Summary
该方法展示了如何用三维 (3D) 模型来可视化病原体侵入昆虫细胞。包囊从果蝇幼虫感染病毒或细菌病原体, 无论是体内或体内。感染的包囊然后固定和染色的成像与共聚焦显微镜和随后的3D 细胞重建。
Abstract
在果蝇的致病性感染中,包囊在整个感染的免疫应答中起着重要作用。因此, 本议定书的目的是开发一种方法, 以可视化病原体入侵在特定的免疫室的苍蝇, 即包囊。使用此处提供的方法, 可从 200果蝇3rd龄幼虫到30分钟 (前体感染) 中获得多达 3 x 106实时包囊。或者, 通过注射 3rd龄幼虫, 然后全血细胞提取多达24小时后感染, 包囊可以感染体内。这些受感染的主要细胞是固定的, 染色, 并使用共聚焦显微镜成像。然后, 从图像中生成3D 表示, 最终显示病原体侵袭。此外, 还可以获得高质量的 qRT PCR RNA, 用于检测感染后的病原 mRNA, 并从这些细胞中提取足够的蛋白质进行印迹分析。结合, 我们提出了一个确定的方法, 对病原体入侵和证实感染的细菌和病毒病原体类型和有效的全血细胞提取方法获得足够的活包囊从果蝇用于前体和体内感染实验的幼虫。
Introduction
果蝇是一种成熟的模型有机体, 用于研究先天免疫的1。在先天免疫反应中, 包囊在对病原体的挑战中起着重要的作用。包囊是关键的封装寄生虫, 以及有一个重要的功能, 通过吞噬行动在真菌, 病毒和细菌感染的病原体2,3。
为了更好地了解宿主对致病性微生物感染的先天免疫反应, 重要的是要想象病原体是如何侵入宿主细胞感染的。这种可视化有助于理解入侵的机制。这些数据连同病原体细胞内定位和细胞反应的细节, 可以提供关于宿主对感染的反应和微生物相互作用的细胞器的线索。因此, 采用显微成像技术进行3D 模型重建, 有助于确定宿主细胞病原体的准确定位。在本研究中, 我们可视化了贝柯克斯柯克斯 (柯克斯) 的入侵, "Q 发热" 的致病剂, 这是一种对人类和动物健康构成严重威胁的人畜共患病病毒, 成为主要的果蝇包囊. 最近, 据证明,果蝇易受生物安全级别2九英里第二阶段 (NMII) 克隆4菌株的C. 柯克斯的影响, 该菌株能够在果蝇4中复制, 表明果蝇可作为模型有机体研究C. 柯克斯发病机制。
以前的研究已经使用包囊检查宿主的先天免疫反应。包囊已用于形态学观察5,6,7, 形态分析2,8, 吞噬功能分析2,3, qRT PCR2, 9, 免疫沉淀 10, 11, 免疫荧光分析 10, 12, 染色 13, 免疫印迹法3,10, 11和免疫组化9,14。尽管果蝇S2 细胞也可用于各种体外实验, 但永生和潜在的病毒感染可能会改变其行为15,16。使用主细胞, 而不是永生化细胞系, 如 S2 细胞, 允许研究先天免疫功能的系统更具代表性的整个有机体。此外, 在提取之前, 包囊体内的感染允许细胞与其他宿主蛋白和组织进行交互, 这比在前体感染之前提取包囊更有利。许多不同的方法被用来在短时间内获得足够数量的包囊, 以保持包囊活着的8,17,18,19。
在本研究中, 我们提出了一种从果蝇3rd龄幼虫中提取包囊的方法, 用于致病性微生物感染C. 柯克斯,李斯特菌增生(李斯特菌), 或无脊椎动物彩虹病毒 6 (IIV6)。我们描述了体内和前体全血细胞感染的方法。体内-和前体感染的包囊通过共焦显微镜进行可视化, 用于构建C 柯克斯入侵的3D 模型。此外, 使用提取协议, 体外感染的包囊被用于基因和蛋白质表达测定. 具体地说, 为了检查感染的程度与 IIV6 和李斯特菌, 总 RNA 或蛋白质被分离从细胞为 qRT PCR 或西方印迹分析。结合起来, 该协议提供了从3个rd龄幼虫中快速收集大量包囊的方法, 并证明主要包囊感染了体内或前体内, 是一种适合微生物的平台。病原体感染研究及适用的下游分析, 如显微术、转录组学和蛋白质组学。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.体内感染
- 介质和设备
- 在无菌条件下, 准备新鲜的果蝇全血细胞隔离培养基 (DHIM), 含有75% 施耐德的果蝇培养基, 25% 胎牛血清 (血清) 和过滤消毒。
- 层2-3 片10厘米 x 10 厘米的石蜡膜下显微镜。
- 准备玻璃毛细管。将毛细管拉拔加热器设置为最大值的55%。将毛细管拉到大约10µm 的尖点。
- 用矿物油回填毛细管。
- 将填充的毛细管装入 nanoinjector (图 1A), 并通过使用镊子断开尖端 (图 1B) 打开融合的毛细管尖端。尖端的外径应为100µm, 便于包囊的摄取。
- 从毛细管尖端排出尽可能多的油, 然后用 DHIM 填充。为方便地可视化的血淋巴和油的边界, 包括在油和 DHIM 之间的气泡 (图 1B)。
- 血淋巴提取
- 从食品瓶内壁中选取 3rd龄果蝇幼虫, 轻轻使用镊子, 将其放入100µm 过滤器 (图 1C)。3rd龄幼虫在成年雌性产卵后3-6 天内被发现。
注: 这些实验使用了基因型, w1118;p {w+ mC= Hml-GAL4. Δ} 2, P {w+ mC= 无人参与-2 xegfp} AH2, 因为包囊从这些动物表达增强的绿色荧光蛋白 (EGFP) 帮助在细胞的鉴定通过显微镜。 - 在幼虫上倒入5毫升的不育水, 并摇动过滤器5秒. 将滤网放到任务擦除上, 以删除多余的水 (图 1C)。
- 将幼虫转化为1.5 毫升离心管。将它们与 CO2气体一起麻醉5秒 (图 1D)。
- 将幼虫放在显微镜下的石蜡膜上, 背侧朝上 (图 2A)。
- 将玻璃毛细管轻轻地放到幼虫后体上, 以保持它到位, 并扰乱后角质层开放使用精细尖钳 (图 2B)。
- 允许血淋巴流到石蜡膜上 (图 2C)。
- 在石蜡膜上一次制作一个血淋巴池, 包括包囊20-50 幼虫。
- 使用 nanoinjector 上的玻璃毛细管 (图 2D) 进行池内血淋巴。
注: 血淋巴大约有10-20 µL。 - 将血淋巴喷射到含有500µL DHIM 的1.5 毫升离心管 (图 2E)。
- 重复步骤 1.2.4)-1.2.9) 为每一批幼虫。
- 从食品瓶内壁中选取 3rd龄果蝇幼虫, 轻轻使用镊子, 将其放入100µm 过滤器 (图 1C)。3rd龄幼虫在成年雌性产卵后3-6 天内被发现。
- 计算包囊的数目。
- 吸管5µL 0.4% 台盼蓝溶液在0.6 毫升离心管染色的死细胞。用吸管轻轻地将 DHIM 和包囊在1.5 毫升管中混合, 并将 DHIM 包括包囊的5µL 转移到0.6 毫升离心管中, 并轻轻混合。
- 吸管10µL 细胞从1:1 台盼蓝: 全血细胞混合物进入 hemocytometer。
- 计算在 hemocytomter 的4个角场中, 不沾有台盼蓝的活包囊数, 并用公式计算每毫升包囊的浓度:
其中 X 是每毫升活包囊的浓度;a、b、c 和 d 是 hemocytometer 中计算的每4个字段中的活细胞数 (由台盼蓝排除所确定)。分裂的细胞总数的2是由于1:1 稀释的细胞与台盼蓝。用台盼蓝染色的细胞被认为是死的。
-
前体感染
- 根据每个实验所需的 timepoints 和生物复制量确定要与细胞播种的井数。5.0×104包囊是理想的 RNA 和蛋白质纯化后感染。
- 使用以下公式计算感染 DHIM 所稀释的病原体存量:
感染多样性 (语言) 是每个细胞所需的病毒或细菌的数量。
注: 使用的语言取决于个别的实验和化验结果。这里, 使用了10个基因组等价 (GE)/ C. 柯克斯的细胞, 10 CFU/细胞的李斯特菌, 或 1 TCID50/IIV6 细胞。 - 通过将适当的 DHIM 体积添加到管中的病毒或细菌体积中, 为24井板的每一个井准备500µL 病原体培养基。
- 在24井板的井中放置一个12毫米圆盖玻璃 (不1厚度)。
- 将 DHIM 包括包囊到24井板的井中。
- 在井中添加500µL 病原体培养基包囊。
- 离心板在 1000 x g 5 分钟。
- 在28摄氏度孵育1小时的盘子。每15分钟, 轻轻地将盘子从后面倾斜, 然后从左向右5秒。
- 在 1 h 的入侵/附着步骤 1.4.8), 轻轻地吸走病菌培养基和洗涤包囊与新鲜的 DHIM, 并补充它与500µL 新鲜 DHIM。
- 在所需时间内孵化受感染的包囊。在这些实验中,柯克斯-或 IIV6-infected 包囊被孵化24小时, 而李斯特菌感染的包囊则孵化为1、2或4小时。
2.体内感染
- 感染
- 在室温下加热果蝇果汁琼脂板15分钟, 如前所述20。
- 添加30克琼脂到700毫升的水和高压釜40分钟。
- 将0.5 克甲基 paraben 在10毫升的绝对乙醇中溶解。
- 将甲基 paraben 溶液加入300毫升果汁浓缩液中。
- 快速将果汁浓缩成蒸压琼脂溶液, 并将5毫升放入 10 x 35 毫米培养皿中。
- 在板材冷却了15分钟之后, 将它们存储在4摄氏度。
- 在步骤1.2.1 后准备 3rd龄幼虫-1.2.3)。
- 将酵母糊放在琼脂盘上。在琼脂盘中进行细切口, 幼虫可以迁移以避免干燥 (图 3a)。用石蜡膜 (图 3B、C) 组装0.001 毫米尖钨针与持有钳。
- 吸管50µL 高效价 mCherry 表达-柯克斯(5.95×109 GE/mL) 到石蜡膜下的立体显微镜下, 并将幼虫放入细菌池中。
- 将幼虫放入细菌池中。用钨针刺出幼虫 (图 3D)。将幼虫转移到琼脂盘上 (图 3E)。
- 将剩余的病原体转移到琼脂板上, 用石蜡膜封住钢板。
- 将幼虫放在潮湿的空气中, 直到感染后所需的时间 (图 3F)。在这个实验中,柯克斯感染的幼虫在盘子上24小时。
- 在室温下加热果蝇果汁琼脂板15分钟, 如前所述20。
- 包囊的血淋巴提取与电镀
- 在步骤1.1 之后准备介质和设备。
- 在24井板的井中放置一个12毫米圆盖玻璃 (不1厚度)。吸管500µL DHIM 入井。
- 从受感染的幼虫中提取血淋巴 1.2.4)-1.2.8)。
- 将血淋巴喷射至井下步骤 2.2.2)。
- 重复 2.2.3) 和 2.2.4) 为多批次的幼虫。
- 离心板在 1000 x g 5 分钟。
3. 可视化
- 固定和染色
- 在允许包囊在井中的圆盖玻璃上定居后, 轻轻地从每个井中取出介质。
- 轻轻地添加200µL 4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 的每个井落户包囊。在室温下孵化包囊20分钟。
- 去除4% 的粉煤灰, 轻轻地添加200µL 的 PBS, 含有0.1% 的海卫 X-100 和1% 牛血清白蛋白 (BSA) 的每一个井。在室温下孵化包囊10分钟。
- 卸下 PBS 并轻轻地将 1× 4 '、6-diamidino-2 苯基吲哚 (DAPI) 的200µL 添加到每个井中。室温下在黑暗中孵化包囊10分钟。
- 移除 DAPI 解决方案, 并轻轻地将 PBS 添加到每个井中。在室温下孵化包囊5分钟。
- 在玻璃显微镜滑梯上滴下10µL 的 antifade 安装介质。
- 从每个井中取出 PBS 后, 用细尖钳将盖玻璃从24井板上取下。轻轻地将盖子玻璃放在玻璃滑梯上的 antifade 安装介质上, 包囊朝下。
- 让幻灯片干燥, 把它放在黑暗中过夜。
- 共焦成像
- 为 DAPI、EGFP 和 mCherry 的三色成像配置共焦显微镜。使用以下设置: DAPI 励磁 (前) 405 毫微米, 发射 (em) 415-480 毫微米;EGFP 前488毫微米, em 493-564 毫微米;mCherry 前587毫微米, em 597-700 毫微米。
- 将样品放在显微镜上, 用 63 x/1.4 数值孔径 (NA) 的目标聚焦在样品上。在图像的视野中找到所需的包囊。
- 调整激光功率和探测器增益, 以达到适当的样品曝光。检查多个 z 平面以确保曝光级别适合整个采样厚度。
- 在整个全血细胞的 z 轴上找到顶部和底部位置。将这些位置设置为 z 切片的起始和结束位置。
- 仅使用扫描缩放来图像包含全血细胞的区域。通常使用3X 的缩放系数。
- 在相应分辨率下收集图像系列, 如 x y 平面中的 1024 x 1024 像素, 以及 z 维度中的0.3 µm 间距。
- 3D 模型重建
注意: 开放源码软件存在, 执行下面描述的3D 模型重建的许多功能。- 将 z 切片图像系列文件导入与共焦显微镜相关的软件, 用于3D 模型重建。
- 选择一个单元格, 显示与 DAPI 和 mCherry 一起染色的细胞核, 表示全血细胞的 EGFP 中表达柯克斯。裁剪图像系列以仅包含单个单元格。
- 选择使用软件的预打包算法重新构造3D 模型的3D 查看器选项。在混合、曲面和混合选项之间选择所需的3D 表示形式。在此方法中, 使用曲面模型显示包囊、原子核和柯克斯。
- 通过按住鼠标按钮并在屏幕周围拖动光标, 观察来自不同观察位置的3D 重建细胞。调整模型光源的单元方向和位置, 优化图像。对于不透明度、最小和最大阈值、镜面、环境、Shineness 和伽玛, 存在用于优化图像的其他选项。
- 通过使用裁剪和切片命令对模型中的剖面进行横断面, 以可视化全血细胞的内部内容。
4. 基因和/或蛋白质分析的应用
- 继感染 IIV6 和李斯特菌后, 溶解细胞为随后的 qRT PCR 或西方印迹分析如前所述的21和以下制造商的指示。
注: 请参阅材料表, 用于 qRT PCR 的引物和用于西方印迹的抗体。 - 用琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物, 如前所述的22, 以确保放大产品的适当长度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
要收集前体感染的实时包囊, 可从 200果蝇3rd龄幼虫中提取多达 3×106包囊。为了发展我们的方法, 我们尝试了许多不同的技术。个体幼虫解剖可达1.5 小时, 使用此方法18获得平均8000个细胞, 其中大部分在采集结束时未存活。接下来, 我们试图提取血淋巴, 其中包含包囊, 从20幼虫一次使用玻璃毛细管管19, 但毛细管成为堵塞的角质层材料和血淋巴无法有效地占去玻璃毛 细 管。最后, 我们机械地扰乱了每批20-50 幼虫的角质层与细钳12, 并作出了一个池的血淋巴, 以便于摄取。这允许从大量的幼虫 (表 1) 中轻松收集大量的包囊。
为了表明提取的包囊是活的和适合的感染, 进行了台盼蓝排除试验, 以计算使用的方法提取活包囊的百分比 (图 6a)。此外, 我们比较了我们的全血细胞提取方法与以前发布的方法, 目的是开发一种机械中断方法, 以分离和区分循环和居民包囊从个别的果蝇幼虫23。从10独立实验隔离的两种方法进行比较后, 我们观察到, 使用此处介绍的方法 (图 6A), 细胞活力略有提高;但是, 从 Petraki et al的方法。从每10个被解剖的幼虫中产生近两倍的包囊 (图 6B)。从 Petraki et al中包囊数量增加的原因。方法是收集居民 (无梗) 包囊, 以及循环包囊。为了证实用这里所介绍的方法提取的细胞实际上是包囊的, 我们利用了一个包含转基因的飞线, hemolectin (Hml) 启动器驱动 GAL4 在循环包囊中, 将上游激活器序列 (无人驾驶) 绑定到激活增强的绿色荧光蛋白 (EGFP) 转录和表达在包囊。包囊从hml-GAL4 > 无人 EGFP幼虫提取到腔 coverglass 幻灯片, 固定, 透和染色 DAPI 如前所述的21。图 7显示大多数 DAPI 阳性细胞也 EGFP 阳性。从多个图像中对共表达式进行量化, 计算出分离细胞的86±9% 包囊。
新的3D 模式的病原体侵入果蝇包囊提取从 3rd龄幼虫以下前体或体内 C. 柯克斯感染。我们能够图像柯克斯感染, 因为细菌表达 mCherry。被感染的包囊被固定和染色后, 他们被成像 DAPI, EGFP, mCherry 使用共焦显微镜。全血细胞感染率, 由同时显示 mCherry 信号的 EGFP 阳性细胞的百分比确定, 对于体外 和体内 C . 柯克斯感染的比例是近100%。这是预期的, 因为 10 GE/细胞的语言用于前体感染, 这应导致100% 细胞感染24。关于体内感染, 由于幼虫被放置在一个高滴度的 mCherry 表达-柯克斯(5.95×109 GE/mL), 细菌数量大约比每只幼虫包囊的数量高出1万倍。因此,体内感染预期感染率为100%。
接下来, 通过全血细胞收集 Z 部分以可视化3D 中的整个单元格, 并确认单元格内部存在柯克斯。图 4显示了单元格内部的全血细胞 (绿色) 的透明剖面, 其中带有 C . 柯克斯 (红色)。图像也被重建成一个3D 模型 (图 5), 表示全血细胞和柯克斯的表面, 再次显示 C . 柯克斯在横断面包囊的内部。有趣的是,在体内感染的包囊表现出更大的细胞质扩展, 并且在本质上是平坦的, 而前体感染的包囊更球状 (图 5)。这可能表明在体内感染的人群中, lamellocytes 的数量更大, 在体内种群7中 plasmatocytes。虽然 lamellocyte 分化一般诱导在寄生黄蜂感染25, 伤的果蝇幼虫也足以诱发 lamellocyte 分化26。最后, 虽然没有在这里提出的实验中使用, 有 GFP 表达形式的李斯特菌27和 IIV628 , 可用于生成3D 模型的全血细胞感染。相反,李斯特菌-和 IIV6-infected 包囊被用于西方印迹和 qRT PCR 实验。
使用此处介绍的方法, 将在图像中同时执行前体和体内的感染。此外, 病原体 mRNA 和蛋白质分析跟随了体内感染。具体地说, 提取包囊感染 IIV6, 并应用于 qRT PCR 分析。它显示了明显较高的 IIV6-193R, 一种病毒基因, 编码为推定抑制剂的凋亡29, 之间的模拟和 IIV6-infected 细胞 (图 8a)。扩增产品的电泳证实了 IIV6-193R 基因产品在感染样本中的存在, 而不是模拟感染的样本 (图 8B)。在所有样品中均发现 RpII 内源性控制的扩增带, S2 细胞 IIV6 感染为阳性对照。由于 IIV6 感染是在 1 TCID50/细胞的教学语言中进行的, 因此大约50% 的细胞预计会被感染, 基于泊松分布24。
从模拟或李斯特菌-感染包囊的总蛋白收集 1, 2, 4 h 后感染和蛋白质浓度是由二辛可宁酸 (方法) 测定。由于教学语言为 10 CFU/细胞24, 预计100% 的细胞被感染前体。西方印迹证实了在感染的包囊中存在着李斯特菌衍生的蛋白质产品, 高浓度的 4 h 感染后 (图 9)。李斯特菌接种被用作检测李斯特菌特定波段的阳性对照。肌动蛋白的存在显示在全血细胞样品中, 以确认蛋白质的负载水平。结果表明, 采用本方法提取的包囊对病毒和细菌感染实验均适用。
图 1: 用于全血细胞提取的设备和材料概述。在解剖前先准备好设备。A ) 被拉的玻璃毛细管入入 nanoinjector 在被填装矿物油之后。B) 玻璃毛细管的融合尖端用镊子折断, 形成100µm 外径。B ') DHIM 被毛细管所占, 以避免细胞污染, 并引入气泡来明确区分油和 DHIM。C) 幼虫从食品瓶中采摘, 放入细胞过滤器中。C ') 幼虫在无菌水中洗涤, 水被清除, 任务擦拭, D) 幼虫转移到一个离心管和麻醉与 CO2气体。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 用于提取包囊的时间线和流程图.A) 幼虫在打开角质层之前放在背侧。B) 角质层被细尖钳和毛细管针打断。C) 血淋巴在石蜡膜上流血。D) 从20-50 幼虫的血淋巴池占去了玻璃毛细管和 nanoinjector。E) 血淋巴和包囊转移到含有500µL DHIM 的离心管中, 用 hemocytometer 计数。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:体内感染.A)果蝇果汁琼脂板和酵母膏用于培养体内感染幼虫。切割是在琼脂板块, 以促进幼虫长寿 (灰色箭头)。B) 用石蜡膜将0.001 毫米尖的钨针附着在镊子上。C) 尖的0.001 毫米尖钨针。D) 在立体显微镜下, 在石蜡膜的病原体池中用钨针刺入幼虫。E) 被刺的幼虫放在琼脂盘上。F) 该板材用石蜡膜密封, 在容器中保持湿润的纸巾, 直到适当的时间。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 病原体侵入包囊的剖面.从病原体感染包囊的3D 共聚焦扫描中提取的切片。A、B) xy 剖面显示了全血细胞内部的柯克斯 (红色标记为白色箭头)。灰色箭头显示包囊的细胞核。a "、a"、B ') 视图 (包括 yz 和 xz 剖面图像) 显示从2个额外的查看点入侵柯克斯到包囊中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 3D 病原体侵入包囊模型.在前体和体内感染后, 将生成柯克斯侵入包囊的3D 模型。模型可以自由旋转使用软件;这里6个观看点显示与全血细胞在绿色, C . 柯克斯在红色 (白色箭头) 和原子核在蓝色 (灰色箭头)。同时, 也显示出致病菌侵入细胞内部的横断面图像。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 活包囊的百分比和人口.包囊从 10 3rd龄幼虫组中提取, 采用 Petraki 等方法, 并提出了方法。A) 用台盼蓝排除法计算每种技术的活包囊的百分比。B) 两种技术比较包囊的总人口。条形图代表了每种提取方法和检测类型的 N = 10 生物复制的平均标准偏差。P 值从两尾学生的 T 检验中表示, 假设不相等的方差。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 使用 hemolectin 驱动程序提取包囊的图像.从 w1118的80幼虫中提取包囊;p {w [+ mc] = Hml-GAL4. Δ} 2, P {w [+ mC] = 无人接入-2 xegfp} AH2。Hml 的启动子驱动 GAL4 在循环包囊中, 它约束无人机激活 EGFP 转录和表达。包囊是固定的, 并沾上了 DAPI, 如前所述的20。包囊是安装在腔盖玻片和成像的差异干扰合同 (DIC) 和荧光显微镜。蓝色通道显示与 DAPI 染色的细胞核, 绿色通道显示包囊表达 EGFP。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: qRT PCR 和凝胶电泳.IIV6-193R 基因的表达仅在 IIV6-infected 包囊 qRT PCR 观察。A) 193R 基因表达被规范化为内部控制, RpII, 并呈现为比值。模拟感染的包囊的循环编号被任意设置为40的最大周期数, 以进行分析, 因为在这些样本中未检测到193R。数据代表了平均标准偏差从 N = 3 生物复制每组。P 值表示两尾学生的 T 检验假设不相等的方差。B) 琼脂糖凝胶电泳显示 qRT PCR 产物。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 西方污点分析.在模拟和李斯特菌感染的包囊中,李斯特菌抗原和肌动蛋白的表达由 3rd龄果蝇幼虫1、2和 4 h 后感染 (私家侦探) 决定, 由西方印迹。总蛋白浓度是由二辛可宁酸 (可测性) 测定, 以正常化的蛋白质总量在每条车道的凝胶。接种用于感染包囊被用作阳性对照样品。请单击此处查看此图的较大版本.
| 方法 | 幼虫平均数 全血细胞提取 |
平均总包囊数 |
| 血 毛细管萃取 (此方法) |
192.44 (SD: 86.05) | 4.56 x 105单元格 (SD: 5.83 x 105) |
| (范围:70-390, N = 25 试验) | (范围: 1.20 x 105 -2.95 x 106单元格) | |
| 个人 幼虫解剖 |
26.67 (SD: 11.55) | 8.33 x 103单元格 (SD: 6.66 x 103) |
| (范围:20-40, N = 10 试验) | (范围: 4.00 x 103 -1.60 x 104单元格) | |
| 幼虫 毛细管萃取 * |
N/个 * | N/个 * |
| * 由于毛细血管针堵塞, 包囊无法用此方法提取 | ||
表 1: 使用不同技术提取的解剖幼虫数和萃取包囊.本文与其他方法比较了解剖幼虫和提取包囊的平均数量。我们的方法导致了大量的幼虫和包囊的收集。还尝试了幼虫毛细管提取方法, 但由于毛细血管尖端堵塞, 包囊无法提取。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
为了更好地了解宿主细胞是如何感染的, 重要的是要澄清细胞中病原体的定位, 尤其是在试验以前未经测试的病原体和细胞类型组合4时。在对感染后细胞反应级联进行研究时, 可能表明有生产性致病菌侵袭, 而影像学和细胞反应数据的结合对于证明病原菌侵袭和感染是必不可少的。虽然有报告显示病原体侵入宿主细胞的2D 图像往往表明有生产性感染, 但仍有一些问题可能存在于宿主细胞最初病原体侵袭的时间。因此, 从2D 图像的 z 剖面扫描重建的3D 模型可以解决这些问题, 并指明宿主单元格 (图 4和5) 中的病原位置。然而, 使用初级包囊的限制是它们在细胞培养中的长寿。前一份报告指出, 全血细胞在细胞培养培养基中的存活率只有 8h18, 在我们的感染协议中, 我们能够执行多达24小时的检测, 但不会更长。因此, 无法观察高水平的柯克斯复制或形成 parasitophorous 液泡, 直到感染后2天才开始形成, 并且在感染后的4-6 天内没有显著的大到30.
在许多实验中, 端点化验利用蛋白质或 RNA 进行分析, 通常需要大量的细胞产生足够的材料进行审讯。例如, 在这里, 我们使用的端点分析, 如西方印迹和 qRT PCR, 以探讨从 3rd龄果蝇幼虫的初级包囊病原体感染的程度。因此, 这里提出的方法重点是快速幼虫解剖和收集的血淋巴含有足够的活包囊, 为前体致病菌感染。该方法介绍了用 nanoinjector 快速取血淋巴和包囊。将包囊放置在含有25% 血清的 DHIM 中, 对于全血细胞的生存非常重要。此外, 对于此处介绍的 "前体" 感染, 需要大量的包囊。为避免黑化31、32、33、解剖和全血细胞集合必须迅速发生.虽然全血细胞提取的其他方法存在18、19、23, 但这些方法的持续时间为前体感染收集了足够多的包囊, 但时间过长。100µm 细尖是有益的摄取血淋巴不采取其他器官可能导致堵塞的毛细血管针。使用 nanoinjector 也可能是自动化的, 当它连接到一个机器人阶段和脚蹬, 允许用户集中在快速解剖的果蝇幼虫和减少的时间, 包囊没有周围的幼虫组织或细胞培养培养基。然而, 使用吸管也可以占去血淋巴转移到 DHIM。另外, 我们的方法利用 CO2气体对麻醉幼虫在解剖之前;用石蜡膜覆盖的冷块是另一种可行的方法23。最后, 在血淋巴释放过程中, DHIM 中的幼虫解剖可以减少粘在石蜡膜上的包囊的数量, 但会增加毛细针吸收所需的时间。
在幼虫角质层的开启和解剖过程中,果蝇对伤害的共同免疫反应是黑化 31, 32, 33.在提取包囊的过程中, 我们会观察 DHIM 中包囊的黑化, 在提取后的10分钟。由于黑化是一个快速的过程, 这些细胞将被排除在病原体感染实验。此外, 抗混凝剂 phenylthiourea 可以添加到 DHIM, 以抑制酚氧化酶激活系统和黑化在伤害9。然而, 由于黑化和凋亡是果蝇先天免疫反应, 他们的水平可以量化后, 全血细胞提取和刺激使用这里描述的方法.
虽然回收大量的蛋白质或 RNA 材料是技术的要求, 如西方印迹和 qRT PCR, 新的技术, 如 RNAseq 需要更少的投入材料, 多达 10 pg 的高质量总 RNA 从单个细胞34。这些实验提出了有趣的实验问题, 而且由于果蝇包囊是一个包含晶体细胞、plasmatocytes 和 lamellocytes7的异构种群, 所以可以开始审问每个单元格类型35的转录响应。例如, Kurucz 等, 已经开发出抗体, 可以用来隔离果蝇全血细胞子集, 可用于转录或蛋白质组分析后, 各种刺激。此外, 最近开发的单细胞 RNAseq 技术可以定义每个细胞类型的 transcriptomes, 而不使用抗体最初分离每个细胞类型36,37,38,39. 此外, 人们可以在全血细胞子集中提出有关基因调控的问题, 这可能有助于我们了解人类血细胞谱系是如何通过比较基因组学的方法起源和进化的。解决这些问题需要广泛的实验技术的结合, 这里描述的技术可能是有用的, 当分离大量的包囊从无脊椎动物幼虫是必需的。
在这里, 我们建议将3D 模型与数值, 生化数据结合起来确认感染。在今后的研究中, 我们可以利用这里描述的方法, 通过共染色宿主蛋白, 观察免疫应答和病原体侵入宿主细胞的机制, 进行显微分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
我们感谢罗伯特 Heinzen 博士提供了 mCherry 表达贝柯克斯柯克斯的股票。我们感谢路易斯特谢拉博士提供的无脊椎动物彩虹病毒6和布卢明顿股票中心提供飞行股票。该项目部分由 NIH 赠款 R00 AI106963 (A.G.G.) 和华盛顿州立大学资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
References
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
- Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
- Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
- Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
- Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
- Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
- Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
- Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
- Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), pdb.rec11113 (2007).
- Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
- Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
- Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
- Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
- Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
- Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
- De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
- Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
- Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
- Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
- Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
- Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).
