Summary
Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.
Abstract
Durante a infecção patogênica de Drosophila melanogaster, hemócitos desempenham um papel importante na resposta imune durante a infecção. Assim, o objetivo do presente protocolo é desenvolver um método para visualizar a invasão do patógeno em um compartimento específico imune de moscas, nomeadamente hemócitos. Usando o método apresentado aqui, até de 3 × 106 hemócitos ao vivo podem ser obtidos 200 drosófila 3rd ínstar larvas em 30 min para infecção ex vivo . Como alternativa, hemócitos podem ser infectado na vivo através da injeção de 3rd ínstar larvas acompanhados por extração hematócito a pós-infecção 24 h. Estas células primárias infectadas foram fixadas, manchado e fotografada usando microscopia confocal. Em seguida, representações 3D foram geradas a partir das imagens para mostrar definitivamente a invasão do patógeno. Além disso, o RNA de alta qualidade para qRT-PCR pode ser obtido para a deteção do seguinte de mRNA do patógeno infecção e proteína suficiente podem ser extraídas destas células para análise ocidental do borrão. Tomados em conjunto, apresentamos um método para a reconciliação definitiva de invasão do patógeno e confirmação de infecção usando tipos de patógenos bacterianos e virais e um método eficiente para extração hematócito para obter suficiente ao vivo hemócitos de Drosophila larvas para experimentos de infecção ex vivo e na vivo .
Introduction
Drosophila melanogaster é um organismo modelo bem estabelecida para o estudo da imunidade inata1. Durante a resposta imune inata, hemócitos desempenham um papel importante na resposta ao desafio do patógeno. Hemócitos são críticos para encapsular parasitas, bem como tendo uma função importante na luta contra o patógeno através de ação fagocitária durante infecção fúngica, bacteriana e viral,2,3.
A fim de melhor compreender a resposta imune inata do hospedeiro à infecção microbiana patogénica, é importante Visualizar como o patógeno invade células hospedeiras durante a infecção. Esta visualização contribui para uma compreensão do mecanismo de invasão. Juntamente com detalhes de localização intracelular de patógeno e a resposta celular, esses dados podem fornecer pistas sobre a resposta do hospedeiro à infecção e as organelas celulares com os quais interage o micróbio. Assim, a reconstrução 3D modelo após a geração de imagens por microscopia pode ser útil para determinar a localização precisa de patógenos em células hospedeiras. Neste estudo, nós visualizado a invasão da Coxiella burnetii (c. burnetii), o agente causador da febre Q, uma zoonose que representa uma séria ameaça à saúde humana e animal, em primários hemócitos de Drosophila . Recentemente, foi demonstrado que a drosófila são suscetíveis ao nível de biossegurança 2 fase de nove milhas II (NMII) clone 4 tensão de c. burnetii e que esta cepa é capaz de replicar em Drosophila4, indicando que Drosófila pode ser usado como um organismo modelo para estudar a patogênese de c. burnetii .
Estudos anteriores usaram hemócitos para examinar a resposta imune inata do host. Hemócitos têm sido utilizados para observações morfológicas5,6,7, de2,de Análise morfométrica8, fagocitose análise2,3, qRT-PCR2 , 9, imunoprecipitação10,11, imunofluorescência análise10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e imuno-histoquímica de9,14. Embora a drosófila S2 células também estão disponíveis para várias em vitro experiências, immortalization e potencial de infecção viral pré-existente alterar seu comportamento15,16. O uso de células primárias em oposição a uma linhagem de células imortalizado, tais como células de S2, permite o estudo da função imune inata em um sistema mais representativo de todo o organismo. Além disso, a infecção de hemócitos na vivo, antes da extracção, permite que as células interagir com outras proteínas do hospedeiro e o tecido, uma vantagem sobre extração de hemócitos antes da infecção ex vivo . Um número de diferentes métodos têm sido utilizado para obter um número suficiente de hemócitos em um curto período de tempo para manter os hemócitos vivo8,17,18,19.
Neste estudo, apresentamos um método para extrair hemócitos de Drosophila 3rd ínstar larvas para infecção microbiana patogénica com c. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) ou invertebrado iridescente vírus 6 (IIV6). Descrevemos os métodos para infecções de hematócito in vivo e ex vivo . In vivo- e ex vivo-hemócitos infectados foram visualizadas com microscopia confocal e usados para construir modelos 3D de invasão de c. burnetii . Além disso, usando o protocolo de extração, ex vivo-hemócitos infectados foram usados para a expressão de gene e proteína ensaios. Especificamente, para examinar a extensão da infecção com IIV6 e Listeria, total RNA ou proteína foi isolada das células por qRT-PCR ou análise ocidental do borrão. Tomados em conjunto, o protocolo fornece métodos para coletar rapidamente números elevados de hemócitos de 3rd ínstar larvas e provas que primário hemócitos, infectados in vivo ou ex vivo, são uma plataforma adequada para microbiana estudos de infecção do patógeno e aplicável a jusante análises como microscopia, transcriptomics e proteômica.
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Protocol
1. infecção ex vivo
- Médio e equipamentos
- Sob condições estéreis, preparar fresco Drosophila hematócito isolando médio (DHIM) contendo 75% Schneider Drosophila médio com 25% de soro Fetal bovino (FBS) e filtro sterilize.
- Camada 2-3 pedaços de película de parafina de 10 x 10 cm sob um estereomicroscópio.
- Prepare o capilar de vidro. Defina o aquecedor extrator capilar a 55% do máximo. Puxe o tubo capilar para um ponto afiado de aproximadamente 10 µm.
- Aterramento do capilar com óleo mineral.
- Montar o tubo capilar cheio para o nanoinjector (Figura 1A) e abrir a ponta do tubo capilar fundido quebrando a ponta com pinça (Figura 1B). O diâmetro externo da ponta deve ser de 100 µm para fácil absorção dos hemócitos.
- Ejetar tanto petróleo quanto possível da ponta do tubo capilar e, em seguida, preencher com DHIM. Para fácil visualização da borda de hemolinfa tomadas de cima e o óleo, incluem uma bolha de ar entre o DHIM e o óleo (Figura 1B').
- Extração de hemolinfa
- Escolha 3rd ínstar larvas de Drosophila por dentro a parede da comida frascos suavemente usando fórceps e colocá-los em um coador de 100 µm (Figura 1C). 3rd ínstar larvas encontram-se 3 a 6 dias após a postura de uma fêmea adulta de ovos férteis.
Nota: Estas experiências usado o genótipo, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ}, 2P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, desde hemócitos desses animais expressam a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) para auxiliar na identificação das células por microscopia. - Despeje a 5 mL de água esterilizada sobre larvas e sacudir o filtro para 5 s. lugar o filtro para limpeza de tarefa remover o excesso de água (Figura 1C').
- Transferi as larvas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Anestesia com gás de CO2 por 5 s (Figura 1D).
- Coloque as larvas em filme de parafina sob o microscópio estereoscópico, com dorsal-virados para cima(Figura 2).
- O vidro capilar levemente para a posterior do corpo larval para segurá-la no lugar e perturbar a cutícula posterior estão abertos usando bem aguçado fórceps (Figura 2B).
- Permita a hemolinfa a fluir para o filme de parafina (Figura 2C).
- Fazer uma piscina de hemolinfa incluindo hemócitos de 20-50 larvas em um momento no filme de parafina.
- Ocupam em pool hemolinfa usando o vidro capilar sobre o nanoinjector (Figura 2D).
Nota: Deve haver aproximadamente 10-20 µ l de hemolinfa. - Ejete a hemolinfa em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 500 µ l de DHIM(Figura 2).
- Repita as etapas 1.2.4) - 1.2.9) para cada lote de larvas.
- Escolha 3rd ínstar larvas de Drosophila por dentro a parede da comida frascos suavemente usando fórceps e colocá-los em um coador de 100 µm (Figura 1C). 3rd ínstar larvas encontram-se 3 a 6 dias após a postura de uma fêmea adulta de ovos férteis.
- Conte o número de hemócitos.
- Pipete 5 µ l de solução de azul de Tripan 0,4% em um tubo de microcentrifuga 0,6 mL para manchar as células mortas. Delicadamente misture o DHIM e hemócitos no tubo de 1,5 mL com uma pipeta e transferir 5 µ l de DHIM incluindo hemócitos ao tubo microcentrifuga 0,6 mL e misture delicadamente.
- Pipete 10 µ l de células da mistura 1:1 Trypan azul: hematócito para o hemocytometer.
- Conte o número de hemócitos ao vivo que não estão manchadas com Trypan azul em cada um dos campos de 4 canto a hemocytomter e calcular a concentração dos hemócitos por mililitro, usando a fórmula:
onde X é a concentração de hemócitos ao vivo por mililitro; a, b, c e d são o número de células vivas (conforme determinado pela exclusão Trypan azul) em cada 4 dos campos contado na hemocytometer. Divisão por 2 do número total de células contadas é devido a diluição de 1:1 das células com Trypan azul. Células coradas com Trypan azuis são consideradas mortas.
-
Ex vivo Infecções
- Determine o número de poços para ser semeado com células com base em momentos e biológicas Replica necessários para cada experimento. 5,0 × 104 hemócitos são desejáveis para a purificação de RNA e proteína após a infecção.
- Calcule o volume de estoque de patógeno para ser diluído com DHIM para infecção usando a seguinte fórmula:
onde a multiplicidade de infecção (MOI) é o número de vírus ou bactérias desejado por célula.
Nota: MOI utilizado depende da experiência individual e ensaios realizados. Aqui, 10 equivalentes de genoma (GE) / célula de c. burnetii, 10 CFU/célula de Listeriaou 1 TCID50/cell de IIV6 foi usada. - Prepare 500 µ l de meio do patógeno para cada poço de uma placa de 24, acrescentando o volume adequado de DHIM para o volume, viral ou bacteriano em um tubo.
- Lugar de 12mm redondo tampa de vidro (espessura do n º 1) em um poço de uma placa de 24.
- Dividi o DHIM incluindo os hemócitos nos poços de uma placa de 24.
- Adicione 500 µ l de meio de patógeno de hemócitos em um poço.
- Centrifugue a placa a 1.000 x g por 5 min.
- Incubar a placa por 1h a 28 ° C. Cada 15 min, inclinar suavemente a placa de trás para frente, depois à esquerda para a direita para 5 s pela mão.
- Após a 1h de passo invasão/acessório 1.4.8), delicadamente Pipetar fora do meio do patógeno lavar os hemócitos com fresco DHIM e enchê-lo com 500 µ l de DHIM fresco.
- Incube os hemócitos infectados durante o tempo desejado. Nesses experimentos, a c. burnetii- ou hemócitos IIV6 infectados são incubados durante 24 h e Listeria-hemócitos infectados são incubadas durante 1, 2 ou 4 h.
2. infecção in vivo
- Infecção
- Aquecer a placa de ágar de suco de fruta drosófila em temperatura ambiente por 15 min. placas são feitas como anteriormente descrito20.
- Adicionar 30 g de ágar-ágar para 700 mL de água e autoclave para 40 min.
- Dissolva 0,5 g de paraben metílico em 10 mL de etanol absoluto.
- Adicione a solução de paraben metílico para 300 mL de suco de fruta concentrado.
- Rapidamente, misture o suco concentrado para a solução de ágar autoclavados e dispense 5 mL em 10 × 35 mm placas de Petri.
- Depois que as chapas tenham esfriado por 15 min, armazená-los em 4 ° C.
- Preparar 3rd ínstar larvas seguindo passos 1.2.1) - 1.2.3).
- Coloque a massa de levedura sobre uma placa de ágar. Fazer um corte bem na placa de ágar, onde as larvas podem migrar para evitar a secagem(Figura 3). Monte uma agulha de tungstênio pontiagudo 0.001 mm com segurando fórceps usando a película de parafina (Figura 3B, C).
- Pipete 50 µ l de alta-título mCherry expressando -c. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) para a parafina filme sob o microscópio estéreo e colocar as larvas para o pool de bactérias.
- Coloque as larvas para o pool de bactérias. Pique as larvas com uma agulha de tungstênio (Figura 3-D). Transferi as larvas em uma placa de ágar-ágar (Figura 3E).
- Transfira o restante meio de patógeno na placa de ágar e selar a placa com a película de parafina.
- Manter as larvas no prato no ar húmido até a pós-infecção tempo desejado (Figura 3-F). Neste experimento, a c. burnetii-são larvas infectadas na placa por 24 h.
- Aquecer a placa de ágar de suco de fruta drosófila em temperatura ambiente por 15 min. placas são feitas como anteriormente descrito20.
- Extração de hemolinfa e chapeamento de hemócitos
- Prepare a médio e equipamentos seguindo passo 1.1).
- Lugar de 12mm redondo tampa de vidro (espessura do n º 1) em um poço de uma placa de 24. Pipete 500 µ l de DHIM dentro do poço.
- Extrair a hemolinfa de larvas infectadas seguindo passos 1.2.4) - 1.2.8).
- Ejete a hemolinfa para o bem seguindo passo 2.2.2).
- Repita 2.2.3) e 2.2.4) para vários lotes de larvas.
- Centrifugue a placa a 1.000 x g por 5 min.
3. visualização
- Fixação e coloração
- Após permitir os hemócitos resolver sobre o vidro de tampa redondo no poço, remova cuidadosamente o meio de cada poço.
- Delicadamente adicione 200 µ l de paraformaldeído 4% (PFA) a cada poço de hemócitos liquidados. Incube os hemócitos por 20 min em temperatura ambiente.
- Remova os 4% PFA e suavemente adicionar 200 µ l de PBS contendo 0,1% Triton X-100 e 1% albumina de soro bovino (BSA) em cada poço. Incube os hemócitos durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Remover a PBS e suavemente adicionar 200 µ l de 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a cada poço. Incube os hemócitos durante 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.
- Remover a solução DAPI e adicione delicadamente PBS a cada poço. Incube os hemócitos durante 5 min à temperatura ambiente.
- 10 µ l do meio de montagem antidesgaste uma gota em uma lâmina de vidro de microscópio.
- Depois de retirar a PBS de cada poço, remova o tampa de vidro da placa de 24-bem usando pinça fina-apontou. Coloque suavemente o vidro de cobertura para o meio de montagem antidesgaste sobre a lâmina de vidro, com os hemócitos virado para baixo.
- Permitir que o slide secar, colocando-o na noite escura.
- Imagem latente confocal
- Configure o microscópio confocal para três imagens de cor de DAPI, EGFP e mCherry. Usar a seguinte configuração: excitação de DAPI (ex) 405 nm, emissão (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
- Coloque a amostra no microscópio e foco na amostra usando um 63 X / 1.4 objetivo abertura numérica (NA). Localize hemócitos desejados no campo de visão para a imagem latente.
- Ajuste os ganhos de potência e detector laser para obter a exposição adequada da amostra. Verifique múltiplas z-aviões para garantir que o nível de exposição é apropriado para a espessura de toda a amostra.
- Encontre a posição superior e inferior do eixo z de um hematócito toda. Defina essas posições como as posições inicial e final para z-seccionamento.
- Somente utilize o zoom de varredura a imagem, a área que contém o hematócito. Fatores de zoom de 3x são usados frequentemente.
- Recolha a série de imagem em resolução apropriada como 1024 x 1024 pixels no plano x-y e espaçamento de 0,3 µm na dimensão z.
- Reconstrução do modelo 3D
Nota: O software de fonte aberta existe que executa muitas das funções descritas para a reconstrução do modelo 3D.- Importe o arquivo de série z-seccionado imagem para o software associado com o microscópio confocal para reconstrução do modelo 3D.
- Selecione uma célula mostrando co localização dos núcleos corados com DAPI e mCherry expressando a c. burnetii em um EGFP expressando hematócito. A série de imagem para conter apenas a única célula de colheita.
- Selecione a opção de visualizador 3D, que reconstrói o modelo 3D usando algoritmo pré-embalados do software. Escolha o tipo desejado de representação 3D entre mistura, superfície e opções de mistura. Neste método, hemócitos, núcleos e c. burnetii são mostrados usando modelos de superfície.
- Observe a célula reconstruída 3D de várias posições de visualização segurando o botão do mouse e arrastando o cursor ao redor da tela. Ajuste a célula orientação e posição da fonte de luz modelada para otimizar a imagem. Existem outras opções para opacidade, mínimo e limite máximo, especulares, Ambient, Shineness e gama para otimizar a imagem.
- Secções transversais através do modelo usando os comandos Recortar e corte para visualizar o conteúdo interior do hematócito de leve.
4. aplicação de análise genética e/ou proteína
- Após a infecção com IIV6 e Listeria, lyse pilhas para posterior qRT-PCR ou análise ocidental do borrão como descrito anteriormente21 e seguir indicações do fabricante.
Nota: Consulte a Tabela de materiais para as primeiras demão para qRT-PCR e os anticorpos para o borrão ocidental. - Analise os produtos de PCR por electroforese do gel do agarose, como descrito anteriormente,22, para garantir o comprimento correto do produto amplificado.
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Representative Results
Para recolher jus hemócitos para infecção ex vivo , a 3 × 106 hemócitos foram extraídos de 200 drosófila 3rd ínstar larvas. Para desenvolver o nosso método, um número de diferentes técnicas foram tentado. Dissecação de larva individual levaria até 1,5 h, e uma média de ~ 8000 células foram obtidos usando este método18, a maioria dos quais não estava viva até o final da coleção. Em seguida, nós tentamos extrair a hemolinfa, que continha os hemócitos, de 20 larvas em um tempo usando um tubo capilar de vidro19, mas o capilar tornou-se entupido com cutícula, material e a hemolinfa não foi capaz de ser eficientemente absorvido por vidro capilar. Finalmente, nós mecanicamente interrompeu a cutícula de larvas de 20-50 por lote com pinça fina12e fez uma piscina de hemolinfa de fácil absorção. Isto permitiu a coleção fácil de uma grande quantidade de hemócitos de um grande número de larvas (tabela 1).
Para indicar que o extraído hemócitos estavam vivos e apropriado para a infecção, realizou-se um ensaio de exclusão azul Trypan para calcular a porcentagem de hemócitos ao vivo extraído usando o método aqui apresentado (Figura 6A). Além disso, comparamos nosso método para extração de hematócito com um método publicado anteriormente, onde o objetivo era desenvolver um método de ruptura mecânica para isolar e distinção entre circulante e residente hemócitos de indivíduo da drosófila larva23. A comparação entre os dois métodos de 10 isolamentos experimentais independentes, observamos que a viabilidade celular foi ligeiramente maior, usando o método aqui apresentado (Figura 6A); no entanto, o método de Petraki et al. rendeu-se perto de hemócitos o dobro de cada 10 larvas dissecadas (Figura 6B). Uma razão para o aumento do número de hemócitos do Petraki et al. método é que este método coleta residentes hemócitos (séssil), bem como hemócitos circulantes. Para confirmar que as células extraídas com o método apresentado aqui na verdade eram hemócitos, utilizamos uma mosca linha contendo transgenes para a promotora de hemolectin (Hml) dirigindo GAL4 hemócitos de circulação que vincula a sequência de montante ativador (UAS) para Ative a transcrição da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) e expressão nos hemócitos. Hemócitos de hml-GAL4 > UAS-EGFP larvas foram extraídas sobre guias de lamela septadas, fixados, permeabilized e manchado com DAPI como descrito anteriormente21. A Figura 7 mostra que a maioria das células de DAPI-positivos também são EGFP-positivo. Quantificação da expressão co realizou-se de várias imagens, de que calculamos que 86±9% de células isoladas foram hemócitos.
O protocolo em modelos 3D inovadores da invasão do patógeno em Drosophila hemócitos extraído 3rd ínstar larvas após infecção ex vivo ou vivo em c. burnetii . Fomos capazes de imagem c. burnetii infecção, uma vez que as bactérias expressam mCherry. Depois de hemócitos infectados eram fixas e manchados, eles foram fotografados para DAPI, EGFP e mCherry utilizando microscopia confocal. Taxas de infecção hematócito, conforme determinado pela porcentagem de células positivas EGFP que também exibiu mCherry sinal, para infecções ex vivo e em vivo C. burnetii foi quase 100%. Isso era esperado desde um MOI de 10 GE/celular foi usado para infecção ex vivo , que deve resultar em infecção de 100% das células24. Em relação as infecções em vivo , desde que as larvas são colocadas em uma gota de alta concentração de mCherry expressando -c. burnetii (5,95 × 109 GE/mL), o número de bactérias é aproximadamente 10,000-fold maior do que o número de hemócitos por larva. Portanto, espera-se uma taxa de infecção de 100% para as infecções na vivo .
Em seguida, Z-seções foram coletadas através do hematócito Visualizar toda a célula em 3D e para confirmar a presença de c. burnetii no interior da célula. A Figura 4 mostra seções transversais transparentes de um hematócito (em verde) com a c. burnetii (em vermelho) visto no interior da célula. As imagens também foram reconstruídas em um modelo 3D (Figura 5), que representa as superfícies do hematócito e c. burnetii, mais uma vez mostrando a c. burnetii no interior os hemócitos seccionados. Curiosamente, na vivo-hemócitos infectados exibiu maiores extensões citoplasmáticas e foram mais planas na natureza, enquanto ex vivo-hemócitos infectados foram mais esférico (Figura 5). Isso poderia indicar uma maior população de lamellocytes no na vivo-infectou a população e plasmatocytes no ex vivo população7. Enquanto lamellocyte diferenciação geralmente é induzida durante a infecção de vespa parasita25, ferindo das larvas de Drosophila também é suficiente para induzir a diferenciação de lamellocyte26. Finalmente, enquanto não utilizados nas experiências aqui apresentadas, existem GFP-expressando formas de Listeria27 e IIV628 que poderia ser usado para gerar modelos 3D de infecção hematócito. Em vez disso, Listeria- e IIV6-infectados hemócitos foram utilizados para experiências ocidentais de mancha e qRT-PCR.
Usando o método apresentado aqui, infecções são executadas ex vivo e na vivo para a imagem latente. Além disso, a análise de mRNA e da proteína do patógeno seguido ex vivo infecções. Especificamente, hemócitos extraídos foram infectados com IIV6 e foram aplicados à análise de qRT-PCR. Mostrou níveis significativamente mais altos de IIV6-193R, um gene viral que codifica para um putativo inibidor da apoptose29, entre simulação e IIV6-células infectadas por (Figura 8A). Eletroforese dos produtos amplificados confirmou a presença de uma banda para o produto do gene IIV6-193R na amostra infectada, mas não infectados por simulação amostra (Figura 8-B). Bandas amplificadas para o controle endógeno RpII foram encontradas em todas as amostras, e infecção IIV6 em S2 células foram realizadas como controle positivo. Desde que IIV6 infecções foram realizadas em um MOI de 1 TCID50/cell, aproximadamente 50% das células eram esperados para ser infectado, baseado sobre a distribuição de Poisson24.
Proteínas totais de simulação - ou Listeria -infectados hemócitos foi coletada em 1, 2 e 4 h pós-infecção e concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bicinchoninic ácido (BCA). 100% das células eram esperados para ser infectada ex vivo desde o MOI 10 CFU/celular24. Mancha ocidental confirma a presença de Listeria-derivados de proteína nos hemócitos infectados, com altos níveis alcançados por infecção pós de 4 h (Figura 9). Inóculo de Listeria é usado como um controle positivo para a detecção de Listeria-bandas específicas. A presença de actina é mostrada nos exemplos de hematócito para confirmar os níveis de proteína de carregamento. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que os hemócitos extraídos usando o método apresentado aqui foram adequados para ambos os experimentos de infecção viral e bacteriana.
Figura 1 : Contorno de equipamentos e materiais usados para extração de hematócito. Equipamento primeiro foi preparado antes da dissecação. A) o capilar de vidro puxada do nanoinjector foi inserido após volta-cheia de óleo mineral. B) a ponta fundida do vidro capilar foi quebrada com a pinça para criar um 100 µm de diâmetro exterior. B') DHIM foi retomada pela capilar para evitar a contaminação de célula e as bolhas de ar foram introduzidas para fazer uma distinção clara entre óleo e DHIM. C) as larvas são colhidas a partir de frascos de comida e colocadas em um coador de célula. C') as larvas são lavadas em água estéril e água é removida com uma limpeza da tarefa, D) larvas são transferidas para um tubo de microcentrifugadora e anestesiadas com gás de CO2 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Linha do tempo e fluxo gráfico para a extração de hemócitos. A) as larvas são colocadas ao seu lado dorsal antes de abrir a cutícula. B) a cutícula é interrompida com pinça pontiaguda bem e a agulha capilar. C) a hemolinfa é sangrada para película de parafina. D) piscinas de hemolinfa de 20-50 larvas são pegadas com o capilar de vidro e nanoinjector. E) a hemolinfa e hemócitos são transferidos para um tubo de microcentrifugadora contendo 500 µ l DHIM ser contada com um hemocytometer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: In vivo infecção. A) fruta Drosophila suco placas de ágar e colar de levedura são usados para a incubação de larvas na vivo infectado. Cortes são feitos em placa de ágar para facilitar a longevidade de larvas (setas cinzas). B) uma agulha de tungstênio aguçado de 0.001 mm é anexada ao fórceps usando a película de parafina. C) a ponta da agulha de tungstênio aguçado de 0,001 mm. D) a larva é picada com agulhas de tungstênio na piscina patógeno no filme parafina sob microscópio estéreo. E) as larvas eretas são colocadas na placa de ágar. F) a placa é selada com uma película de parafina e manteve em toalha de papel úmida no recipiente até o momento apropriado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Cortes transversais de invasão do patógeno nos hemócitos. Seções extraídas da varredura confocal 3D de hemócitos patógeno-infectados. A, B) xy-seções mostra c. burnetii (em vermelho marcado com setas brancas) no interior do hematócito. As pontas de seta cinzas mostram os núcleos de hemócitos. A', um ", B') vistas incluindo xz e yz --seção imagens mostram a invasão de c. burnetii os hemócitos de 2 pontos de exibição adicionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Modelos 3D de invasão do patógeno nos hemócitos. Modelos 3D reconstruídos de c. burnetii invasão de hemócitos são gerados após infecção ex vivo e na vivo . Modelo pode ser girado livremente usando o software; aqui 6 pontos de visualização são mostrados com o hematócito em verde, c. burnetii em vermelho (setas brancas) e o núcleo em azul (pontas de seta cinzas). Também são mostradas as imagens de secção transversal mostrando o interior das células do patógeno-invadida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : A porcentagem e a população de hemócitos ao vivo. Hemócitos foram extraídos de grupos de 10 3rd ínstar larvas usando o método de Petraki et al e o método apresentado aqui. A) a percentagem de hemócitos ao vivo foi calculada para cada técnica por ensaio de exclusão azul Trypan. B) a população total de hemócitos foi comparada entre as duas técnicas. Os gráficos de barras representam o média ± desvio-padrão de N = 10 repetições biológicas por método de extração e ensaio de tipo. P-valores são indicados de Variância desigual assumindo de um Student bicaudal teste-T. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Imagens de hemócitos extraídos usando o driver hemolectin. Hemócitos foram extraídos de 80 larvas de w,1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ}, 2P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH2. O promotor para Hml drives GAL4 em circulação hemócitos, que vincula a UAS para ativar a expressão e transcrição de EGFP. Os hemócitos foram fixados e corados com DAPI como descrito anteriormente,20. Hemócitos são montados em lamelas septadas e pelo contrato de interferência diferencial (DIC) e microscopia de fluorescência. O canal azul mostra o núcleo manchado com DAPI e o canal verde mostra os hemócitos expressando EGFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : qRT-PCR e gel de electroforese. A expressão do gene IIV6-193R foi observada por qRT-PCR apenas nos hemócitos IIV6 infectados. A) expressão do gene 193R foi normalizada para o controle interno, RpII e apresentada como uma relação. O número de ciclo para os simulação infectados hemócitos arbitrariamente foi definido como um número máximo ciclo de 40 para análise desde 193R não foi detectado nestas amostras. Dados representam o média ± desvio-padrão do N = 3 repetições biológicas por grupo. O P-valor indica um bicaudal de T-Student presumindo Variância desigual. B) os produtos de qRT-PCR são mostrados por eletroforese em gel de agarose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : Análise ocidental do borrão. A expressão de antígenos de Listeria e actina no mock - e Listeria-infectados hemócitos de 3rd ínstar Drosophila larvas em 1, 2 e 4 h pós-infecção (p.i.) são determinadas pela mancha ocidental. Concentrações de proteínas totais foram determinadas por ensaio Bicinchoninic ácido (BCA) para normalizar a quantidade total de proteína carregada em cada faixa do gel. Inóculo utilizado para infectar os hemócitos foi usado como um exemplo positivo de controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Método | Número médio de larvas para a extração de hematócito |
Número médio de hemócitos totais |
| hemolinfa extração capilar (este método) |
192.44 (SD: 86.05) | 4.56 x 105 células (SD: 5,83 x 105) |
| (Intervalo: 70-390, N = 25 testes) | (Intervalo: 1.20 x 105 - 2.95 x 106 células) | |
| individuais dissecação de larvas |
26.67 (SD: 11.55) | 8.33 x 103 células (SD: 6.66 x 103) |
| (Intervalo: 20-40, N = 10 testes) | (Intervalo: 4,00 x 103 - 1,60 x 104 células) | |
| larval extração capilar * |
N/A * | N/A * |
| * hemócitos não puderam ser extraídos usando este método devido ao entupimento da agulha capilar | ||
Tabela 1: número de dissecados larvas e extraídos usando diferentes técnicas de hemócitos. Os números médios das larvas dissecadas e hemócitos extraídos foram comparados entre o método apresentado aqui e outros métodos. Nosso método resultou na coleta de um maior número de larvas e hemócitos. O método de extração capilar larval também foi tentado, mas hemócitos foram incapazes de ser extraído devido ao entupimento da ponta do capilar.
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Discussion
Para entender melhor como células hospedeiras tornar-se infectado, é importante esclarecer a localização do patógeno nas células, especialmente quando a fazer experiências com o patógeno previamente testado e de combinações de tipo de célula4. Enquanto estuda a cascata de resposta celular após infecção pode indicar invasão do patógeno produtiva, a combinação dos dados de resposta celular e imagem é essencial para demonstrar a infecção e invasão do patógeno. Enquanto relatórios mostrando imagens 2D de invasão do patógeno nas células do hospedeiro tendem a indicar infecção produtiva, algumas perguntas podem permanecer sobre o momento da invasão inicial do patógeno em células hospedeiras. Assim, reconstruídos a partir de z-seção de digitalização de imagens em 2D de modelos 3D podem abordar estas questões e indicar a localização do patógeno nas células hospedeiras (figuras 4 e 5). No entanto, uma limitação do uso de hemócitos primários é a sua longevidade na cultura de pilha. Um relatório anterior afirma que hematócito sobrevivência em meios de cultura de células é de 8 h apenas18, e em nosso protocolo de infecção, fomos capazes de realizar ensaios até às 24h, mas não mais. Portanto, não foi possível observar a altos níveis de replicação de c. burnetii ou a formação da parasitophorous vacuole que não começam a se formar até pós-infecção 2 dias e não é grande o perceptìvel até 4-6 dias de pós-infecção30 .
Para muitos experimentos onde os ponto de extremidade de ensaios utilizam a proteína ou RNA para análise, grandes números de células são normalmente necessários para produzir material suficiente para interrogatório. Por exemplo, aqui, usamos análises de ponto de extremidade como mancha ocidental e qRT-PCR para sondar a extensão da infecção do patógeno em hemócitos primários derivado 3rd ínstar larvas de Drosophila . Assim, o método apresentado aqui centra-se na rápida dissecção larval e a coleção da hemolinfa contendo suficientes hemócitos ao vivo para a infecção do patógeno ex vivo . Esse método introduz o uso de um nanoinjector para ocupar a hemolinfa e hemócitos rapidamente. Colocando os hemócitos em DHIM contendo 25% FBS é importante para a sobrevivência do hematócito. Além disso, para as infecções ex vivo aqui apresentadas, é necessários um grande número de hemócitos. Para evitar melanização31,32,33, dissecção e coleção hematócito devem ocorrer rapidamente. Enquanto outros métodos para extração de hematócito existem18,19,23, a duração desses métodos para coletar um número suficientemente grande de hemócitos para infecção ex vivo era muito grande. A ponta fina de 100 µm é benéfica para a absorção de hemolinfa sem ocupar outros órgãos que podem levar ao entupimento da agulha capilar. O uso de um nanoinjector também pode ser automatizado, quando é anexado a um estágio de micromanipulador e o pé do pedal, permitindo ao usuário focar-se rápido dissecação das larvas de Drosophila e diminuir o tempo que o hemócitos são sem circundantes larval meios de cultura de tecido ou célula. No entanto, o uso de uma pipeta também está disponível para assumir a hemolinfa para transferência para DHIM. Além disso, o nosso método utiliza gás de CO2 para anestesiar as larvas antes da dissecção; o uso de um bloco frio com revestimento de película de parafina é outro método viável23. Finalmente, dissecação de larvas em uma gota de DHIM durante o lançamento da hemolinfa pode reduzir o número de hemócitos que estão perdidas de degola para a película de parafina, mas aumentará o tempo necessário para a absorção pela agulha capilar.
Uma resposta imune comum em Drosophila a lesão, que ocorre durante a abertura e a dissecação da cutícula larval, é melanização31,32,33. Durante a extração de hemócitos, observaríamos melanização dos hemócitos no DHIM tão cedo como 10 min após a extração. Como melanização é um processo rápido, estas células seriam excluídas os experimentos de infecção do patógeno. Além disso, o phenylthiourea de anticoagulante pode ser adicionado a DHIM para inibir o sistema phenoloxidase-ativando e melanização durante ferindo9. No entanto, como melanização e apoptose é inatas respostas imunes de Drosophila, seus níveis podem ser seguintes quantificados hematócito extração e estimulação usando os métodos descritos aqui.
Enquanto recuperar grandes quantidades de proteína ou RNA material é um requisito para técnicas como borrão ocidental e qRT-PCR, novas técnicas, tais como RNAseq exigem muito menos entrada de material, tão pouco quanto 10 pg do RNA total de alta qualidade de uma única célula,34. Experiências como estas criar interessantes perguntas experimentais, e como Drosophila hemócitos são uma população heterogênea, contendo células de cristal, plasmatocytes e lamellocytes7, um poderia começar a interrogar o resposta transcricional de cada célula tipo35. Por exemplo, Kurucz et al, desenvolveram anticorpos que poderiam ser usados para isolar os subconjuntos hematócito drosófila que poderiam ser usados para transcricional ou proteomic perfilação seguindo vários estímulos. Além disso, o desenvolvimento recente de uma única célula RNAseq tecnologia poderia definir transcriptomes de cada tipo de célula sem o uso de anticorpos inicialmente separar cada célula tipo36,37,38, 39. Além disso, um poderia fazer perguntas sobre regulação gênica em subconjuntos hematócito que podem nos ajudar a entender como humano linhagens de células do sangue originou-se e evoluíram a partir de organismos antigos genómica comparativa através de esforços. Enfrentar estes problemas requer a combinação de uma vasta gama de técnicas experimentais, e a técnica descrita aqui pode ser útil para tais esforços quando o isolamento de um grande número de hemócitos de larvas de Invertebrados é necessário.
Aqui, sugerimos que a combinação de 3D modelos com dados numéricos, bioquímicos para confirmação da infecção. No futuro, estudos, podemos usar os métodos descritos aqui para observar respostas imunes e o mecanismo de invasão do patógeno em células hospedeiras co manchando proteínas do hospedeiro para análise de microscopia.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Nós estamos gratos ao Dr. Robert Heinzen para fornecimento de estoques de mCherry-expressando Coxiella burnetii. Agradecemos o Dr. Luis Teixeira para fornecer invertebrados iridescente vírus 6 e o centro de estoque de Bloomington para fornecer estoques voar. Este projeto foi financiado em parte pelo NIH grant R00 AI106963 (para A.G.G.) e Universidade de estado de Washington.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
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