כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.
היסטון שינויים post-translational (PTMs), כגון acetylation, מתילציה זרחון, מוסדרים באופן דינאמי על ידי סדרה של אנזימים להוסיף או להסיר את הסימנים האלו בתגובה לאותות שהתקבלו על-ידי התא. PTMS אלה אנו רותמים את ויסות תהליכים כגון בקרת ביטוי גנים ותיקון דנ א. Immunoprecipitation כרומטין (chIP) כבר גישה אינסטרומנטלית ניקוד את השפע ואת לוקליזציה של PTMs היסטון רבים ברחבי הגנום בתגובה לפליטת מגוונים אל התא. . הנה, מתוארת שיטה רב-תכליתי לביצוע שבב של שינויים היסטוניים post-translationally ששונה מ שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) . שיטה זו מתבססת על crosslinking של חלבונים ודנ א באמצעות טיפול פורמלדהיד שמרים תרבויות, דור של שמרים lysates מאת חרוז מכות, solubilization של כרומטין קטעים על ידי נוקלאז micrococcal, immunoprecipitation של היסטון-DNA מתחמי. DNA הקשורים עם הסימן היסטון עניין מטוהרים, שעבר ניתוח ה-PCR כמותי כדי להעריך את העשרת ב לוקוסים מרובות ברחבי הגנום. נציג ניסויים חיטוט הלוקליזציה של הסימנים היסטון H3K4me2, H4K16ac wildtype, שמרים מוטציה נידונות להפגין ניתוח נתונים ופרשנות. שיטה זו מתאימה למגוון רחב של היסטון PTMs ואת יכולה להתבצע עם זנים מוטציה או בנוכחות לחצים סביבתיים מגוונים, שהופך אותו כלי מצוין עבור חוקרים לשינויים כרומטין dynamics בתנאים שונים.
השינוי post-translational דינמי (PTM) של שינויים היסטוניים הוא מנגנון רגולטורי מפתח עבור תהליכים תבניות DNA רבים, כולל תמלול, שכפול ה-DNA תיקון1,2. היכולת לקבוע את השפע ואת לוקליזציה מדויק של שינויים היסטוניים ששונה והמצוות בתהליכים אלה ולכן קריטי להבנת שלהם תקנה בתנאים שונים בתא. הפיתוח של כרומטין immunoprecipitation (chIP) כשיטה בעיקר נבעה מחקרים ביוכימיים של האינטראקציות של חלבונים עם ה-DNA, במיוחד במבחנה שיטות שימוש crosslinkers כימיים, בשילוב עם הצורך להעריך באופי הדינמי של חלבון-DNA אינטראקציות ויוו ועל אזורים ספציפיים של גנום3,4,5. קידום של ה-PCR כמותי (qPCR), טכנולוגיות רצף התרחב גם את היכולת לבצע ניסויים שבב עם השוואות כמותיים ועל -פני כל הגנום, שהופך אותו לכלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות חלבון-דנ א- רמות מרובות.
כיום, השבב הוא שיטה נדרש עבור כל קבוצת המחקר מתעניין בתיווך כרומטין רגולציה של הגנום כפי ישנן שיטות דומות לא ישירות חוקר את הקשר הפיזי בין של היסטון ששונה מסוים גנומית לוקוס ב ויוו. למרות וריאציות של שיטה זו באמצעות רצף הדור הבא כדי למפות היסטון שינויים בכל רחבי הגנום6,7 זמינים, גישות אלה רשאי לפנות שאלות מדעיות שונות, קנה המידה שלהם, עלות והגבלת משאבים טכניים עלולה להיות לכמה קבוצות מחקר. בנוסף, יישוב שבב-qPCR יש צורך להשלים את אלה גישות על-ידי מתן שתי שיטות לייעל את פרוטוקול שבב לפני רצף וכדי לאמת תוצאות epigenomic datasets. ספקטרומטר מסה גישות מבוססות על זיהוי מגוון היסטון סימנים הקשורים עם אזורים גנומית יש גם הופיעו8,9,10,11, עם זאת, אלה גישות יש כמה מגבלות לגבי אשר אזורים בגנום פתור והן דורשות מומחיות טכנית ומכשור לא יהיה זמין כל קבוצות מחקר. לכן, שבב נשאר שיטה למעין לניתוח את השפע ואת ההפצה של היסטון שינויים בתנאים מגוונים עבור כל קבוצות מחקר אפיגנטיקה, כרומטין, ברגולציה של פונקציות גנומית.
כאן, אנו מתארים שיטה עבור השבב באמצעות שמרים ניצני דגם האפייה (cerevisiae ס) לחקור את ההפצה של היסטון PTMs-כרומטין. גישה זו נסמכת על מספר רכיבים מרכזיים של פרוטוקולים השבב פותח שמרים וחלים גם מודל מגוון מערכות12,13. אינטראקציות בין שינויים היסטוניים שונה ל- DNA בתא נשמרים על ידי crosslinking עם פורמלין. בעקבות הכנה lysate, שברי כרומטין solubilized לחלקים בגודל אחיד על ידי עיכול עם נוקלאז micrococcal. Immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מתבצע באמצעות נוגדנים או מסחרי או שנוצרו על-ידי מעבדה, אנ-איי הוא מבודד וניתח העשרה על אזורים מסוימים גנומית באמצעות qPCR (איור 1). עבור שינויים רבים היסטון, כמות ה-DNA המתקבל פרוטוקול זה מספיקה לבדיקה יותר מ 25 לוקוסים גנומית שונים על ידי qPCR.
שיטה זו שבב היא רב תכליתי עבור ניטור ההתפלגות של שינוי היסטון יחיד על-פני מספר זנים מוטציה או תנאים סביבתיים, או לבדיקת שינויים מרובים היסטון בתאים wildtype במספר רב של לוקוסים גנומית. יתר על כן, רכיבים רבים של הפרוטוקול הם מתכוונן בקלות כדי למטב את זיהוי סימני מאוד – או נחות-בשפע גם היסטון. בסופו של דבר, מבצע שבב של שינויים היסטוניים ששונה ניצני שמרים מספק את ההזדמנות לשימוש בפקדים מפתח נוגדנים ירידה לפרטים שאינם זמינים בעיקר במערכות אחרות. כלומר, זני שמרים ניתן להפיק שנושאים מוטציות נקודה ב שאריות היסטון זה מיועדים להחלת השינוי, במקרים מסוימים, יש רק אנזים יחיד זה מזרז את השינוי על משקע היסטון מסוים (למשל-היסטון ליזין methyltransferases). לכן, שבב יכול להתבצע גם היסטון מוטציה או אנזים מחיקה זנים כדי assay במידה שאליו שאינם ספציפיים קשירה של הנוגדן עשוי להיות המתרחשים ותפיק תוצאות חיוביות שגויות. פקד זה חשובה במיוחד עבור פיתח נוגדנים, אפילו יכול לשמש כדי לאמת ירידה לפרטים נוגדנים עבור השינויים שנשמרת היסטון לפני השימוש במערכות אחרות. גישה זו משלימה שיטות אחרות כדי לבדוק נוגדנים ירידה לפרטים להבחין בין מדינות שונות שינוי (כגון מונו-, די – tri-מתילציה), לרבות חקירת מערכים של פפטידים ששונה וביצוע שהכלים המערבי של שינויים היסטוניים או נוקליאוזומים עם שינויים מוגדר. בסך הכל, לשבב ניצני שמרים היא שיטה חזקה עבור הערכת את הדינמיקה של היסטון PTMs ברחבי הגנום, לנתח את המנגנונים השולטים שלהם.
ההליך המתואר כאן מאפשר התאוששות יעיל של DNA המשויכים ששונה שינויים היסטוניים בתאים שמרים על-ידי immunoprecipitation. זה מלווה qPCR באמצעות תחל אשר להגביר את האזורים עניין לקבוע העשרה המקומיים או דלדול של שינויים ספציפיים היסטון. למרות מפותח כשיטה לפני כמעט 20 שנה, שבב עדיין וזמינותו המכונן על חקירת מצב…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להודות חברי המעבדה ירוק לדיונים מועיל. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים NIH R03AG052018 ו- R01GM124342 כדי E.M.G.
Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
Tris | Amresco | 0497-5KG | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
α H3 | Abcam | ab1791 | |
α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |