在这里, 我们描述了一个协议的染色质沉淀的修饰组蛋白从萌芽酵母酿酒酵母。Immunoprecipitated DNA 随后用于定量 PCR 研究组蛋白修饰修饰的丰度和局部化。
组蛋白修饰修饰 (PTMs), 如乙酰化, 甲基和磷酸, 是由一系列酶动态调节的, 它们可以添加或除去这些标记, 以响应细胞接收到的信号。这些 PTMS 是调控基因表达调控和 DNA 修复等过程的关键因素。染色质沉淀 (芯片) 一直是一个工具的方法, 以解剖的丰度和本地化的许多组蛋白 PTMs 整个染色体, 以响应对细胞的各种扰动。在这里, 一个多功能的方法来执行芯片的 post-translationally 修饰组蛋白从萌芽酵母酿酒酵母 (S. 酵母)描述。该方法依赖于用甲醛处理酵母培养物的蛋白质和 dna 的交联, 通过微珠打浆产生酵母裂解, micrococcal 核酸和组蛋白 DNA 的沉淀对染色质片段的增溶。配合.与组蛋白标记相关的 DNA 被纯化并进行定量 PCR 分析, 以评估其在多个基因座上的富集。对野生和突变酵母中组蛋白标记 H3K4me2 和 H4K16ac 定位的代表性实验进行了探讨, 以验证数据分析和解释。该方法适用于多种组蛋白 PTMs, 可与不同的突变菌株或在不同环境应力的情况下进行, 使其成为研究各种条件下染色质动力学变化的极好工具。
组蛋白的动态修饰修饰 (PTM) 是许多 dna 模板化过程的关键调控机制, 包括转录、复制和 dna 修复1,2。因此, 确定修饰组蛋白的丰度和精确定位与这些过程相伴的能力, 对于了解它们在细胞不同条件下的调节是至关重要的。染色质沉淀 (芯片) 的发展主要来源于生物化学研究的蛋白质与 DNA 的相互作用, 特别是体外方法使用化学交, 再加上需要评估蛋白质-DNA 相互作用的动态性质在体内和在基因组的特定区域3,4,5。定量 PCR (qPCR) 和测序技术的进步也扩大了进行芯片实验的能力, 以定量比较和整个基因组, 使之成为解剖 DNA-蛋白质相互作用的有力工具多个级别。
目前, 芯片是一个必要的方法, 任何研究组感兴趣的染色质介导的基因组的调节, 因为有没有可比的方法直接询问的物理联系的修饰组蛋白和特定的基因座的轨迹在体内。尽管此方法的变体使用下一代测序来映射组蛋白修饰, 在整个染色体6,7中可用, 但这些方法可以解决不同的科学问题及其规模、成本和技术资源可能限制一些研究组。此外, 有针对性的芯片 qPCR 是必要的, 以补充这些方法, 提供的方式, 以优化的芯片协议之前, 排序和验证的结果, 从表数据集。质谱法的方法, 以确定完整补充的组蛋白标记相关的基因区域也出现了8,9,10,11, 但是, 这些方法有一些限制, 关于哪些区域的基因组可以被探测, 他们需要的技术专长和仪器, 将无法提供给所有研究组。因此, 芯片仍然是分析组蛋白修饰在不同条件下的丰度和分布的基础方法, 对所有感兴趣的研究小组的遗传学, 染色质和基因组功能的调节。
在这里, 我们描述了一个方法的芯片使用萌芽酵母模型酿酒酵母 (S.) , 以研究组蛋白 PTMs 在染色质上的分布。这种方法依赖于在酵母中开发的一些芯片协议的核心组件, 也适用于不同的模型系统12,13。修饰组蛋白与 DNA 在细胞内的相互作用与甲醛交联保存。在裂解制备后, 染色质碎片通过消化 micrococcal 核酸溶解成 uniformly-sized 片段。修饰组蛋白的沉淀是用商业或实验室生成的抗体进行的, 任何相关的 DNA 都是用 qPCR (图 1) 分离和分析的, 以便在特定的染色体区域富集。对于许多组蛋白修饰, 从这个协议获得的 DNA 的数量是足够的测试超过25不同的基因座的 qPCR。
这种芯片方法是高度通用的监测在多个突变株或环境条件下的单一组蛋白修饰的分布, 或测试多组蛋白修饰在野生细胞的多个基因座基因座。此外, 该协议的许多组成部分很容易调整, 以优化检测无论是高或低丰富的组蛋白标记。最后, 在芽酵母中修饰组蛋白的执行芯片提供了使用关键的控制抗体特异性的机会, 在其他系统中基本上是不可用的。即, 酵母菌株可以产生, 携带点突变的组蛋白残留的目标是修改, 在某些情况下, 只有一个单一的酶, 催化修饰特定的组蛋白残留 (e. g. 组蛋白赖氨酸甲基)。因此, 芯片可以在组蛋白突变体或酶缺失菌株中进行, 以测定抗体的非特异性结合程度, 并产生假阳性结果。这种控制是特别有价值的新发展的抗体, 甚至可以用来验证抗体特异性的保守组蛋白修饰之前, 其使用的其他系统。这种方法补充了其他方法来测试抗体特异性, 区分不同的修饰状态 (如单, di 和三甲基化), 包括探针阵列的修饰肽和执行西方印迹的组蛋白或核具有定义的修改。总的来说, 芽酵母的芯片是一种强有力的方法来评估组蛋白 PTMs 的动态, 在整个染色体和解剖的机制控制他们的调节。
这里描述的过程允许有效地恢复 DNA 与修饰组蛋白相关的酵母细胞中的沉淀。随后, qPCR 使用引物放大感兴趣的区域, 以确定局部富集或特定组蛋白修饰的损耗。尽管在近20年前被开发成为一种方法, 但芯片仍然是研究组蛋白修饰状态在不同的染色体区域和在各种条件下的决定性的检测。尽管芯片耦合到下一代测序技术可以在全基因组范围内对蛋白修饰进行审问6,<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢格林实验室的成员进行有益的讨论。这项工作得到了部分由 NIH 赠款 R03AG052018 和 R01GM124342 E.M.G。
Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
Tris | Amresco | 0497-5KG | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
α H3 | Abcam | ab1791 | |
α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |