Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57069
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences, University of Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Abstract

Kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) yolu ile amber stop kodonu bastırma genetik birleşme yapay sonda ve reaktif moieties proteinleri üzerine doğrudan canlı hücre içinde yüklemek için güçlü bir tekniktir. Her ncAA ana bilgisayar organizma ithal bir adanmış ortogonal bastırıcı-tRNA/amino-asil-tRNA-sentetaz (AARS) çifti tarafından kurulmuştur. Farklı ncAAs birleşme verimliliğini büyük ölçüde farklılık gösterebilir ve bazı durumlarda yetersiz. Ortogonal çiftleri AARS veya tRNA manipüle ederek geliştirilebilir. Ancak, yönlendirilmiş evrim tRNA veya büyük kütüphaneler ve ölü/canlı seçim yöntemlerini kullanarak AARS değildir uygun memeli hücrelerinde. Burada, dik memeli hücreleri çiftinde verimliliğini değerlendirmek için bir facile ve sağlam Floresans tabanlı tahlil sunulur. Tahlil onlarca AARS/tRNA değişik bir orta çaba ile ve makul bir süre içinde yüzlerce tarama sağlar. Kullanım pyrrolysine ortogonal sisteminin performansını önemli ölçüde artıran yeni tRNA oluşturmak için bu testin anlatılan, ncAAs uygulamaya G-protein çalışmanın yanı sıra nesneleri ncAA için zorlu reseptörleri (GPCRs), birleşince mutagenesis. İlk olarak, sistematik bir reseptör ekstraselüler yüzeyi boyunca fotoğraf-crosslinking ncAA birleşmeyle, bozulmamış reseptör üzerinde farklı ligandlar bağlama siteleri doğrudan canlı hücre içinde eşleştirilir. İkinci, son nesil ncAAs bir GPCR birleşmeyle, floresan bir boya ile ultrafast katalizör-Alerjik reseptör etiketleme, hangi bioorthogonal zorlanma terfi ters Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) canlı hücre üzerinde olağanüstü başarı gösterilmiştir. NcAAs genellikle herhangi bir protein boyutuna üzerinde bağımsız olarak uygulanabilir gibi uygulamalar için genel ilgi yöntemidir. Buna ek olarak, ncAA birleşme herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve standart Biyokimya laboratuvarlarında kolayca gerçekleştirilir.

Introduction

Kimyasal probları genetik birleşme proteinlerin içine protein işlevi doğrudan canlı hücre yerli bağlamında yapısal ve dinamik yönleriyle incelenmesi kolaylaştırmak için güçlü bir yöntemdir. Günümüzde, kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) en farklı kimyasal gruplar ile donatılmış yüzlerce site-specifically protein biyosentezi1,2,3,4tarafından eklenebilir. Aralarında, bir fotoğraf-crosslinkers5, fotoğraf Kafesli6,7,8,9 ve fotoğraf değiştirilebilir amino asitler10, gibi fotoğraf duyarlı ncAAs bulur 11, amino asitler taşıyan gergin alkenes ve alkynes catalyst-Alerjik bioorthogonal kimya2,12,13,14,15,16 ,17, dansyl18, coumarin9,19ve prodan20,21 fluorophores taşıyan amino asitleri ve amino asitler biyofiziksel diğer probları ile donatılmış sonrası translasyonel modifikasyonlar1,2,3,4,22,23,24,ile25gibi iyi.

Genetik bir ncAA kodlama bir adanmış amino-asil-tRNA-ncAA yanıt olarak bir kehribar kodonu düzenli ribozomal sentezi sırasında birleştirmek soydaş bir bastırıcı-tRNA için eşleştirilmiş sentetaz (AARS) tarafından etkinleştirilir. ncAARS/tRNA çiftleri konak canlı, Yani değil çapraz-endojen çiftiyle hadis dik olacak şekilde tasarlanmıştır. Prokaryotik ve ökaryotik ana bilgisayarlar ve kolayca uygulanabilir memeli hücreleri hem de iyi kurulmuş bir tekniktir. Memeli hücrelerinde ncAA birleşme için çift üç ana ortogonal sistemlerinde temel alır: E. coli26 TyrRS bir tyrosyl amber bastırıcı B. stearothermophilus27 (Ec ile birleştiren tyrosyl sistemi TyrRS /BstYam çift), E. coli leucyl sistemi (EcLeuRS/tRNALeuCUA çifti)6,18,28 ve arke pyrrolysyl sistemi (PylRS/tRNA Pyl çifti)3, tRNAPyl bu sayede doğal kehribar bastırıcı. Genel olarak, her ncAA tarafından özel bir ncAARS tanınır. Her ne kadar bazı sentetaz birden fazla ncAA kabul edebilir ncAA yapısına bağlı olarak, ncAARS TyrRS, LeuRS veya PylRS, yönlendirilmiş evrim elde edilir.

Ortogonal çifti sadece bir plazmid vektör kullanarak hücre içine alınır. En yaygın ve etkin plazmid ortogonal çifti29şekillendirme tRNA sentetaz hem de encode ve bicistronic vardır. Kodlama değişikliği için belirlenmiş sitesinde bir kehribar kodon faizli protein için ikinci plazmid co transfected. NcAA sadece hücre büyüme ortamına eklenir. Ancak, farklı özel gruplar genellikle plazmid yapıları farklı türevleri bile aynı ncAA birleşme için kullanın. Düzenleme vektör, sentetaz türünü, kodon kullanım sentetaz gen, organizatörü kullanımı, değişken tRNA ve tRNA ifade kaset sayısı genlerin yapıları farklı. Ayrıca, farklı ncAAs birleşme verimliliği nedeniyle farklı katalitik verimini farklı sentetaz, tRNA ve diğer faktörler30kalitesini büyük ölçüde değişebilir. Bu nedenle, el altında dik çiftinin en uygun sistemi için istediğiniz uygulamayı seçin ve genel protein ifade geliştirmek bazı optimizasyon adımları gerçekleştirmek için verimliliğini değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem olması önemlidir verir.

Biz dik çiftleri29 (şekil 1) verimliliğini değerlendirmek için bir basit ve sağlam Floresans tabanlı tahlil kurduk. Assay olarak, plazmid ile birlikte her ikisi için bir kehribar kodonu izin veren bir konumda (EGFPetiketi) taşıyan yeşil flüoresan protein kodlama bicistronic muhabir plazmid ortogonal çifti için kodlama ile ortak transfected hücrelerdir ve mCherry gen. Bütün hücreli lysates kırmızı ve yeşil floresan bir plaka okuyucu bir 96-şey plaka üzerinde ayrı kanallarda okuyun. Kırmızı Floresans yoğunluğunu transfection etkinlik ve ölçülen örnek boyutunun doğrudan bir tahmin verir ise yeşil floresan yoğunluğu doğrudan kehribar giderme, verimliliği ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Floresans üzerinde dayalı benzer deneyleri ile ilgili olarak yardımlı hücre (FACS) sıralama okumak31,32, tahlil protein ifade acil ve kapsamlı bir değerlendirmesini daha fazla olan tüm cep telefonu topluluk içinde verir. Her zamanki deneysel koşullar, temsilcisi ve bir daha kolay veri toplama ve işleme standart yazılım ile sunmaktadır. Genel olarak, en büyük avantajı tahlil örnekleri çok sayıda orta paralel olarak analiz edilebilir olduğunu. Bu tahlil kullanarak, bastırıcı-tRNA Pyl ortogonal sistem30verimliliğini artırmak için mantıklı bir şekilde tasarlanmış bir kütüphane ekranlı. Bu eser bu tahlil gerçekleştirmek ve fotoğraf-crosslinking ncAA p-azido-L-fenilalanin (Polat) birleşme ortogonal çiftinin optimizasyonu ve karşılaştırılması gibi onun uygulama örnekleri göstermek için deneysel protokolünü açıklar birleşme verimliliği farklı amino asit (Şekil 2).

Geçen yıllar boyunca, yapısal araştırmak için çok güçlü kanıtlanmış ncAA araçları ve reseptörleri (GPCRs)33,34,35,36,37 G-protein fonksiyonel yönleri birleştiğinde , 38. insanlarda, GPCRs membran reseptörleri (800 üye) büyük bir aile oluşturmak ve tedavi edici ilaçlar için ana hedefleri temsil eder. GPCRs doğrudan yapısal karakterizasyonu hala meydan okuyor ve tamamlayıcı biyokimyasal yöntem son derece onların soruşturma için ihtiyaç vardır. Fotoğraf-çapraz ncAAs GPCR yüzeyler harita ve ligand bağlayıcı cepler34keşfetmek için kullanılmasına öncülük etmiştir. Polat birleşme için en iyi duruma getirilmiş sistemimizi kullanarak, biz sistematik olarak Polat GPCR canlı memeli hücrelerinde doğrudan, Bütün juxtamembrane etki alanı dahil. UV ışınlama Polat komşu molekülleri kovalent yakalar bir büyük ölçüde reaktif nitrene tür oluşturur. Ligand sisteme eklendiğinde, Polat hangi pozisyonlar reseptör ilişkili ligand yakın gel ortaya çıkarmak için bir yakınlık sonda olarak hizmet vermektedir. Bu şekilde, peptit hormon Urocortin ı (Ucn1) Sınıf B GPCR kortikotropin-serbest-faktör reseptör tarihinde 1 (CRF1R)33 tipi bağlama modu ilk açıldı. Son zamanlarda, farklı bağlama kalıpları agonistleri ve antagonistleri tarihinde aynı reseptör38ifşa. Benzer bir yaklaşım, orthosteric ve allosteric bağlayıcı siteleri diğer peptidler ve küçük molekül ligandlar tarihinde diğer GPCRs39,40,41,42ortaya çıkarmak için başkaları tarafından uygulanmıştır. Bu el yazması GPCR yüzeyler, fotoğraf-crosslinking eşleştirilmesine bizim laboratuvarında uygulanan deneysel protokolünü açıklar. Yöntem nispeten hızlı, basit ve böylece standart Biyokimya laboratuvarlarında uygulanabilir herhangi bir özel bir donanım gerektirmez. Önemlisi, yaklaşım sadece 3D yapısal verileri nerede kıt ligand bağlayıcı siteleri tanımlamak için aynı zamanda tam olarak post-translationally tarihinde reseptörleri üzerinden bilgileriyle varolan vitro verileri ek olarak değerli bir araç sağlar canlı hücre fizyolojik ortamı.

Roman ncAAs yan zinciri kimyasal gruplarında ultrafast katalizör-Alerjik bioorthogonal Kimya için uygun taşıyan son gelişme olasılığı son nesil fluorophores süper kararlılık düşsel için protein yüklemek için açtı 2,43doğrudan canlı hücreleri. Bu tür kimyasal dübel gergin cyclooctyne dahil SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK12,17ve trans-cyclooctenes toplam sahip olma maliyeti içinde * K13,15,17 diğer ncAAs arasında norbornene16,17,44 veya cyclopropene45,46 yan yataklık. Bioorthogonal kimya hantal ncAAs genellikle PylRSAF ile belirtilen PylRS varyanta göre dahil (mutasyon gösteren Y271A ve M. barkeri PylRS Y349F), yanı sıra diğer gelişti geçici ncAARSs tarafından17 gibi , 44. bioorthogonal çapa yüksek etiketleme verim içinde birkaç dakika43,48vermek için ters elektron isteğe Diels-Alder cycloaddition via tetrazine reaktifler47 ile tepki. Ancak, uygulama için etiket GPCRs güçlü Bu yaklaşımın ortogonal ncAA birleşme sistem düşük bir genel verimliliğini nedeniyle zor oldu. Gelişmiş Pyl sistemimizi kullanarak, son zamanlarda yüksek verimli birleşme gibi amino asitler GPCRs ve ultrafast GPCR canlı memeli hücreleri30yüzeyinde etiketleme göstermiştir. Fizyolojik bir agonist ile reseptör aktif hale getirildiğinde içselleştirilmiş gibi etiketli reseptörleri hala fonksiyonel. Deneysel protokol bioorthogonal birleşme GPCRs tutturur ve aşağıdaki etiketleme adımları burada açıklanmıştır. GPCRs küçük parlak fluorophores ile donatılması ilk temel doğru GPCR yapısal dinamiklerin canlı hücredeki çalışma yolu ile gelişmiş mikroskobu teknikleri adımdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Floresans tabanlı tarama birleşme verimliliği (şekil 1)

  1. Dulbecco'nın modifiye kartal orta HEK293 hücreleri korumak (DMEM; yüksek glikoz, 4 mM glutamin, pyruvate) % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2ile desteklenmiştir.
  2. Tohum hücreleri transfection önceki gün.
    1. Hücreleri % 0.05 tripsin/PBS 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de 5 dakika ayır. 1 mL tripsin/EDTA 10 cm yemek için kullanın. Tam orta 10 birimleri ile gidermek ve hücreleri pipetting tarafından resuspend. Hemasitometre49kullanarak süspansiyon hücreleri saymak.
    2. 6-iyi tabak 2 mL tam büyüme orta kuyu başına tohum 6.0 x 105 HEK293 hücre. Çok kuyu örnekleri ve iki ek kuyu sayısı olarak vahşi tipli EGFP ve sahte transfected örnek için sırasıyla hazırlayın.
  3. İzdiham (alan hücreler tarafından işgal) mikroskop altında kontrol. % ~ 70 izdiham polyethyleneimine (PEI) Reaktif kullanarak hücreleri transfect.
    1. 1 saat önce transfection, taze hazırlanmış ncAA hisse senedi çözüm uygun miktarda eklemek tüm kuyular için bir final ncAA konsantrasyon 0,25-0,5 mM. NcAA vahşi tipi olumlu denetim ve ncAA hücresel büyüme üzerine etkisi neden olabilir floresan sinyallerini farklılıkları önlemek için sahte transfected hücreleri de dahil olmak üzere tüm wells ekleyin.
      Not: Hisse senedi çözümleri hazırlamak için 0,1-0,5 için ncAA dağıtılması M istimal 0,2-0,5 M NaOH. Ancak, bazı ncAAs 1 M HEPES (pH 7,4) dört birimler kullanımdan önce tarafından DMSO içinde ilk solubilization ve/veya nötralizasyon gerekebilir. Yaygın olarak, üretici bir hisse senedi çözüm hazırlamak için bir protokol önerir.
    2. Bir microcentrifuge tüp plazmid DNA muhabir plazmid DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry) 1 µg ile test edilecek ncAARS/tRNA çifti için kodlama 1 µg karıştırın. Ayrı tüplerde EGFP vahşi-tür başvurusu kullanarak bir aynı transfection ve sahte bir transfection hazırlayın.
      Not: Plazmid ncAARS/tRNA çifti için kodlama içinde gömülü tRNA kaset kopyalarını uygulamaya bağlıdır. 4 kopya (kesinlikle gerekli de olsa) tavsiye edilir, ancak klonlama kolaylaştırmak için 1 tRNA kopya farklı tRNA, eleme önerilir zaman test farklı ncAARS veya aynı ortogonal çifti tarafından farklı ncAAs birleşme.
    3. Her tüp içeren DNA eklemek 100 µL laktat tamponlu tuz (LBS) 20 mM sodyum laktat pH 4.0 ve 150 mm NaCl içeren. Kısa bir süre karıştırın.
    4. Her tüpün içinde LBS 6 µL 1 µg/µL PEI eklemek LİBRE olarak DNA içeren (PEI/DNA oranı = 3/1 w/w) ve girdap hemen. RT 10-15 dk için kuluçkaya.
    5. Her kuyudan 400 µL cep orta alın ve pH nötralize etmek için DNA-PEI karışıma ekleyin. DNA karışımı hücreleri üzerine sür.
      Not: DMEM genellikle pH göstergesi olarak fenol red içerir. Nötralizasyon adımı sırasında kırmızı (nötr) sarı (asidik) tüp eklendi karışım rengini değiştirir. En yüksek transfection verimleri50DNA komplekslerinde LBS içinde şekillendirme asidik pH da, doğrudan pH 7,4 (örneğin DMEM) serum-Alerjik, DNA-PEI kompleksleri alternatif olarak oluşturulması mümkündür. DMEM form DNA komplekslerinde için kullanılıyorsa, 1.3.5 nötralizasyon adımı atlayın. Her durumda, hiçbir serum kompleksleri şekillendirme zaman karışımı mevcut esastır.
  4. Hücreleri 48 saat sonrası transfection hasat.
    1. Orta Aspire edin ve 2 mL Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) bir kez hücrelerle durulayın. 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş PBS 800 µL ekleyin ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Bağlantısını kesin ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetting tarafından askıya alma.
    2. Hücre süspansiyon 5 mM MgCl2ile takıma 200 µL PBS içeren 1,5 mL tüpler içine aktarın.
    3. Vasıl 800 x g 2 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Bu durumda, flash-granül sıvı N2 donma ve-80 ° C'de en fazla bir ay için saklayın. Her zaman göz koruma gözlük giymek.
  5. 100 µL Tris lizis arabellek ekleyin (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, % 1 Triton X-100, 1 mM EDTA ve taze ekledi PMSF) hücre topakları için ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya. Lizis, girdap her 5 dk kolaylaştırmak için.
  6. Spin aşağı 4 ° C ve 14.000 x g 10 min için hücre artıkları ve süpernatant ile 90 µL siyah 96-şey kalıplara transfer. EGFP ve mCherry floresan Floresans modülü ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak ölçmek.
    Not: EGFP için uygun uyarma ve emisyon filtreleri kullanın (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) ve mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). Ölçüm EGFP değerleri genellikle vahşi tipli EGFP elde edilir bir maksimum değeri arasındaki sahte transfected hücrelerden elde edilen en düşük değer aralığı span. Alet içinde belgili tanımlık doğru ölçüm pencere kurma ilgilen.
  7. NcAA birleşme verimliliğini örnek Floresans ve vahşi-tipi EGFP ifadeden elde edilen floresan arasındaki oran olarak hesaplanır. Tüm değerleri mCherry floresan için normalleştirilmiş.
    Equation 1

2. genetik birleşmesiyle ncAAs GPCRs içine fotoğraf-çapraz eşleme, Ligand-GPCR etkileşimleri (şekil 3)

  1. % 10 (v/v) FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2ile takıma DMEM hücrelerde HEK293T korumak.
  2. Tohum hücreleri transfection önceki gün.
    1. Hücreleri % 0.05 tripsin/PBS 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de 5 dakika ayır. 1 mL tripsin/EDTA 10 cm yemek için kullanın. Tam orta 10 birimleri ile gidermek ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Hemasitometre49kullanarak süspansiyon hücreleri saymak.
    2. 6-iyi tabak 2 mL tam büyüme ortamda kuyuda başına tohum 5.0 x 105 293T hücre. Taranması her bir pozisyon için 1 de başına ligand artı bir şey için bağlama denetimi33,38hazırlayın. Ekstra bir şey ile vahşi-tipi (wt) reseptör transfected mutant ifade düzeyini kontrol edin dahil edilebilir.
  3. Bir gün sonra izdiham (alan hücreler tarafından işgal) mikroskop altında kontrol. % ~ 70 izdiham PEI kullanarak hücreleri transfect.
    1. 1 saat önce transfection, Polat son konsantrasyonu 0.5 mm bütün wells için ekleyin.
      1. Polat 0,5 M stok çözeltisi hazırlamak. 6-şey plaka, başına 1.2 mg Azi bir tüp içine tartmak ve 15 µL 0,5 M çözülür NaOH. 1.2 mL tam orta hisse senedi çözümde sulandırmak ve her şey için 200 µL karışımı ekleyin.
        Not: Her deneme için Hazi taze stok çözeltisi hazırlamak. Azid yan temel pH, özellikle de sulu çözümler içinde kısa bir yarı ömrü vardır ve AziRS olduğu gibi aynı zamanda bozulmuş form içerir.
    2. 2 µg DNA iyi başına toplam miktarı transfect: plazmid taşıyan bir etiket kodon istenen konuma ve plazmid Polat (E2AziRS51 ve 4 konağımız kopyalarını adanmış ortogonal çifti için kodlama 1 µg bayrak öğesini GPCR için kodlama 1 µg bastırıcı-tRNA BstYam)33,38.
      Not: Ne zaman bir wt karşılaştırma ifade düzeylerini denetlemek için de dahil olmak üzere, plazmid DNA wt reseptör için daha düşük bir miktarda transfect. Bağlı olarak GPCR 0,2-0,5 µg plazmid wt reseptör verim benzer düzeyde mutant plazmid 1.0 µg kodlama. DNA bütün Wells eksik DNA sahte (örneğin boş bir vektör) ile dolduruyor, aynı miktarda transfect.
    3. 1.3.3-1.3.5 içinde açıklandığı gibi devam edin.
    4. 48 saat sonrası transfection, ya da fotoğraf-ligandlar polietilenin için adım 2.4 ile devam ya da adım 2,5 doğrudan ürün toplama ve çözümleme reseptör ifade doğrulamak için gidin.
  4. Fotoğraf-ligand polietilenin.
    1. 1000 x ligand hisse senedi çözüm hazırlamak. Peptid ligand konsantrasyonu 100 µM DMSO, geçiyoruz.
      Not: Ligand konsantrasyonu ayrışma sabiti KD ligand-GPCR etkileşimin bağlıdır. Bir son 100 x KD tavsiye bölgedir. Peptid ligand bir tuz trifluoroacetic asit (TFA) ise, TFA ağırlığını molekül ağırlığı hesaplarken dikkate (1 x TFA başına peptid temel amino asit). Ayrıca, peptidler higroskopik genel olarak düşünün. Peptid tozu tekrar tekrar donma önlemek ve oda sıcaklığında ulaştı kadar bir peptid kapsayıcı açmayın.
    2. Ligand hisse senedi çözüm 1:1,000 % 0,1 BSA, % 0,01 oluşan bağlama arabellekte seyreltik Triton-X 100, 5 12,5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) içeren mM MgCl2 HEPES ayrılma arabelleği (HDB)-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl ve 5 mM KCl. hazırlama Hazi-GPCR mutant başına 1 mL. Hücre orta 1 mL ligand çözeltisi ile değiştirin. 10 dakika dik, kuluçkaya
      Not: Ligand kinetik ve reseptör içselleştirilmesi için muhasebe belirli GPCR kuluçka süresi ayarlayın. Kuluçka süresi uzatan crosslinking verimleri artırmak değil.
    3. Örnekleri için bir UV crosslinker 365, içinde 20 dk ışınlatayım nm 5 x 8 W ile tüpler ve ~ 5 cm mesafe hücrelere. Pipetting tarafından hücreleri ayırmak ve 1,5 mL tepki tüp içine aktarabilirsiniz. Vasıl 800 x g 3 dk için hücreleri cips ve süpernatant atın.
    4. Proteaz inhibitörü (PI) 1 50 x hisse senedi çözüm yapmak mL 25 mM EDTA/H2O kokteyl bir tablet geçiyoruz. Aliquot PI çözüm stok ve -20 ° C'de saklayın 50 x hisse senedi 1:25 de HDB sulandırmak ve hücre topakları 2 50 µL içinde resuspend x PI HDB içinde. Flaş-sıvı N2hücrelerinde kıpırdama.
      Not: Göz koruma gözlük takıyorum. Bu noktada, örnekleri-80 ° C'de en fazla bir ay için saklanır. Adım 2.6 ile devam edin.
  5. Doğrudan hücre hasat.
    1. Orta Aspire edin. 0.5 mm EDTA 800 µL HDB içinde ekleyin. 10 dk RT veya buz üzerinde kuluçkaya.
    2. Hücreleri yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak ve 1,5 mL tepki tüp içine aktarabilirsiniz. 5 mM MgCl2 200 µL HDB içinde ekleyin. Vasıl 800 x g 3 dk için hücreleri cips ve süpernatant atın.
    3. Hücre topakları 2 50 µL içinde resuspend x PI HDB ve sıvı N2flaş donma. Göz koruma gözlük takıyorum.
      Not: Bu noktada, örnekleri-80 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
  6. Hücre lizis.
    1. 30-45 s ve girdap için 37 ° C'de bir su banyosu hücrelerde kısaca çözülme. Örnekleri şu andan itibaren soğuk tutmak. Pelet membranlar 2500 x g ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle, toplu sitozolik protein içeren süpernatant, atın.
    2. Granül 50 µL HEPES lizis arabelleği 50 mM HEPES-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, % 10 gliserol, %1 Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT ve taze ekledi 2 x PI kokteyl içeren resuspend. İyice karıştırın. Buz ve girdap her 5 dk 30 dk hücreleri parçalayıcı.
    3. Spin aşağı 10 dk az 14.000 x g ve 4 ° c için hücre artıkları Hemen süpernatant temiz tepki tüp aktarın.
      Not: Analizi ile hemen devam edin. Lysates-20 ° C'de depolanabilir, ancak, her donma-çözülme döngüsü sonuçları kalitesini bozar.
  7. Western blot analizi.
    1. Örnek hazırlamak, 3-5 µL lysate almak ve ilâ doldurmak 7 H2o 2 eklemek µL 1 M DTT ile µL ve 63 mM Tris-HCl pH 6.8, % 2 SDS, % 10 gliserol ve %0,04 bromphenol içeren 3 µL 4 x örnek arabellek mavi. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
    2. GPCR glikozile ve zayıf veya lekeli bantları ne zaman bir sorun, deglycosylate örnekleri PNGase sinyal yoğunluğu artırmak ve bantları keskinleştirmek için F ile vardır. 3-5 µL lysate ve deglycosylate toplam hacmi 10 µL tedarikçinin protokol sonrası içinde kullanın. Örnek arabellek x 3 µL 4 ekleyin.
      Not: Membran proteinlerinin SDS-sayfa analizi de çözüm kalitesini azaltır glikozile birden fazla siteleri ve Birleşik, çoğu kez. Her nasıl, değil deglycosylate örnekleri tam olarak glikozile hücre yüzeyinde olgun reseptör bölümünü değerlendirmek ilgili olduğu için anti-bayrak antikorları kullanarak Hazi-GPCR mutantlar ifade düzeyini analiz için yapmak.
    3. Örnekleri Standart SDS-sayfası üzerinden gidermek ve PVDF membran transfer protein leke.
      Uyarı: Akrilamid sinir hücrelerini tahrip eder. Eldiven ve göz koruma giymek.
    4. RT, 1 h veya gecede %5 yağsız süt TBS-T içeren 20 mM Tris-HCl pH 7.4, içinde 4 ° C'de membran engellemek 0.15 M NaCl ve % 0.1 ara 20.
    5. HRP-Birleşik ikincil antikor tarafından takip bir anti-ligand antikor ile membran sonda. Arada TBS-T. ile yıkayın Polat-GPCR ifade düzeyini tespit için membran ile ticari HRP antikor araştırması ( Tablo malzemelerigörmek).
    6. Ev yapımı ECL reaktif kullanarak gelişmiş Kemiluminesan (ECL) reaksiyonu gerçekleştirmek ve karanlıkta 5 min için sinyalleri algılayabilir.

3. ultrafast Bioorthogonal GPCRs canlı memeli hücrelerde etiketlerine göre

Not: Protokol 4-şey odacıklı coverslips için optimize edilmiştir (iyi alan 2,2 cm2=). Farklı iyi boyutları için protokol buna göre ölçekli olmalıdır.

  1. Yüzey kaplama mikroskop slayt. Steril bir başlık altında tüm prosedürü yerine getirir.
    1. Poli-D-lizin hydrobromide hazırlamak (MW = 500-550 kDa) (PDL) hisse senedi çözüm konsantrasyonu 1 mg/mL 50 mM Bor arabelleği (pH 8,5). 4 ° C'de 6 aya kadar saklayın. Dondurma değil.
    2. PDL hisse senedi çözüm 1:40 25 µg/mL (çalışma çözüm) son bir konsantrasyon için steril ultra-saf suda sulandırmak, sonra çözüm 0,22 µm steril filtre ile filtre.
      Not: Çalışma çözüm 4 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir.
    3. Tam olarak kuyunun her mikroskobu slaydın 500 µL PDL çalışma çözüm ile kapak. RT, 20 dk için kuluçkaya ve PDL çalışma çözüm Aspire edin.
      Not: PDL çalışma çözüm en fazla üç kez kullanılabilir. Çözüm yeniden alması gerekiyorsa, kullanılan çözüm için taze bir steril tüp kaplamalı slaytlardan aktarmak ve buna göre tüp etiket. Asla taze çözüm ile geri dönüşümlü çözüm karışımı.
    4. Her şey 3 x ile durulayın ~ 700 µl steril ultra saf su ve izin en az 1 h için kuru.
      Not: Artıkları PDL çözüm hücrelere zehirli olduğu gibi doğru bir şekilde kuyuları durulama çok önemlidir. Hemen mikroskopi için kullanılan veya bir hafta 4 ° C'de depolanan kaplamalı slaytlar
  2. % 10 (v/v) FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2ile takıma DMEM hücrelerde HEK293T korumak.
  3. Tohum hücreleri transfection önceki gün.
    1. Hücreleri % 0.05 tripsin/PBS 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de 5 dakika ayır. 1 mL tripsin/EDTA 10 cm yemek için kullanın. Tam orta 10 birimleri ile gidermek ve hücreleri pipetting tarafından resuspend. Hemasitometre49kullanarak süspansiyon hücreleri saymak.
    2. İyi başına tohum 1.0 x 105 HEK293T hücreleri (alan 2.2 cm²) 600 µL boya ücretsiz tam DMEM.
      Not: Görüntüleme amaçları için başlangıçta herhangi bir boya içermeyen bir ortamda çalışmak çok uygun. Boya ücretsiz DMEM formülasyonları ticari olarak kullanılabilir.
  4. İzdiham (alan hücreler tarafından işgal) mikroskop altında kontrol etmek ve hücrelerin lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak ~ %70 izdiham, transfect.
    1. 1 saat önce transfection, toplam sahip olma maliyeti taze 100 mM stok çözeltisi hazırlamak * K 0.2 M NaOH ve % 15 (v/v) DMSO.
    2. Şey, toplam sahip olma maliyeti 3 µl mix * 1 M HEPES pH 7.4 12 µL K hisse senedi çözümle. Yavaşça çözüm için son bir TCO wells için ekleyin * K konsantrasyonu 0.5 mm.
    3. 500 ng DNA iyi başına toplam miktarı hazırlayın. Bir microcentrifuge tüpte 200 seyreltik pcDNA3.1_CRF1R ng-95TAG-EGFP, 200 MbPylRSAF/tRNA içinPyl ortogonal çifti kodlama plazmid ng (tRNA dört kasetM15) ve 100 pcDNA3.1_Arrestin3 ng Plazmid 50 µL orta (boya ücretsiz, serum-ücretsiz, antibiyotik ücretsiz).
      Not: Genel olarak, eş transfection Arrestin GPCR içselleştirilmesi gözlemlemek gerekli değildir. Ancak, ortak transfecting Arrestin3 CRF1R, içselleştirilmesi kadar birçok mutantlar içselleştirilmesi analiz ederken çok uygun olduğu hızlandırır.
    4. Transfection lipid-esaslı reaktif (1 µg DNA'ın başına 2.5 µL) 1,25 µL 50 µL orta (boya ücretsiz, serum-ücretsiz, antibiyotik ücretsiz) sulandırmak ve çözüm DNA karışıma ekleyin. Girdap hemen ve 5-10dk RT. Ekle DNA-lipid kompleksleri hücrelere, kuluçkaya.
      Not: Deneyim, hücre transfected göre lipid tabanlı transfection görünüyor daha fizyolojik PEI ile kullanarak hücre morfolojisi transfected. PEI daha yüksek transfection verim verir gibi lipid tabanlı transfection deneyler görüntüleme için hücreleri transfect için daha iyi bir seçimdir, ancak PEI gibi Western blot, aşağı akım uygulamalar için tercih edilmelidir.
  5. 24 saat sonrası transfection, etiket reseptör floresan boyalar ile.
    1. 0,5 mM boya-tetrazine hisse senedi ve bir çözüm DMSO 10 mg/mL ultra-saf H2' O. boya stok çözüm boyama DNA'ın hazırlamak
    2. 100 µL orta her kuyudan 1,5 mL tepki tüp içine aktarın. Boya-tetrazine hisse senedi çözüm 1.8 µL ve boya stok çözüm boyama DNA'ın 0.3 µL ekleyin. İyi başa boya içeren orta aktarmak ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
      Not: Tetrazine-turuncu-floresan boya 1,5 µM son bir konsantrasyonu vardır.
    3. Orta Aspire edin ve yavaşça iki kez PBS boya aşırı kaldırmak için hücrelerle durulayın. Tam boya ücretsiz büyüme orta ısıtılmış 600 µL 37 ° C'ye Ekle
  6. Floresans mikroskobu ve reseptör içselleştirilmesi.
    1. Küçük 63 x (veya benzer) etiketli reseptörleri görselleştirmek GFP için uygun filtreler kullanarak büyütme (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), portakal-floresan boya (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) ve DNA boya (λ boyama ABS: 350 nm; λem: 461 nm). Reseptör etkinleştirmeden önce her filtre ile bir fotoğraf çekin.
    2. Reseptör içselleştirilmesi 200 kullanarak teşvik Ucn1 nM.
      1. 200 µM DMSO 1.000 x Ucn1 stok çözeltisi hazırlamak.
        Not: Peptid çözünürlük bağlı olarak saf su veya arabellek stokta hazırlamak mümkün olabilir.
      2. 100 µL orta bir kuyudan 1,5 mL tepki tüp içine aktarmak ve peptid agonist hisse senedi çözüm 0.6 µL ekleyin. Orta geri kuyunun içine aktarın.
      3. Mikroskop altında içselleştirilmesi gözlemlemek. İçselleştirilmesi (reseptör ve Arrestins overexpression bağlı olarak saat 10-15 dk) açıkça tespit bir hafta sonra fotoğraf çekmek daha önce bahsedilen filtreleri kullanarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Floresans tahlil anahat şekil 1' de tasvir edilir. Tahlil üç uygulamalarda istihdam edilmektedir. İlk etapta tRNA türevleri Lys(Boc) Pyl ortogonal çifti tarafından birleşme için bir dizi ekranlı. Lys(Boc) Pyl için sterically benzer bir amino asittir. Pyl ticari olarak mevcut olmadığı gibi Lys(Boc) standart bir substrat PylRS için yaygın olarak kullanılır. Filtrelenmiş tRNA tRNA üzerinde temel alanPyl. Her tRNA değişken tek üsleri veya baz-çifti döngüler ve rasyonel tRNA istikrar ve ökaryotik translasyonel makine ile uyumluluğu artırmak için tasarlanmış kaynaklanıyor mutasyonlar taşımaktadır. TRNA tasarımı ile ilgili tüm ayrıntıları bizim son iş30' u açıklanmıştır. Tipik sonuçları şekil 2Aaçıklanmıştır: farklı tRNA vermek farklı bastırma verimlilik, açıkça miktarında ölçülen Floresans yansıtılır. Biyolojik triplicates en küçük hata çubukları değerleri son derece tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. İkincisi, hangi fotoğraf-crosslinker p-azido-Phe (Polat) birleştirmek, E2AziRS26,51, iki gen çeşidini değerlendirilir. E2AziRS E. coli TyrRS türetilmiştir. Bir gen varyantı istihdam yerli E. coli kodon kullanımı, oysa ikinci kullanılmak üzere H. sapienskodon için optimize edilmiş. Floresans tahlil kodon optimize edilmiş versiyonu daha yüksek protein verimleri (şekil 2B) verdiğini gösterir. Son olarak, farklı amino asitlerin bioorthogonal tıklayın kimya birleşme oranı bulunmaktadır (şekil 2C) karşılaştırıldığında. Burada sunulan tüm ncAAs (BCNK, TCO * K ve SCOK) aynı ortogonal MbPylRSAF/tRNAPyl çift ile dahil edilmiştir. Lys(Z) da bu çifti tarafından kurulmuştur ve olumlu bir denetim olarak kullanıldı. Floresans tahlil güvenilirliğini göstermek için paralel ncAA birleşme deneyleri bir GPCR CRF1R yapıldı. Western blot analizi GPCR ifade (şekil 2B, C) tahmin etmek için yapılmıştır. EGFP ile floresan assay olarak gözlenen aynı eğilimleri ile CRF1R tespit edildi. Özellikle, Polat birleşme CRF1R içine son derece 1.5 2 kat çözünür protein (EGFP) göre Floresans tahlil için bile ılımlı bir iyileşme olabilir gösterilen yerli gene ile karşılaştırıldığında kodon optimize edilmiş E2AziRS gen kullanırken geliştirilmiş oldu bir daha zor zar proteinleri (şekil 2B) ifade düzeyini daha etkili. Her uygulama için kullanılacak tRNA kaset sayısı ile ilgili olarak genel not olarak tek bir tRNA kaset klonlama işlemleri kolaylaştırmak amacıyla farklı tRNA eleme önerilir. Farklı ncAARS veya aynı ortogonal çifti tarafından farklı ncAAs birleşme verimliliğini eleme zaman dört tandem kaset ncAA birleşme en yüksek verimi elde etmek için tercih edilen tRNA yinelenen denetim.

Polat birleşme insanlaşmış E2AziRS gene de dahil olmak üzere için optimize edilmiş sistem CRF1R bağlama cep harita ve 5 farklı ligandlar bağlama yollarını tanımlamak için kullanıldı: iki peptid agonistler Ucn1 ve örgüt ve üç peptid antagonistleri Ucn1(8-40), Cadmus devrimci Cephesi (9-41) ve dFXCRF(12-41) (şekil 3). Polat birleşme verimliliğini GPCR C-terminus33,34yaklaşırken azaltmak için daha önce gösterilen iken, en iyi duruma getirilmiş sistemimiz Polat birleşme için Hazi-etiket-siteleri mutantlarla düzeyde karşılaştırılabilir ifade sağlar farklı bölümlerini GPCR gen (şekil 4A). Hücre dışı döngü 2 (ECL2) testi ile taranması şekil 4B sonuçlarında göster ve helix CRF1R V-ligand taşıması cep temsilcisi bir parçası olarak. Çapraz ürün doğru boyutta bir grup ligand-reseptör kompleksi içinde ligand yakınlığı pozisyon yatıyor, yani bağlama cep parçasıdır ortaya koymaktadır. Birden çok crosslinking sayısı ile tüm ligandlar test, peptid agonistleri ve antagonistleri için farklı bağlama kalıpları ortaya bulundu. Özellikle, desen itibaren crosslinking bulunmuş reseptör yapısal unsurları hakkında bilgi sağlar. (F260-R263 antagonistleri ile birlikte pozisyonlar) ECL2 içinde gözlenen olarak birbirini izleyen isabet sayısını bir esnek döngü bölge önerir. Helix V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) ipuçları bir sarmal yapısını doğru olarak her 3-4 artıkları bulundu sayısı bir model. Ekranın GPCR tüm ilgili etki için genişletilebilir. 3D yapısı veya reseptör moleküler bir modeli varsa, ligand ayak izleri her ligand (şekil 5) crosslinking sayısı vurgulayarak görselleştirildiği.

Floresan ve Western blot veri (şekil 2C) önermek bu TCO * K ncAA en yüksek verimlilikle MbPylRSAFtarafından dahil bioorthogonal kimya olduğunu. Farklı PylRS mutantlar diğer tıklama ncAAs17daha yüksek birleşme verimleri verebilir, ama onlar bu çalışmada test değil. TCO * K bir CRF1R-EGFP füzyon protein dahil oldu ve SPIEDAC kimya (şekil 6A) yolu ile küçük parlak fluorophore reseptör (şekil 6B) yükleme etkin. Özel etiketleme bir kanıtı olarak etiket Floresans sadece reseptör ( şekil 6B' yeşil hücreleri) ifade hücrelerdeki görünür olması gereken ve karanlık hücrelerde değil, böylece her denemede bir iç negatif kontrol sağlayan. Ultrafast SPIEDAC kimya kullanarak etiketli reseptörleri hala fonksiyonel. Bir peptid agonist ekledikten sonra floresan bölmeleri GPCR içselleştirilmesi (şekil 6C) fizyolojik sürecinin ortaya sitozol gözlendi. Her zaman, seçici biorthogonal GPCR etiketleme teyit floresan boyalar ile birlikte lokalize erimiş EGFP sinyalleri.

Figure 1
Resim 1: stop kodonu bastırma verimliliğini değerlendirmek için tahlil Floresans tabanlı. NcAA huzurunda iki Plasmid'ler ile birlikte transfected HEK293 hücrelerdir. Bir plazmid bastırıcı-tRNA ve istenen ncAARS için kodlar. İkinci plazmid ile birlikte bir mCherry kontrol izin veren bir sitede bir etiket kodonu taşıyan EGFP gen için kodlar. İki gün sonra transfection, tüm hücreli lysates yeşil ve kırmızı Floresans bir plaka okuyucu olarak ölçülür. MCherry (kırmızı) normalleştirme için bağımsız bir başvuru sağlarken EGFP N-kodonu (gri) değil segmenti akıntıya karşı Floresan, tam uzunlukta EGFP (yeşil) verimini doğrudan ncAA birleşme, verimlilik için karşılıklı olarak ilişkilendirir. Ortogonal sistemin verimliliği stop kodonu bastırma yolu ile elde edilen EGFP miktarı ve vahşi-türü EGFP tarafından düzenli çeviri (amber bastırma) elde edilen miktarı arasındaki oran tarafından verilir. Şekil Serfling değiştirilir R. & para, ben; Memeli hücrelerinde, Enzimologiya, yöntemleri 2016, proteinlerin içine doğal olmayan Amino asitlerin birleşme 580, 89-107. 29 üreme telif hakkı izni Merkezi Elsevier tarafından izin verildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Floresan testin temsilcisi uygulamaları. (A) tRNA elemePyl türevleri30. HEK293 hücreleri muhabir Plazmid ve plazmidlerin MbPylRS/tRNA çifti için kodlama ile birlikte transfected (tRNA kopyalayın). Çubuklar için vahşi tipli EGFP göre Lys(Boc) birleşmesiyle elde edilen EGFP göreli Floresans gösterir. (B) kodon-kullanım ncAARS genler için etkisinin değerlendirilmesi. (sol kapı aynası) Floresans tahlil hücre E2AziRS iki farklı gen çeşidini transfected. (1) E. coli ve (2) insanlaşmış gen kodon kullanım. (doğru kapı aynası) CRF1R95AziWestern blot analizi-bayrak. Tam uzunlukta reseptör bir anti-bayrak antikor tarafından algılanır. Aktin β denetim yükleniyor olarak kullanıldı. (C) bioorthogonal Kimya için tasarlanmış üç ncAAs birleşme verimliliğini değerlendirmek. (sol kapı aynası) Bu deneyde kullanılan ncAAs yapıları. (1) olumlu denetim, (2) BCNK, (3) toplam sahip olma maliyeti olarak kullanılan LysZ, * K ve (4) SCOK. (merkezi paneli) Floresans tahlil HEK293 hücre transfected MbPylRSAF ve tRNA15 (a) dört kopyasını birleştirmek için kodlama bir plazmid ile (1), (2), (3) ve (4). (doğru kapı aynası) Western blot analizi dört ncAAs biri konumunda 95 taşıyan bir CRF1R-bayrak mutant. Aktin β denetim yükleniyor olarak kullanıldı. Panel A Serfling, R. ve ark. Tasarımcısı tRNA kanonik olmayan amino asitler memeli hücreleri nükleik asitler fotoğraf çözünürlüğü 46 (1), pyrrolysine sistemi tarafından verimli birleşme için 1-10 (2018) adapte ve Creative Commons göre çoğaltılamaz Attribution lisansı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Polat-aracılı fotoğraf-çapraz eşleme şematik gösterimi. Bir fotoğraf alınabilen azido işlev (sarı yıldız) reseptör (gri) içinde tanımlanmış bir pozisyon içine yerleştirilir. Azido grup ilişkili ligand (kırmızı) proksimal bulunuyorsa, kovalent çapraz ürün UV ışınlama kurulan (sarı daire gösterir çapraz site). Azido grup birleşme reseptör farklı pozisyonlara bağlama cep temsil eden ligand (mor) bağlama yüzey ortaya koymaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Polat CRF1R bağlama cep, fotoğraf-crosslinking eşleştirilmesine boyunca birleşme. (A) Polat-CRF1R-bayrak mutant vahşi tipi reseptör doğru ifade düzeylerinin karşılaştırılması. Polat birleşme siteleri bütün reseptör üst satırda belirtildiği şekilde dağıtılır. Bütün hücreli lysates Anti-bayrak Batı lekesi gösterilir. Aktin β denetim yükleniyor olarak kullanıldı. (B) Batı lekesi ya da anti-örgüt ile probed veya anti-Ucn1 antikorlar gösterilir. Polat tarafından yerine artıkları üst satırda gösterilir. Hücreleri sağ tarafta listelenen ligandlar ile inkübe UV ışınlama 365 nm ve lizis izledi. Örnekleri üzerinde % 10 çözüldü SDS-sayfa, PNGase F kullanarak ve Western Blot tarafından analiz deglycosylated. Deglycosylated ligand-CRF1R kompleksi ~ 40 kDa33belirgin bir MW çalışır. Çapraz ligand algılanan (MW ~ 3-4 kDa) değil. Bu rakam her iki panelleri Seidel, G-protein-birleştiğinde bir sınıf B reseptör canlı insan hücrelerinde peptid hormonlar tarafından aktivasyonu içgörü L. vd. yapısal değiştirilmiş. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 ve are göre Creative Commons Attribution license çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Ayak izleri peptid agonistleri ve antagonistleri sınıf B GPCR CRF1R. CRF1R transmembran etki alanı yüzey gösterimi. CRF1R pozisyonları bu çapraz Polat tarafından yerine zaman ligand olan vurgulanır. Ayak izleri CRF ve Ucn1 peptid agonistler magenta, ayak izleri antagonistleri CRF (9-41) ve Ucn1(8-40) mavi vurgulanır. Ayak izi antagonisti dFXCRF(12-41) turuncu renkte vurgulanır. Yedi transmembran sarmal ı-VII tarafından Roma numaraları gösterilir. (a, B) Bağlama cep membran uçaktan görünümleri. (C) hücre dışı yan bağlama cebinden görünüme Top. Seidel, G-protein-birleştiğinde bir sınıf B reseptör canlı insan hücrelerinde peptid hormonlar tarafından aktivasyonu içgörü L. vd. yapısal dan yeniden basıldı. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 ve are göre Creative Commons Attribution license çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : SPIEDAC CRF1R canlı hücrelerde etiketlerine göre. (A) reaksiyon şeması zorlanma terfi ters elektron-talep Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC): Toplam sahip olma maliyeti ncAA trans-cyclo-2-octene grup * K tepki tetrazine grup ile bağlantılı fluorophore Cy3. (B, C) HEK293T hücre CRF1R ifade95TCO * K- EGFP. Yeşil, kırmızı ve mavi kanal temsilcisi görüntüler. Ölçek çubuğunun boyutunu 10 µm. (B) olan hücreleri ile tetrazine-Cy3 (1,5 µM) 5 min için tedavi. Sadece reseptör (yeşil) ifade hücreleri maddelerinin etiketlenmesi oluşumu (kırmızı) gösterir. (C) hücreleri 200 ile tedavi edildi nM Ucn1 ve sonra 15 dk. hücre içi veziküller içselleştirilmiş reseptör karşılık görüntüsü. Panelleri B ve C Serfling, R. ve ark. Tasarımcısı tRNA kanonik olmayan amino asitler memeli hücreleri Nükleik asit fotoğraf çözünürlüğü pyrrolysine sistemi tarafından verimli birleşme için üzerinden değiştirilir 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) ve are göre Creative Commons Attribution license çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol ncAAs birleşme memeli hücrelerinde proteinlerin içine dik çiftleri verimliliğini değerlendirmek için basit ve güvenilir bir tahlil açıklar. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan deneyleri FACS üzerinde dayalı açısından büyük avantajı bu eşzamanlı hazırlanması ve örnekleri daha büyük sayıda ölçüm sağlar ve kolayca sıradan bir yazılım kullanılarak analiz veri sağlar olduğunu. Dik memeli hücreleri çiftinde analiz etmek için bir orta-den geçerek yöntem kullanılabilirliği mevcutların geliştirilmesi ve yeni ortogonal çiftleri gelişimi için çok önemlidir. Gerçekten de, büyük rasgele kütüphaneler ve ölü/canlı seçim yolu ile belgili tanımlık üretme ortogonal çiftlerinin yönlendirilmiş evrim memeli sistemlerinde gerçekleştirmek mümkün değildir. Tahlil nispeten kısa bir süre içinde makul bir deneysel çaba yatırım yaparak tarama küçük ölçekli kütüphaneler (üye yüzlerce) sağlar. Rasyonel tRNA kümelerini bu tahlil üzerinden tarama tarafından biz önemli ölçüde pyrrolysine sistem30verimliliğini artırmak roman tRNA yaratacaktır. Klasik EGFP/mCherry nereye EGFP muhabir birleşme verimlilik ve iç denetim olarak mCherry olarak hizmet veren floresan eşleştirmeyi için birlikte kullanılır. EGFP gazeteci ve mCherry denetim aynı plazmid harbored ama iki bağımsız Organizatör taşıyan iki ayrı ifade kaset içinde gömülü. Bu şekilde, mCherry ifade transfection verim ve hücre sayısı ilgilidir ama böylece ölçülen yeşil Floresans kırmızı Floresans normalleştirilmiş EGFP ifadesi, bağımsızdır. Bu tam olarak diğer gazeteciler bir tandem EGFP-etiket-mCherry iRFP-GFP ve7 Y39TAG (ile iRFP kızılötesi floresan protein ifade eden)52gibi iki proteinlerin olarak inşa edilmiş durumda. Bu tür yapıları her iki aynı mRNA transkript proteinlerdir. Ökaryotlarda mRNA'ların erken kodon taşıyan tarafından saçma-aracılı çürüme (NMD) mekanizması53gözetim ve yıkımı tabi. Bu nedenle, hem muhabir ve Denetim dizisi aynı anda bozulmuş ve iki gen ifade kesinlikle bağımsız değil. Benzer deneyleri luciferase muhabir Floresans muhabir yerine dayalı olmuştur başkaları tarafından54,55tanımladı. Enzimatik ışıldama Floresans ölçümler daha yüksek duyarlılık sunarken, ikinci yüksek tekrarlanabilirlik farklı hücre toplu işlemleri arasında gösterdi.

Memeli hücrelerinde ncAA birleşme için sağlam sistemler kesinlikle zar proteinleri ve düşük bol protein gibi protein hedefler talep ile çalışırken ihtiyaç vardır. Burada fotoğraf alınabilen ncAA sağlam birleşme için en iyi duruma getirilmiş bir dik çift göstermiştir Polat GPCRs içine. Sistemi tüm GPCR yüzeylerin sistematik fotoğraf-çapraz eşleme ve ligand bağlayıcı siteleri tanımlaması için izin veren bütün reseptör boyunca homojen Polat birleşme oranları verir. Yöntemin gücü iki önemli noktaları farklı ligandlar aynı reseptör paralel olarak analiz edilebilir ve verileri vitro yaklaşımlardan elde ettiği bilgileri tamamlar canlı hücre reseptör türetilmiştir vardır. Yöntem prensipte herhangi bir protein hedef için geçerli olduğunu ve aynı zamanda protein-protein etkileşimlerinin topolojileri eşlemek uygundur. Ayrıca, çapraz pozisyonlar tanımlanan alt kümesini daha da toplu iğne-proksimal amino asit cins çiftleri içinde ilişkili karmaşık33,38nokta için 2D crosslinking ile analiz edilebilir. Bu amino asit çiftleri silico deneyler için etkileşim33,38doğru moleküler modelleri oluşturmak için uygulanan mekansal kısıtlamalar sağlar. Metodik açısından bakıldığında, bu sadece olumlu sonuçlar itibaren crosslinking deneyler düşünülmesi gereken yatacak değer var. Değil crosslink mi bir pozisyon hala ligand üzerinden kritik yarıçapı içinde olabilir. Yanlış negatif crosslinker tarafından tanıtılan mutasyon yerel etkileşim engellemektedir ama crosslinking yan ya ligand uzak geldiğinde veya çözücü tarafından giderdikten veya intramolecular crosslinking uğrar da gerçekleşebilir oluşabilir. Bir çok önemli yöntemi crosslinking oluşumu tespit etmek parçasıdır. İlk etapta, tüm hücreli lysates için reseptör kovalent bağlı değil herhangi bir ligand ayırmak için SDS-sayfanın çözümlenir. İkinci olarak, kovalent ligand-reseptör kompleksi bir anti-ligand antikor kullanarak Western Blot yolu ile algılanır. Peptid ligandlar için yüksek afinite poliklonal antikorlar karşı ligand kaldırdı en iyi seçimdir. Etiketi için anti-bayrak antikor uygun bir spacer aracılığıyla erişilebilir hale gelinceye sağlanan alternatif olarak, izin veren bir pozisyonda, bir bayrak etiketle peptid ligandlar donatılabilir. Sonuçları endojen biotinylated proteinler tarafından arka plan nedeniyle yorumlamak zor olabilir, ancak biotin Etiketler de kullanılabilir. Etiket etiketleme de mümkün56,57olabilir küçük molekül ligandlar genellikle radiolabeled. Polat birleşme GPCRs içine protokollerde olmuştur aynı zamanda başkaları tarafından57,58,59yayınlandı. Ancak, biz insanlaşmış bir gen ile ilgili olmayan kodon-optimize daha iyi sonuç verir E2AziRS de dahil olmak üzere bir basit iki-plazmid sistem kullanın, ancak bu protokoller Polat birleşme, üç plazmid kullanımına içerir bir (şekil 2B).

Modern mikroskobu teknikleri high-end uygulamalar için uygun değildir klasik EGFP gibi çok parlak ve verimli fluorophores genetik olarak kodlanmış protein fluorophores faiz, protein yükleme gerektirir. Bu nedenle, popüler ek60 ve diğerleri arasında Halo61 Etiketler gelişmesine yol açmıştır organik fluorophores proteinler, üzerine yükleme yöntemleri sürekli bir arama yoktur. Ancak, böyle Etiketler hala hedef proteinin işlev huzursuz ve fluorophore tam konumunu hakkında büyük bir belirsizlik bırakın birkaç kDa bir boyutu var. Birkaç amino asitler en az boyutu ile tetracysteine motifi floresein veya resorufin arsenical bileşikler (FlAsH, ReAsH)62,63kullanarak daha hassas etiketleme için daha küçük bir alternatif temsil eder. Her ne kadar bu yaklaşım çok başarıyla GPCR çalışmalar64,65,66için de uygulandı, thiols adımlarla geniş yıkama gerektirir, bu kez yüksek arka plandan uğrar ve her durumda, izin vermez etiket tek kalıntı çözünürlük ile konumlandırma. Bunun yerine, bioorthogonal çapa ile donatılmış ncAAs böylece yerel biçimi ve hedef protein işlevselliği ile müdahale riski en bir tek amino asit pozisyonda floresan etiketleri yükleme imkanı sunuyoruz. Son nesil ncAAs bioorthogonal kimya, hangi tarihlerde TCO * K13 burada, istihdam protein doğrudan canlı hücreleri17,43tarihinde etiketleme etkin. Uygun hücre geçirgen boyalar mevcut17,67,68olması koşuluyla protein hedef hücre yüzeyine, aynı zamanda hücre içi hedefleri için geçerli yöntemdir. SPIEDAC kimya büyüklükte birkaç emir zorlanma terfi azido-ALKİN cycloaddition (SPAAC) açısından daha hızlıdır ve Staudinger Bertozzi d azid üzerinde bağlar2,13. Aslında, çeşitli protokoller için genetik olarak etiketleme GPCR Polat dahil ama onlar sadece izole GPCRs vitro37,59,69' a tabidir yayınlanmış. Bunun yerine, biz göstermiştir burada bioorthogonal canlı hücre üzerinde fonksiyonel GPCRs etiketlerine göre pürüzsüz. Bizim iletişim kuralı aynı kimya43,48,70kullanarak varolan iletişim kuralları için benzer, ancak en iyi duruma getirilmiş ncAA birleşme sistemimiz GPCR çalışmaları için yönteminin kapsamını genişletir. Deneysel işlemin kritik bir adımda toplam sahip olma maliyeti ile değiştirilebilmesi için pozisyon seçimdir * K, reseptör içinde tüm pozisyonlar olarak, bir değişiklik için izin veren veya floresan boyalar için erişilebilir. Bu nedenle, çeşitli kademelerde en uygun olanı bulmak için bir ön ekran test edilmelidir.

Sonuç olarak, bu çalışma ncAAs, GPCRs gibi zorlu protein hedeflerini uygulamaya dahil olmak üzere genel uygulanması için araçlar sunar. Biz fotoğraf-çapraz eşleme ve etiketleme, günümüzde ncAAs ana uygulamalar GPCR çalışmaları, bioorthogonal birçok gelecekteki uygulamalar her iki topolojileri ligandlar veya diğer proteinler ile GPCR etkileşimlerin açıklayacak ve GPCR çalışmaya bulacaksınız tahmin canlı hücre yapısal dinamiği.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çakışma olmadığını bildirmek için var.

Acknowledgments

Bu eser tarafından Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibe CO822/2-1 (Emmy Noether programı) ve CO822/3-1 için araç ten altında kurulan

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

Kimya sayı: 134 Sigara-kurallı amino asit (ncAA) kehribar stop kodonu bastırma birleşme verimliliği ortogonal amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri fotoğraf-çapraz eşleme protein bağlayıcı arabirimleri bioorthogonal kimya Floresans mikroskobu
Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Serfling, R., Seidel, L.,… More

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter