Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) af Histon ændringer fra Saccharomyces cerevisiae
Summary
Her, beskriver vi en protokol for kromatin immunoprecipitation af modificerede histoner fra spirende gær Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA er efterfølgende anvendes til kvantitativ PCR afhøre overflod og lokalisering af Histon posttranslationelle ændringer i genomet.
Abstract
Histon posttranslationelle modifikationer (PTMs), som acetylation, methylering og fosforylering, er dynamisk reguleret af en række enzymer, tilføje eller fjerne disse mærker som reaktion på signaler modtages af cellen. Disse PTMS er vigtige bidragydere til regulering af processer såsom gen expression kontrol og reparation af DNA. Kromatin immunoprecipitation (chIP) har været en medvirkende tilgang til dissekere overflod og lokalisering af mange Histon PTMs hele genom som svar på forskellige perturbationer til cellen. Her, er en alsidig metode til at udføre chIP af post-translationally modificerede histoner fra spirende gær Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) beskrevet. Denne metode bygger på crosslinking af proteiner og DNA ved hjælp af formaldehyd behandling af gær kulturer, generation af gær lysates af perle slå, oploesning af kromatin fragmenter af micrococcal nukleasen, og immunoprecipitation af Histon-DNA komplekser. DNA forbindelse med Histon mærke af interesse er renset og udsættes for kvantitativ PCR analyse til at vurdere dets berigelse på flere loci i hele genomet. Repræsentative eksperimenter sondering lokalisering af Histon varemærker H3K4me2 og H4K16ac i vildtype og mutant gær diskuteres for at vise dataanalyse og fortolkning. Denne metode er velegnet til en bred vifte af Histon PTMs og kan udføres med forskellige mutantstammen eller tilstedeværelse af forskellige miljøbelastninger, hvilket gør det et fremragende værktøj for at undersøge ændringer i kromatin dynamics under forskellige betingelser.
Introduction
Den dynamiske posttranslationel modifikation (PTM) af histonerne er en nøglen reguleringsmekanisme for mange DNA-skabelonbaserede processer, herunder transskription, replikering og DNA reparation1,2. Evnen til at bestemme den overflod og præcise lokalisering af modificerede histoner samtidig med disse processer er derfor afgørende for at forstå deres forordning under forskellige betingelser i cellen. Udviklingen af kromatin immunoprecipitation (chIP) som en metode i stor udstrækning skyldtes biokemiske undersøgelser af vekselvirkninger mellem proteiner og DNA, især in vitro- metoder ved hjælp af kemiske overfladebehandlingsvæsker, kombineret med behovet for at evaluere de dynamiske karakter af protein-DNA interaktioner i vivo og på bestemte områder af genomet3,4,5. Fremme af kvantitativ PCR (qPCR) og sekventering teknologier har også udvidet mulighed for at udføre chIP eksperimenter med kvantitative sammenligninger og på tværs af hele genomer, hvilket gør det et stærkt værktøj til dissekere DNA-protein interaktioner på flere niveauer.
I øjeblikket, er chIP en ønskede metode for enhver interesseret i kromatin-medieret regulering af genomet forskergruppe, som der er ingen sammenlignelige metoder for direkte afhøre den fysiske forbindelse mellem en modificeret Histon og en specifik genomisk locus i vivo. Selv om variationer af denne metode, ved hjælp af næste generation sequencing for at kortlægge Histon ændringer i hele genom6,7 er til rådighed, kan disse tilgange behandle forskellige videnskabelige spørgsmål og deres omfang, omkostninger og tekniske ressourcer kan være begrænsende for nogle forskningsgrupper. Derudover målrettede chIP-qPCR er nødvendigt at supplere disse tilgange ved at udvikle metoder til både optimere chIP protokollen før sekvensering og at validere resultater fra epigenomiske datasæt. Massespektrometri baserede tilgange for at identificere fuldtallige af Histon marks tilknyttet genomisk regioner har også opstået8,9,10,11, men disse tilgange har nogle begrænsninger med hensyn til hvilke områder af genomet kan være aftestede og de kræver teknisk ekspertise og instrumentering, der ikke vil være tilgængelige for alle forskergrupper. Derfor forbliver chIP en foundational metode til at analysere overflod og distribution af Histon ændringer under forskellige betingelser for alle forskergrupper interesse for Epigenetik, kromatin og regulering af genomisk funktioner.
Her, beskriver vi en metode for chIP ved hjælp af den spirende gær model Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) for at undersøge fordelingen af Histon PTMs på kromatin. Denne tilgang bygger på en række centrale elementer i chIP protokoller udviklet i gær og også anvendt til forskellige model systemer12,13. Interaktioner mellem modificerede histonerne og DNA i cellen er bevaret af crosslinking med formaldehyd. Efter lysate forberedelse, kromatin fragmenter er oploeses i ensartet størrelse fragmenter af fordøjelse med micrococcal nukleasen. Immunoprecipitation af de modificerede histoner er udført med antistoffer, kommercielle eller lab-genereret og eventuelle tilknyttede DNA er isoleret og analyseres for berigelse på særlige genomisk områder ved hjælp af qPCR (figur 1). For mange Histon ændringer er mængde af DNA fra denne protokol tilstrækkelige til at teste mere end 25 forskellige genomisk loci af qPCR.
Denne chIP metode er meget alsidige for overvågning fordelingen af en enkelt Histon ændring på tværs af flere mutantstammen eller miljømæssige forhold eller til at teste flere Histon ændringer i vildtype celler på en række af genomisk loci. Adskillige komponenter af protokollen er desuden let justerbare til at optimere påvisning af enten meget – eller ringe-rigelige Histon mærker. Endelig giver udfører chIP af modificerede histoner i spirende gær mulighed for at bruge centrale kontroller for antistof specificitet, der er stort set utilgængelige i andre systemer. Nemlig gærstammer kan genereres der bære punktmutationer i Histon restkoncentrationer, der er målrettet til ændring, og i nogle tilfælde er der kun en enkelt enzym, der katalyserer ændring på en bestemt Histon rester (fx. Histon lysin methyltransferases). ChIP kan derfor udføres i enten af Histon mutant eller enzym sletning stammer til assay i omfang som ikke-specifik binding af antistoffet kan forekommende og generere falske positive resultater. Dette kontrolelement er særligt værdifulde for nyligt udviklet antistoffer, og kan endda bruges til at validere antistof specificitet for bevarede Histon ændringer forud for deres anvendelse i andre systemer. Denne tilgang supplerer andre metoder til at teste antistof specificitet, at skelne mellem forskellige ændring stater (som mono-, di- og tri-methylering), herunder sondering arrays af modificerede peptider og udføre western blotting af histonerne eller nucleosomes med defineret ændringer. Samlet set er chIP i spirende gær en kraftfuld metode til vurdering af dynamikken i Histon PTMs hele genomet og dissekere de mekanismer, der regulerer deres regulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proceduren beskrevet her giver mulighed for effektiv inddrivelse af DNA forbundet med modificerede histoner i gærceller af immunoprecipitation. Dette er efterfulgt af qPCR ved hjælp af primere, som forstærker regioner af interesse at fastslå lokale berigelse eller udtynding af specifikke Histon ændringer. ChIP til trods udvikles som en metode næsten 20 år siden, stadig den definerende analyse for at undersøge Histon ændring status på forskellige genomisk regioner og forskellige vilkår. Selv om chIP koblet til …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af de grønne lab til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet i en del af NIH tilskud R03AG052018 og R01GM124342 til E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3′-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
