Saccharomyces cerevisiae से citrullinated संशोधनों की क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप)
Summary
यहां, हम नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeसे संशोधित histones के क्रोमेटिन immunoprecipitation के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । Immunoprecipitated डीएनए बाद में मात्रात्मक पीसीआर के लिए प्रयोग किया जाता है बहुतायत और citrullinated पद के जीनोम भर में अनुवाद संशोधनों के स्थानीयकरण पूछताछ ।
Abstract
citrullinated पोस्ट-शोधों में संशोधन (PTMs), जैसे acetylation, मिथाइल और फास्फारिलीकरण, एंजाइमों की एक श्रृंखला द्वारा गतिशील रूप से विनियमित होते हैं जो सेल द्वारा प्राप्त संकेतों के जवाब में इन चिह्नों को जोड़ते या निकालते हैं. इन PTMS जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण और डीएनए की मरंमत के रूप में प्रक्रियाओं के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) की बहुतायत और कई citrullinated PTMs के स्थानीयकरण के लिए सेल के विविध perturbations के जवाब में जीनोम भर में एक वाद्य दृष्टिकोण रहा है । यहाँ, नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae (एस cerevisiae) से अनुवाद के बाद संशोधित histones चिप के प्रदर्शन के लिए एक बहुमुखी विधि का वर्णन किया गया है । इस विधि से प्रोटीन और डीएनए के crosslinking पर निर्भर करता है खमीर संस्कृतियों के formaldehyde उपचार का उपयोग, मनका पिटाई से खमीर lysates की पीढ़ी, क्रोमेटिन micrococcal द्वारा nuclease टुकड़े के solubilization, और immunoprecipitation के citrullinated-डीएनए परिसरों. डीएनए ब्याज की citrullinated निशान के साथ जुड़े शुद्ध और मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण करने के लिए जीनोम भर में कई loci पर अपने संवर्धन मूल्यांकन के अधीन है । प्रतिनिधि प्रयोगों citrullinated मार्क्स H3K4me2 और wildtype और उत्परिवर्ती खमीर में H4K16ac के स्थानीयकरण की जांच डेटा विश्लेषण और व्याख्या प्रदर्शित करने के लिए चर्चा कर रहे हैं । इस विधि citrullinated PTMs की एक किस्म के लिए उपयुक्त है और विभिन्न उत्परिवर्ती उपभेदों के साथ या विविध पर्यावरणीय तनावों की उपस्थिति में किया जा सकता है, यह विभिन्न स्थितियों के तहत क्रोमेटिन गतिशीलता में परिवर्तन की जाँच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बना रही है.
Introduction
गतिशील पोस्ट-शोधों संशोधन (PTM) histones के कई डीएनए-टेम्पलेट प्रक्रियाओं, प्रतिलेखन, प्रतिकृति और डीएनए की मरम्मत1,2सहित के लिए एक महत्वपूर्ण नियामक तंत्र है । इन प्रक्रियाओं के साथ सहवर्ती संशोधित histones की बहुतायत और सटीक स्थानीयकरण निर्धारित करने की क्षमता इसलिए सेल में विभिन्न परिस्थितियों में उनके विनियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के विकास के एक विधि के रूप में मोटे तौर पर डीएनए के साथ प्रोटीन की बातचीत के जैव रासायनिक अध्ययन से उपजी, विशेष रूप से इन विट्रो तरीकों रासायनिक crosslinkers का उपयोग कर, मूल्यांकन की आवश्यकता के साथ युग्मित प्रोटीन की गतिशील प्रकृति vivo में डीएनए बातचीत और जीनोम3,4,5के विशिष्ट क्षेत्रों में । मात्रात्मक पीसीआर की उंनति (qPCR) और अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों भी मात्रात्मक तुलना और पूरे जीनोम के साथ चिप प्रयोगों प्रदर्शन करने की क्षमता का विस्तार किया गया है, यह डीएनए विच्छेदन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाने में प्रोटीन बातचीत कई स्तरों ।
वर्तमान में, चिप किसी भी अनुसंधान क्रोमेटिन में रुचि समूह के जीनोम के मध्यस्थता विनियमन के लिए एक आवश्यक तरीका है के रूप में वहां सीधे एक संशोधित citrullinated और एक विशिष्ट जीनोमिक लोकस के बीच शारीरिक लिंक पूछताछ के लिए कोई तुलनीय तरीके हैं vivo. हालांकि इस विधि के रूपांतरों के जीनोम6भर में citrullinated संशोधनों नक्शा करने के लिए अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर,7 उपलब्ध हैं, इन दृष्टिकोण अलग वैज्ञानिक प्रश्नों और उनके पैमाने पर पता कर सकते हैं, लागत और तकनीकी संसाधनों कुछ अनुसंधान समूहों के लिए सीमित हो सकता है । इसके अतिरिक्त, लक्षित चिप-qPCR दोनों के लिए विधियों प्रदान करके इन तरीकों को पूरक करने के लिए आवश्यक है अनुक्रमण करने से पहले चिप प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़ करने के लिए और epigenomic डेटासेट से परिणाम को मान्य करने के लिए. जीनोमिक क्षेत्रों से जुड़े citrullinated चिह्नों के पूर्ण पूरक की पहचान के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित दृष्टिकोण भी8,9,10,11उभरे हैं, तथापि, ये दृष्टिकोण कुछ सीमाएं है जो जीनोम के क्षेत्रों के बारे में जांच की जा सकती है और वे तकनीकी विशेषज्ञता और उपकरण है कि सभी अनुसंधान समूहों के लिए उपलब्ध नहीं होगा की आवश्यकता है । इसलिए, चिप बहुतायत और सभी अनुसंधान epigenetics, क्रोमेटिन और जीनोमिक कार्यों के विनियमन में रुचि समूहों के लिए विविध स्थितियों के तहत citrullinated संशोधनों के वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक मूलभूत विधि बनी हुई है ।
यहाँ, हम PTMs में citrullinated क्रोमेटिन के वितरण की जाँच करने के लिए नवोदित खमीर मॉडल Saccharomyces cerevisiae (एस cerevisiae) का उपयोग चिप के लिए एक विधि का वर्णन. इस दृष्टिकोण खमीर में विकसित चिप प्रोटोकॉल के मुख्य घटकों के एक नंबर पर निर्भर करता है और भी विविध मॉडल सिस्टम12,13के लिए लागू किया । सेल में संशोधित histones और डीएनए के बीच बातचीत formaldehyde के साथ crosslinking द्वारा संरक्षित हैं । lysate तैयारी के बाद, क्रोमेटिन टुकड़े micrococcal nuclease के साथ पाचन द्वारा समान रूप से आकार के टुकड़ों में solubilized हैं । संशोधित histones के Immunoprecipitation या तो वाणिज्यिक या प्रयोगशाला जनित एंटीबॉडी और किसी भी जुड़े डीएनए के साथ किया जाता है अलग और विशेष रूप से जीनोमिक qPCR का उपयोग कर क्षेत्रों में संवर्धन के लिए विश्लेषण (चित्रा 1). कई citrullinated संशोधनों के लिए, इस प्रोटोकॉल से प्राप्त डीएनए की मात्रा qPCR द्वारा 25 से अधिक विभिन्न जीनोमिक loci के परीक्षण के लिए पर्याप्त है ।
इस चिप विधि अत्यधिक उत्परिवर्ती उपभेदों या पर्यावरणीय परिस्थितियों में एक एकल citrullinated संशोधन के वितरण की निगरानी के लिए उच्च बहुमुखी है, या जीनोमिक loci की एक संख्या में wildtype कोशिकाओं में कई citrullinated संशोधनों के परीक्षण के लिए । इसके अलावा, प्रोटोकॉल के कई घटक आसानी से या तो उच्च या नीच-प्रचुर citrullinated के निशान का पता लगाने का अनुकूलन करने के लिए समायोज्य रहे हैं । अंत में, नवोदित खमीर में संशोधित histones की चिप प्रदर्शन एंटीबॉडी विशिष्टता है कि अंय प्रणालियों में काफी हद तक उपलब्ध नहीं है के लिए महत्वपूर्ण नियंत्रण का उपयोग करने का अवसर प्रदान करता है । अर्थात्, खमीर उपभेदों उत्पंन किया जा सकता है कि citrullinated अवशेषों में ले बिंदु उत्परिवर्तनों कि संशोधन के लिए लक्षित कर रहे हैं, और, कुछ मामलों में, वहां केवल एक ही एंजाइम है कि एक विशेष citrullinated अवशेषों पर catalyzes संशोधन (उदाcitrullinated lysine methyltransferases) । इसलिए, चिप या तो citrullinated उत्परिवर्ती या एंजाइम विलोपन उपभेदों में किया जा सकता है परख हद तक जो गैर एंटीबॉडी के विशिष्ट बाध्यकारी होने और झूठी सकारात्मक परिणाम पैदा हो सकता है । इस नियंत्रण नव विकसित एंटीबॉडी के लिए विशेष रूप से मूल्यवान है, और यहां तक कि अंय प्रणालियों में उनके उपयोग करने से पहले citrullinated संशोधनों के संरक्षण के लिए एंटीबॉडी विशिष्टता को मांय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण एंटीबॉडी विशिष्टता है कि विभिंन संशोधन राज्यों (जैसे मोनो के रूप में भेद, di-और त्रि-मिथाइल), संशोधित पेप्टाइड्स की जांच arrays और histones के पश्चिमी दाग प्रदर्शन सहित के बीच अंतर का परीक्षण करने के लिए अंय तरीकों पूरक है या परिभाषित संशोधनों के साथ nucleosomes । कुल मिलाकर, नवोदित खमीर में चिप जीनोम और उनके विनियमन गवर्निंग तंत्र विदारक भर में citrullinated PTMs की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रक्रिया immunoprecipitation द्वारा खमीर कोशिकाओं में संशोधित histones के साथ जुड़े डीएनए के कुशल वसूली के लिए अनुमति देता है । यह qPCR द्वारा पीछा किया है जो स्थानीय संवर्धन या विशिष्ट citrullinated संशोधनों की कमी क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक सहायक विचार विमर्श के लिए ग्रीन लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को NIH पलाश R03AG052018 और R01GM124342 ने भाग में समर्थन दिया था E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3′-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
