8076.2 | |
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) | NovaBiochem | 8540430100 | |
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) | Sichem | SC-8000 | |
DMEM | Life Technologies | 41966052 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
DTT | Carl Roth | 6908.1 | |
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) | home-made | 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal] | |
EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
EGTA | Carl Roth | 3054.1 | |
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) | Sichem | SC-8014 | |
FBS | Thermo Fisher (Gibco) | 10270106 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher (Gibco) | A1896701 | |
Glycerol | Carl Roth | 7533.1 | |
Glycin | Carl Roth | 3908.3 | |
HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
KCl | Carl Roth | 6781.3 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668019 | |
Luminol | Applichem | A2185,0005 | |
Methanol | Carl Roth | 0082.3 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.2 | |
NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
Na-Lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
NaOH | Grüssing | 121551000 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
p-Coumaric acid | Sigma-Aldrich | C9008-1G | |
poly-D-lysine hydrobromide | Corning | 354210 | |
PEI | Polysciences | 23966 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher (Gibco) | 11548876 (15140-122) | |
PMSF | Carl Roth | 6367.1 | |
PNGase F | NEB | P0704L | |
Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | |
PVDF membrane Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
Skim Milk Powder | Sigma | 70166 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Carl Roth | CN30.2 | |
Tetrazine-Cy3 | Jena Bioscience | CLK-014-05 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Carl Roth | 2367.3 | |
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) | Sichem | SC-8008 | |
TRIS | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
Trypsin 2.5% | Thermo Fisher (Gibco) | 15090046 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.2 | |
Wasserstoffperoxid (30%) | Merck | 1.07210.0250 | |
Cell lines | |||
HEK293 cells | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) | ACC-305 | |
HEK293T cells | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) | ACC-635 | |
Equipment | |||
Crosslinker Bio-Link 365 nm | Bio-Budget Technologies GmbH | 40-BLX-E365 | 5 x 8 Watt tubes |
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega | BMG LABTECH | ||
Plasmids | |||
Plasmid E2AziRS | The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) | Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter | |
POI-TAG mutant plasmids | Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position | ||
CRF1R-95TAG-EGFP | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | ||
HA-PTH1R-79TAG-CFP | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | ||
Arrestin3-FLAG | Synthesized by Genart (Life Technologies) | Cloned in the MCS of pcDNA3.1 | |
Antibodies | |||
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate | Sigma-Aldrich | A8592 | monoclonal, produced in mouse clone M2 |
Goat-anti-rabbit-HRP antibody | Santa Cruz | sc-2004 | |
Rabbit-anti-CRF antibody | home-made | PBL #rC69 | polyclonal [Turnbull] |
Rabbit-anti-Ucn1 antibody | home-made | PBL #5779 | polyclonal [Turnbull] |