Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Saccharomyces cerevisiae से citrullinated संशोधनों की क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप)

Published: December 29, 2017 doi: 10.3791/57080
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Maryland

Summary

यहां, हम नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeसे संशोधित histones के क्रोमेटिन immunoprecipitation के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । Immunoprecipitated डीएनए बाद में मात्रात्मक पीसीआर के लिए प्रयोग किया जाता है बहुतायत और citrullinated पद के जीनोम भर में अनुवाद संशोधनों के स्थानीयकरण पूछताछ ।

Abstract

citrullinated पोस्ट-शोधों में संशोधन (PTMs), जैसे acetylation, मिथाइल और फास्फारिलीकरण, एंजाइमों की एक श्रृंखला द्वारा गतिशील रूप से विनियमित होते हैं जो सेल द्वारा प्राप्त संकेतों के जवाब में इन चिह्नों को जोड़ते या निकालते हैं. इन PTMS जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण और डीएनए की मरंमत के रूप में प्रक्रियाओं के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) की बहुतायत और कई citrullinated PTMs के स्थानीयकरण के लिए सेल के विविध perturbations के जवाब में जीनोम भर में एक वाद्य दृष्टिकोण रहा है । यहाँ, नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae (एस cerevisiae) से अनुवाद के बाद संशोधित histones चिप के प्रदर्शन के लिए एक बहुमुखी विधि का वर्णन किया गया है । इस विधि से प्रोटीन और डीएनए के crosslinking पर निर्भर करता है खमीर संस्कृतियों के formaldehyde उपचार का उपयोग, मनका पिटाई से खमीर lysates की पीढ़ी, क्रोमेटिन micrococcal द्वारा nuclease टुकड़े के solubilization, और immunoprecipitation के citrullinated-डीएनए परिसरों. डीएनए ब्याज की citrullinated निशान के साथ जुड़े शुद्ध और मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण करने के लिए जीनोम भर में कई loci पर अपने संवर्धन मूल्यांकन के अधीन है । प्रतिनिधि प्रयोगों citrullinated मार्क्स H3K4me2 और wildtype और उत्परिवर्ती खमीर में H4K16ac के स्थानीयकरण की जांच डेटा विश्लेषण और व्याख्या प्रदर्शित करने के लिए चर्चा कर रहे हैं । इस विधि citrullinated PTMs की एक किस्म के लिए उपयुक्त है और विभिन्न उत्परिवर्ती उपभेदों के साथ या विविध पर्यावरणीय तनावों की उपस्थिति में किया जा सकता है, यह विभिन्न स्थितियों के तहत क्रोमेटिन गतिशीलता में परिवर्तन की जाँच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बना रही है.

Introduction

गतिशील पोस्ट-शोधों संशोधन (PTM) histones के कई डीएनए-टेम्पलेट प्रक्रियाओं, प्रतिलेखन, प्रतिकृति और डीएनए की मरम्मत1,2सहित के लिए एक महत्वपूर्ण नियामक तंत्र है । इन प्रक्रियाओं के साथ सहवर्ती संशोधित histones की बहुतायत और सटीक स्थानीयकरण निर्धारित करने की क्षमता इसलिए सेल में विभिन्न परिस्थितियों में उनके विनियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के विकास के एक विधि के रूप में मोटे तौर पर डीएनए के साथ प्रोटीन की बातचीत के जैव रासायनिक अध्ययन से उपजी, विशेष रूप से इन विट्रो तरीकों रासायनिक crosslinkers का उपयोग कर, मूल्यांकन की आवश्यकता के साथ युग्मित प्रोटीन की गतिशील प्रकृति vivo में डीएनए बातचीत और जीनोम3,4,5के विशिष्ट क्षेत्रों में । मात्रात्मक पीसीआर की उंनति (qPCR) और अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों भी मात्रात्मक तुलना और पूरे जीनोम के साथ चिप प्रयोगों प्रदर्शन करने की क्षमता का विस्तार किया गया है, यह डीएनए विच्छेदन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाने में प्रोटीन बातचीत कई स्तरों ।

वर्तमान में, चिप किसी भी अनुसंधान क्रोमेटिन में रुचि समूह के जीनोम के मध्यस्थता विनियमन के लिए एक आवश्यक तरीका है के रूप में वहां सीधे एक संशोधित citrullinated और एक विशिष्ट जीनोमिक लोकस के बीच शारीरिक लिंक पूछताछ के लिए कोई तुलनीय तरीके हैं vivo. हालांकि इस विधि के रूपांतरों के जीनोम6भर में citrullinated संशोधनों नक्शा करने के लिए अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर,7 उपलब्ध हैं, इन दृष्टिकोण अलग वैज्ञानिक प्रश्नों और उनके पैमाने पर पता कर सकते हैं, लागत और तकनीकी संसाधनों कुछ अनुसंधान समूहों के लिए सीमित हो सकता है । इसके अतिरिक्त, लक्षित चिप-qPCR दोनों के लिए विधियों प्रदान करके इन तरीकों को पूरक करने के लिए आवश्यक है अनुक्रमण करने से पहले चिप प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़ करने के लिए और epigenomic डेटासेट से परिणाम को मान्य करने के लिए. जीनोमिक क्षेत्रों से जुड़े citrullinated चिह्नों के पूर्ण पूरक की पहचान के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित दृष्टिकोण भी8,9,10,11उभरे हैं, तथापि, ये दृष्टिकोण कुछ सीमाएं है जो जीनोम के क्षेत्रों के बारे में जांच की जा सकती है और वे तकनीकी विशेषज्ञता और उपकरण है कि सभी अनुसंधान समूहों के लिए उपलब्ध नहीं होगा की आवश्यकता है । इसलिए, चिप बहुतायत और सभी अनुसंधान epigenetics, क्रोमेटिन और जीनोमिक कार्यों के विनियमन में रुचि समूहों के लिए विविध स्थितियों के तहत citrullinated संशोधनों के वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक मूलभूत विधि बनी हुई है ।

यहाँ, हम PTMs में citrullinated क्रोमेटिन के वितरण की जाँच करने के लिए नवोदित खमीर मॉडल Saccharomyces cerevisiae (एस cerevisiae) का उपयोग चिप के लिए एक विधि का वर्णन. इस दृष्टिकोण खमीर में विकसित चिप प्रोटोकॉल के मुख्य घटकों के एक नंबर पर निर्भर करता है और भी विविध मॉडल सिस्टम12,13के लिए लागू किया । सेल में संशोधित histones और डीएनए के बीच बातचीत formaldehyde के साथ crosslinking द्वारा संरक्षित हैं । lysate तैयारी के बाद, क्रोमेटिन टुकड़े micrococcal nuclease के साथ पाचन द्वारा समान रूप से आकार के टुकड़ों में solubilized हैं । संशोधित histones के Immunoprecipitation या तो वाणिज्यिक या प्रयोगशाला जनित एंटीबॉडी और किसी भी जुड़े डीएनए के साथ किया जाता है अलग और विशेष रूप से जीनोमिक qPCR का उपयोग कर क्षेत्रों में संवर्धन के लिए विश्लेषण (चित्रा 1). कई citrullinated संशोधनों के लिए, इस प्रोटोकॉल से प्राप्त डीएनए की मात्रा qPCR द्वारा 25 से अधिक विभिन्न जीनोमिक loci के परीक्षण के लिए पर्याप्त है ।

इस चिप विधि अत्यधिक उत्परिवर्ती उपभेदों या पर्यावरणीय परिस्थितियों में एक एकल citrullinated संशोधन के वितरण की निगरानी के लिए उच्च बहुमुखी है, या जीनोमिक loci की एक संख्या में wildtype कोशिकाओं में कई citrullinated संशोधनों के परीक्षण के लिए । इसके अलावा, प्रोटोकॉल के कई घटक आसानी से या तो उच्च या नीच-प्रचुर citrullinated के निशान का पता लगाने का अनुकूलन करने के लिए समायोज्य रहे हैं । अंत में, नवोदित खमीर में संशोधित histones की चिप प्रदर्शन एंटीबॉडी विशिष्टता है कि अंय प्रणालियों में काफी हद तक उपलब्ध नहीं है के लिए महत्वपूर्ण नियंत्रण का उपयोग करने का अवसर प्रदान करता है । अर्थात्, खमीर उपभेदों उत्पंन किया जा सकता है कि citrullinated अवशेषों में ले बिंदु उत्परिवर्तनों कि संशोधन के लिए लक्षित कर रहे हैं, और, कुछ मामलों में, वहां केवल एक ही एंजाइम है कि एक विशेष citrullinated अवशेषों पर catalyzes संशोधन (उदाcitrullinated lysine methyltransferases) । इसलिए, चिप या तो citrullinated उत्परिवर्ती या एंजाइम विलोपन उपभेदों में किया जा सकता है परख हद तक जो गैर एंटीबॉडी के विशिष्ट बाध्यकारी होने और झूठी सकारात्मक परिणाम पैदा हो सकता है । इस नियंत्रण नव विकसित एंटीबॉडी के लिए विशेष रूप से मूल्यवान है, और यहां तक कि अंय प्रणालियों में उनके उपयोग करने से पहले citrullinated संशोधनों के संरक्षण के लिए एंटीबॉडी विशिष्टता को मांय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण एंटीबॉडी विशिष्टता है कि विभिंन संशोधन राज्यों (जैसे मोनो के रूप में भेद, di-और त्रि-मिथाइल), संशोधित पेप्टाइड्स की जांच arrays और histones के पश्चिमी दाग प्रदर्शन सहित के बीच अंतर का परीक्षण करने के लिए अंय तरीकों पूरक है या परिभाषित संशोधनों के साथ nucleosomes । कुल मिलाकर, नवोदित खमीर में चिप जीनोम और उनके विनियमन गवर्निंग तंत्र विदारक भर में citrullinated PTMs की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. चुंबकीय मोतियों को पूर्व बाँध एंटीबॉडी

  1. मिश्रण प्रोटीन a/जी चुंबकीय मोती अच्छी तरह से और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक immunoprecipitation (आईपी) नमूना प्रति चुंबकीय मोतियों की 20 µ एल हस्तांतरण ।
    नोट: जब pipetting मोती, व्यापक बोर, कम प्रतिधारण सुझावों का उपयोग करें ।
  2. एक चुंबकीय खड़े में मोतियों के साथ ट्यूब प्लेस और मोती ट्यूब के पक्ष पर इकट्ठा करने के लिए अनुमति देते हैं । supernatant निकालें ।
  3. 3 बार ठंडे Tris-बफर खारा (टीबीएस) (५० mm Tris-HCl pH ७.५, १५० mm NaCl) के 1 मिलीलीटर के साथ मोतियों को धो लें ।
  4. टीबीएस के मोतियों और उचित मात्रा में एंटीबॉडी के २०० µ l को जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 8 rpm पर घुमाएं ।
    नोट: कई citrullinated PTM एंटीबॉडी के लिए, 1-3 आईपी प्रति एंटीबॉडी के µ जी पर्याप्त है । हालांकि, अनुमापन प्रयोगों उचित सांद्रता निर्धारित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । अच्छी तरह से विशेषता के लिए अनुशंसित सांद्रता, वाणिज्यिक citrullinated PTM एंटीबॉडी अक्सर सटीक रहे हैं और प्रकाशित रिपोर्टों या उत्पाद साहित्य में पाया जा सकता है.
  5. मोतियों को एक चुंबकीय स्टैंड में रखें और supernatant को हटा दें । टीबीएस की 1 मिलीलीटर के साथ उंहें धो लें ।
  6. टीबीएस के (pipetting त्रुटि के मामले में) आईपी नमूना प्लस एक अतिरिक्त 5 µ एल प्रति टीबीएस के 20 µ एल में मोतियों reसस्पेंड ।
    नोट: मोतियों का उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. बढ़ने खमीर कोशिकाओं

  1. लगाना YPD के 10 मिलीलीटर (10% खमीर निकालने, 20% peptone और 20% डेक्सट्रोज) उपयुक्त तनाव के एक एकल कॉलोनी के साथ और यह 30 डिग्री सेल्सियस पर २२० rpm में एक मिलाना मशीन में रातोंरात बढ़ती ।
  2. एक spectrophotometer का उपयोग खमीर संस्कृति के ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने । एक नई कुप्पी में १०० मिलीलीटर YPD में एक आयुध डिपो६०० = ०.२ के लिए संस्कृति को पतला ।
  3. २२० rpm पर एक मिलाते हुए मशीन में 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ने जब तक वे मध्य लॉग चरण (आयुध डिपो६०० = 0.6-0.8) तक पहुंचने ।

3. डीएनए को प्रोटीन के Vivo Crosslinking में

  1. जब संस्कृतियों मध्य लॉग चरण तक पहुंचने, 1% formaldehyde के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ३७% formaldehyde के सीधे माध्यम से २.७ मिलीलीटर जोड़ें । 25 डिग्री सेल्सियस (या कमरे के तापमान) में एक शेखर के लिए कुप्पी स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए ५० rpm पर इसे हिला ।
  2. मध्यम करने के लिए २.५ मीटर glycine के 5 मिलीलीटर जोड़ें और formaldehyde बुझाने के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ५० rpm पर मिलाते हुए जारी है ।
  3. कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए बोतलों केंद्रापसारक और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५८०० x g पर कोशिकाओं स्पिन । खिचड़ी supernatant ।
    1. ठंडे टीबीएस के ४५ मिलीलीटर में उन्हें reसस्पैंड करके कोशिकाओं को धो लें और निलंबन को ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए २८०० x g पर ट्यूब स्पिन । supernatant निकालें ।
    2. ठंडा चिप Lysis बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं धो (५० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, १५० मिमी NaCl, 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 1% nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (एनपी-४०), 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित) ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए २८०० x g पर कोशिकाओं स्पिन । supernatant निकालें ।
      नोट: कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन के साथ जमे हुए किया जा सकता है और आगे प्रसंस्करण तक-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।

4. बनाएं खमीर Lysates

  1. 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) और 1 के साथ ठंड चिप Lysis बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड: खमीर के लिए 1000 कमजोर पड़ने को छेड़ो संकोची कॉकटेल । एक २.० एमएल पेंच टोपी ट्यूब कांच मोतियों की २०० µ एल युक्त करने के लिए निलंबन स्थानांतरण ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस और मनका पर उच्च गति आंदोलन के लिए एक मनका धड़कन उपकरण के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरित 30 एस प्रत्येक के लिए 6 बार हराया । बर्फ पर प्रत्येक मनका धड़कन के बीच कम 1 मिनट के लिए कोशिकाओं रखो ।
  3. जेल लोड हो रहा है युक्तियां का उपयोग कर एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए lysate स्थानांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १५,५०० x g पर lysate केंद्रापसारक ।
  4. supernatant त्यागें और २५० µ एल में गोली reसस्पेंड MNase पाचन बफर की (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, 10 मिमी NaCl, 3 मिमी MgCl2, 21 मिमी CaCl2, 1% NP-४०, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) धीरे pipetting ऊपर और नीचे से.
  5. प्रतिक्रियाओं को MNase के २.५ µ एल जोड़ें । उंहें 4-6 बार पलटने से धीरे मिश्रण और तुरंत 20 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी के स्नान में यह मशीन ।
    नोट: MNase का एक नया स्टॉक उपयोग किया जाता है जब डाइजेस्ट शर्तों अनुकूलित किया जाना चाहिए । प्रोटोकॉल के लिए चरण 10 देखें ।
  6. तुरंत बर्फ पर ट्यूबों जगह प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और 10 मिमी EDTA के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ०.५ मीटर EDTA के 5 µ एल जोड़ें । उंहें धीरे उलटा द्वारा मिश्रण ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १५,५०० x g पर प्रतिक्रिया केंद्रापसारक और एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
    नोट: घुलनशील (पचता) क्रोमेटिन supernatant में होगा । गोली अपच और अघुलनशील कोशिका मलबे कुछ भी शामिल है ।

5. Immunoprecipitate (IP) संशोधित Histones

  1. प्रत्येक MNase के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण-क्रोमेटिन एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग अंश जारी किया । प्रत्येक प्रोटीन नमूने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए 8 डिस्पोजेबल cuvettes प्लस 1 अतिरिक्त cuvette में से प्रत्येक के लिए ब्रैडफोर्ड रिएजेंट के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    1. 2 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) का एक शेयर समाधान तैयार करें ।
    2. ब्रैडफोर्ड रिएजेंट के 1 मिलीलीटर में BSA के निम्नलिखित सांद्रता प्राप्त करने के लिए उपयुक्त मात्रा जोड़ें: 0 μg/एमएल, ०.५ μg/एमएल, 1 μg/एमएल, 2 μg/एमएल, 4 μg/एमएल, 6 μg/एमएल, 8 μg/एमएल और 10 μg/एमएल । अतिरिक्त cuvettes के लिए MNase-जारी क्रोमेटिन अंश के 2 μL जोड़ें ।
    3. parafilm का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ प्रत्येक cuvette के शीर्ष कवर और cuvettes 4-6 बार पलटने के लिए हल अच्छी तरह से मिश्रण । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर cuvettes की मशीन ।
    4. एक दृश्य प्रकाश spectrophotometer का प्रयोग, मानक वक्र और प्रयोगात्मक नमूनों के लिए ५९५ एनएम पर अवशोषक उपाय ।
      नोट: पहले माप लेने से पहले spectrophotometer को रिक् त करने के लिए BSA (0 μg/एमएल) के बिना cuvette का प्रयोग करें ।
    5. साजिश एक मानक वक्र spectrophotometer या स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर पर BSA के विभिंन सांद्रता के लिए अवशोषक मूल्यों का उपयोग कर । मानक वक्र और (1:500) इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने कारक के आधार पर, क्रोमेटिन अंश नमूनों में से प्रत्येक के लिए प्रोटीन एकाग्रता की गणना करने के लिए अवशोषक मूल्यों का उपयोग करें ।
  2. प्रत्येक IP के लिए, ५० µ g को MNase-रिलीज़ किए गए क्रोमेटिन अंश से चिप Lysis बफ़र से 1 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए जोड़ें ।
    नोट: यदि lysate प्रति एक से अधिक आईपी की स्थापना, lysate और चिप Lysis बफर और आईपी के लिए व्यक्तिगत ट्यूबों के लिए aliquot 1 मिलीलीटर का एक मास्टर मिश्रण बनाते हैं ।
  3. आईपी मिश्रण से १०० µ एल निकालें इनपुट नमूना के रूप में प्रक्रिया करने के लिए । इनपुट नमूना पर-20 ° c चरण ७.१ तक फ़्रीज़ ।
    नोट: किसी भी शेष क्रोमेटिन नमूना भी पर जम सकता है-20 ° c और एक बाद आईपी अगर वांछित के लिए इस्तेमाल किया ।
  4. चुंबकीय प्रोटीन के 20 µ एल जोड़ें एक/जी मोती पूर्व प्रत्येक आईपी नमूने को एंटीबॉडी के साथ बंधे ।
3 घंटे के लिए 8 rpm पर नमूना घुमाएँ (मानक) या रात भर (यदि पसंदीदा) 4 डिग्री सेल्सियस पर ।

6. धो आईपीएस और Elute citrullinated-डीएनए परिसरों

  1. एक चुंबकीय स्टैंड में ट्यूबों प्लेस और मोती ट्यूब के पक्ष पर इकट्ठा करते हैं । किसी पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें । नीचे के प्रत्येक बफ़र्स के 1 मिलीलीटर के साथ मोती क्रमिक धो लें ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 8 rpm पर घूर्णन द्वारा प्रत्येक धोने प्रदर्शन, एक चुंबकीय स्टैंड में मोती रखने, supernatant हटाने, और अगले बफर जोड़ने: 2x-चिप Lysis बफर, 2x उच्च नमक धोने बफर (५० mm Tris-एचसीएल पीएच ७.५, ५०० मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA , 1% NP-४०, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित), 1x LiCl/डिटर्जेंट धोने बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, २५० मिमी LiCl, 1 मिमी EDTA, 1% NP-४०, 1% सोडियम deoxycholate, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित), 1x-ते (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, 1 मिमी EDTA, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत), और 1x-ते ।
    2. अंतिम ते धोने के साथ, एक नई ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण मोती का उपयोग करने के लिए मोती के अधिकांश हस्तांतरण, तो एक और ०.५ मिलीलीटर ते धोने के लिए ट्यूब और शेष मोतियों का हस्तांतरण करने के लिए ।
  2. हौसले से बने चिप रेफरेंस बफर के २५० µ एल जोड़ें (1% एसडीएस, 1 mM NaHCO3) । समाधान संक्षेप में भंवर । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 8 rpm पर नमूने घुमाएं ।
  3. एक चुंबकीय खड़े में ट्यूब प्लेस और मोतियों को इकट्ठा । ध्यान से एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण और मोतियों से बचने ।
    नोट: eluate में immunoprecipitated प्रोटीन और जुड़े डीएनए होते हैं ।
  4. मोतियों को चिप रेफरेंस बफर की एक और २५० µ एल जोड़ें । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 8 rpm पर नमूने घुमाएं ।
  5. ध्यान से supernatant को पहले रेफरेंस से युक्त ट्यूब पर ट्रांसफर कर लें । यदि आवश्यक हो, सभी आईपीएस के लिए एक छोटी मात्रा (२४० µ एल) निकालें मोतियों को परेशान करने से बचने के लिए ।

7. रिवर्स प्रोटीन-DNA Crosslinks

  1. गल इनपुट नमूने और प्रत्येक इनपुट के लिए चिप रेफरेंस बफर के ४०० µ एल जोड़ें ।
  2. इनपुट और आईपी दोनों नमूनों के लिए, 5 एम NaCl के 20 µ एल, 20 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइकोजन के 5 µ एल, और 20 मिलीग्राम/एमएल µ K के १२.५ Proteinase एल जोड़ें । पलटना या झाड़ने ट्यूबों द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । एक ६५ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान रातोंरात में नमूनों की मशीन ।

8. शुद्ध और ध्यान केंद्रित डीएनए

  1. इनपुट और आईपी नमूनों के लिए मिलीग्राम/एमएल RNase के 10 µ एल जोड़ें । 30 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में नमूनों की मशीन ।
  2. जोड़ें ६०० µ एल के phenol: chlorofrom: isoamyl अल्कोहल (25:24:1 पीसीआई) जलीय समाधान करने के लिए और उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण. उंहें कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १५,५०० x g पर स्पिन ।
    1. एक नई ट्यूब के लिए जलीय परत निकालें । पीसीआई के ६०० µ एल जोड़ें और उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १५,५०० x g पर ट्यूब स्पिन । एक नई ट्यूब के लिए जलीय परत स्थानांतरण ।
      चेतावनी: धुआं हुड में काम करते हैं और PCI के साथ काम करते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनते हैं । संस्थागत दिशा निर्देशों द्वारा निर्देश के रूप में तरल और ठोस अपशिष्ट निपटान ।
  3. डीएनए को तेज़ करने के लिए 3m सोडियम एसीटेट की 0.1 x मात्रा और ठंड १००% इथेनॉल की 1 मिलीलीटर जोड़ें । ट्यूब पलटना 4-6 बार हल अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । -20 डिग्री सेल्सियस रात भर में मशीन ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १५,५०० x g पर ट्यूब स्पिन । सावधानी से supernatant को पिपेट से हटा दें ।
    2. ठंडा ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में गोली धो लो । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १५,५०० x g पर स्पिन । सावधानी से supernatant को पिपेट से हटा दें ।
    3. हवा-लगभग 20 मिनट के लिए डाकू में छर्रों सूखी (पूरी तरह से शुष्क तक) । nuclease-नि: शुल्क पानी की ५० µ एल में आईपी नमूने reसस्पेंड और nuclease मुक्त पानी की १०० µ एल में इनपुट नमूनों reसस्पेंड । qPCR प्रदर्शन तक-20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए नमूनों की दुकान ।

9. मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) समृद्ध जीनोमिक क्षेत्रों का पता लगाने के लिए

  1. प्राइमरों के प्रत्येक सेट के लिए एक qPCR मास्टर मिश्रण बनाओ । एक प्रतिक्रिया 2x qPCR मिश्रण के 5 µ एल, 20 µ एम फॉरवर्ड प्राइमर के ०.२५ µ एल, और 20 µ मीटर रिवर्स प्राइमर के ०.२५ µ एल शामिल हैं ।
    नोट: उचित प्राइमर डिजाइन और qPCR प्रयोगों के लिए परीक्षण कहीं14,15,16वर्णित हैं ।
  2. डीएनए मास्टर प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए घोला जा सकता है बनाओ । एक प्रतिक्रिया डीएनए के ०.५ µ एल और nuclease मुक्त पानी की ४.० µ एल शामिल हैं ।
  3. उपयुक्त प्राइमर मास्टर मिश्रण के ५.५ µ एल जोड़ें और उपयुक्त डीएनए मास्टर मिश्रण के ४.५ µ एल एक ३८४ अच्छी तरह से qPCR प्लेट पर एक अच्छी तरह से करने के लिए ।
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से प्राइमरी मिश्रण के ५.५ µ एल जोड़ने के साथ शुरू करो । डीएनए मिश्रण के ४.५ µ एल जोड़ने से पहले कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए २०० x g पर थाली स्पिन ।
  4. प्लेट के लिए सील का पालन करें और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए २०० x g पर स्पिन ।
  5. निंन शर्तों के साथ एक रीयल-टाइम qPCR सिस्टम का उपयोग करते हुए qPCR करें: ९५ ° c 3 min के लिए; 10 एस के लिए ९५ ° c के ४० चक्र, 30 एस के लिए ५५ ° c; पिघलने वक्र ६५ ° c करने के लिए ९५ ° c वेतन वृद्धि के साथ, 5 एस ।
  6. प्रत्येक प्राइमरी जोड़ी के लिए, qPCR में इस्तेमाल किया 5% इनपुट नमूना के सापेक्ष आईपी नमूना के प्रतिशत इनपुट की गणना । गणना का कार्य करने के लिए तकनीकी पीसीआर triplicates के साधनों का प्रयोग करें ।
    नोट: यदि पीसीआर triplicates में पर्याप्त भिंनता देखी जाती है, तो qPCR को ३८४-well प्लेट में कुओं के बीच मास्टर मिक्स बंदिशों, pipetting त्रुटियों और क्रॉस-प्रदूषित होने के लिए ध्यान के साथ दोहराना सबसे अच्छा है ।
    1. कच्चे सीक्यू मूल्यों से कमजोर पड़ने कारक का प्रतिनिधित्व चक्र की संख्या घटाकर १००% करने के लिए इनपुट के लिए सीक्यू मूल्यों को समायोजित करें ।
      नोट: पांच प्रतिशत इनपुट के एक कमजोर पड़ने कारक का प्रतिनिधित्व करता है 20-गुना है, जो ४.३२ चक्र के बराबर होती है (लॉग2 20 = ४.३२) ।
    2. 2 के रूप में प्रतिशत इनपुट की गणना ^ (सीक्यूइनपुट -सीक्यूआईपी) १०० से गुणा ।

10. निर्धारित MNase डाइजेस्ट शर्तों (पहले पूर्ण चिप प्रयोग करने की सिफारिश की)

  1. पिछले प्रोटोकॉल के ४.४ के माध्यम से २.१ चरणों का पालन करें । क्रोमेटिन युक्त गोली के MNase पाचन के कई नमूनों के लिए पर्याप्त lysate उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल को स्केल करें । ४.४ कदम पर, MNase पाचन बफर की १.२५ मिलीलीटर में छर्रों reसस्पेंड । Aliquot 5 ट्यूबों के लिए नमूनों को इतना है कि प्रत्येक शामिल है २५० क्रोमेटिन MNase पाचन बफर में reसस्पैंड गोली के µ एल ।
  2. 0, १.५, २.५ या प्रत्येक ट्यूब के लिए MNase के 5 µ एल जोड़ें । उंहें 4-6 बार पलटने से धीरे मिश्रण और तुरंत 20 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में ट्यूबों गर्मी ।
  3. तुरंत बर्फ पर ट्यूबों रखकर प्रतिक्रियाओं को रोकने और एक 10 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए ०.५ एम EDTA के 5 µ एल जोड़ने ।
समाधान धीरे उलटा द्वारा मिश्रण ।
  • 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १५,५०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक और एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
  • 1% अंतिम एकाग्रता के लिए एसडीएस जोड़ें (25 µ 10% शेयर समाधान के एल) और NaHCO3 करने के लिए ०.१ मीटर अंतिम एकाग्रता (1m स्टॉक समाधान के 25 µ एल) १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में नमूनों के लिए ।
  • 5M NaCl, ग्लाइकोजन के 5 µ l के 20 µ l को जोड़ें, और 1.5 एमएल ट्यूबों में नमूनों को µ/एमएल 20mg K के १२.५ proteinase एल. उन्हें ६५ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  • 10 मिलीग्राम/एमएल RNaseA के 10 µ एल जोड़ें । 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  • जलीय समाधान करने के लिए पीसीआई के ३०० µ एल जोड़ें और उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १५,५०० x g पर स्पिन ।
    1. एक नई ट्यूब के लिए जलीय परत को हटा दें । पीसीआई के ३०० µ एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १५,५०० x g पर स्पिन । एक नई ट्यूब के लिए जलीय परत स्थानांतरण ।
  • 3 एम सोडियम एसीटेट के 0.1 x मात्रा जोड़ें (आमतौर पर ~ 30 µ एल) और ठंड १००% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर डीएनए को तेज करने के लिए । ट्यूब उलटा 4-6 बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । 1 ज या-20 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए-८० ° c पर ट्यूब मशीन ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १५,५०० x g पर ट्यूब स्पिन । सावधानी से supernatant को पिपेट से निकाल दें ।
    2. ठंडा ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में छर्रों धो लो । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १५,५०० x g पर स्पिन ।
    3. चलो छर्रों हवा-डाकू में शुष्क लगभग 20 मिनट (या जब तक पूरी तरह से शुष्क) । nuclease-मुफ्त पानी की 30 µ एल में छर्रों reसस्पेंड ।
  • डीएनए लोड हो रहा है डाई जोड़ें और एक 2% agarose जेल पर 20 µ एल चलाने के लिए पचा डीएनए कल्पना ।

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख घटक micrococcal nuclease की एकाग्रता का अनुकूलन है (MNase) घुलनशील टुकड़ों में क्रोमेटिन को पचाने के लिए इस्तेमाल किया, के रूप में 10 कदम में उल्लिखित । यह ब्याज के जीनोमिक क्षेत्रों में citrullinated संशोधनों के वितरण के बारे में उच्च संकल्प डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक MNase अनुमापन घुलनशील क्रोमेटिन अंश में di-nucleosomes की एक छोटी राशि के साथ मुख्य रूप से मोनो nucleosomes को प्राप्त करने के लिए सबसे उपयुक्त एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए. यह क्रोमेटिन-युक्त गोली के MNase पाचन निम्नलिखित डीएनए निकालने और agarose जेल ट्रो (चित्रा 2) प्रदर्शन के द्वारा visualized किया जा सकता है । MNase की तैयारी में यहां इस्तेमाल किया, 20 इकाइयों/µ एल में एंजाइम के २.५ µ एल मुख्य रूप से मोनो-nucleosomes का उत्पादन किया, और इसलिए इस राशि चिप के लिए इस्तेमाल हुआ था ।

    प्रतिनिधि परिणामों के दो सेट इस चिप प्रक्रिया के लिए दिखाए जाते हैं (चित्र 3) । पहले उदाहरण में, या तो wildtype कोशिकाओं या methyltransferase जो इस निशान catalyzes कमी कोशिकाओं में एक citrullinated मिथाइल मार्क का मूल्यांकन किया जाता है । विशेष रूप से, चिप H3K4me2 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया था, साथ ही साथ citrullinated H3 के खिलाफ एक नियंत्रण के रूप में, wildtype और set1Δ कोशिकाओं में । H3K4me2 मुख्य रूप से कोडिंग क्षेत्रों के 5 ' अंत में प्रतिलिपि प्रारंभ साइट के बस बहाव स्थानीयकृत और, Set1 के अभाव में, H3K4me2 कोशिकाओं में नहीं पाया जा सकता है17,18,19। set1Δ तनाव इसलिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है पृष्ठभूमि संकेत है कि गैर के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है की मात्रा का संकेत करने के लिए अंय citrullinated निशान या एंटीबॉडी के डीएनए के विशिष्ट बंधन । इस मामले में, wildtype तनाव H3K4me2 के लिए 5 ' अंत में Set1, PMA1 और ERG1120,21, जबकि कोई संकेत Set1Δ में मनाया गया था के प्रत्यक्ष लक्ष्य जाना जाता जीन के लिए स्पष्ट संवर्धन दिखाया कक्ष (चित्र 3ए) । उंमीद के रूप में, वहां telomere (TEL) पर H3K4me2 मार्क की कोई समृद्ध है 07L। मध्य sporulation जीन SPR3 की अभिव्यक्ति भी Set122,23से विनियमित होने की सूचना दी गई है, लेकिन SPR3 ओआरएफ के 5 ' अंत में H3K4me2 के संवर्धन सबसे स्तरों के समान है मनाया पर TEL07L, के रूप में या तो PMA1 या ERG11की तुलना में । इस मिथाइल चिह्न के स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने से यह संकेत मिलता है कि SPR3 का Set1 मध्यस्थता नियमन, PMA1 या ERG11 की तुलना में किसी भिंन तंत्र द्वारा घटित होने की संभावना है , जैसा कि पहले22मनाया जाता है ।

    दूसरे उदाहरण में, acetylated H4K16 की चिप wildtype citrullinated deacetylase, जो Sir2 के निशान को निकालता है की कमी की कोशिकाओं और कोशिकाओं में citrullinated H4 के सापेक्ष दिखाया गया है । H4K16ac heterochromatic की तरह क्रोमेटिन में समाप्त हो गया है telomere के करीब है, और euchromatin में telomere से अधिक बाहर समृद्ध24,25, के रूप में TEL07L और TEL15L के लिए प्रदर्शन किया (आंकड़ा बी). इसके अतिरिक्त, Sir2 का नुकसान विशिष्ट telomeric और subtelomeric क्षेत्रों में H4K16ac में वृद्धि का कारण बनता है, हालांकि नियंत्रण जीन PMA1में कोई परिवर्तन नहीं मनाया जाता है, जहां Sir2 को स्थानीयकृत नहीं जाना जाता है । हालांकि इन आंकड़ों में sir2Δ कोशिकाओं में H4K16ac के स्तर में एक स्पष्ट वृद्धि दिखाने के लिए, H4K16ac में पता चला परिवर्तन, जो H3K4me2 में wildtype बनाम set1Δ कोशिकाओं में परिवर्तन के रूप में के रूप में पर्याप्त होने की उंमीद नहीं है, अगर चिप मापदंडों अस्पष्ट हो सकता है ठीक से अनुकूलित नहीं है । ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए अनुशंसाएँ चर्चा में बताई गई हैं ।

    Figure 1
    चित्र 1: चिप प्रक्रिया की समयरेखा. चिप प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट अनुसूची में दिखाया गया है । संभावित भिंनताएं पाठ में दर्शाई गई हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2: मोनो-nucleosomes के solubilization के लिए पाचन परीक्षण MNase । डीएनए के Agarose जेल ट्रो MNase (20 इकाइयों/µ एल) की बदलती मात्रा के साथ क्रोमेटिन गोली के बाद पाचन अलग । mononucleosomes से डीएनए लगभग १५० बीपी पर स्थानांतरित कर, dinucleosomes से लगभग ३०० बीपी और polynucleosomes से डीएनए में तेजी से उच्च आणविक भार पर पाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3 : H3K4me2 और H4K16ac के चिप्स wildtype और उत्परिवर्ती खमीर उपभेदों में । ( क) H3K4me2 और H3 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर चिप wildtype और set1Δ कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया. प्रतिशत इनपुट दोनों H3K4me2 और H3 आईपी और अनुपात के लिए प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए गणना की गई संकेत loci में H3K4me2 के सापेक्ष संवर्धन संकेत ग्राफी है । PMA1, ERG11 और SPR3 के लिए प्राइमरों प्रत्येक ओआरएफ के 5 ' अंत में amplicons उत्पंन, जबकि TEL07L प्राइमर जोड़ी 7 गुणसूत्र के बाएं हाथ पर telomere के निकट है । तीन जैविक प्रतिकृति के माध्य दिखाया गया है और त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख) चिप wildtype और sir2Δ कोशिकाओं में H4K16ac और H4 पहचानने एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया और चित्र 3एके लिए वर्णित के रूप में रची गई थी । प्राइमरी जोड़े telomeres (TEL07L और TEL15L) और पहले से निर्धारित euchromatic क्षेत्रों में प्रत्येक subtelomere (21 kb और 5 kb telomere, क्रमशः) से बाहर के भीतर अनुप्रवाह के निकटवर्ती अनुक्रम बढ़ाना ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    तनाव संख्या जीनोटाइप संदर्भ
    yEG230 MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 23
    yEG223 MATα sir2Δ:: NATMX इस अध्ययन
    yEG232 माता set1Δ:: KANMX 23

    तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त खमीर उपभेदों ।

    Oligo संख्या स्थान अनुक्रम
    oEG141 TELVIIL च AGCCCGAGCCTGTACTAAAT
    oEG142 TELVIIL आर CAAAAGAAACTTTTCATGGCA
    oEG153 5 ' PMA1 च TCAGCTCATCAGCCAACTCAAG
    oEG154 5 ' PMA1 आर CGTCGACACCGTGATTAGATTG
    oEG220 TELVIIL + 21KB च AAACAATGGGACCCTTCTGA
    oEG221 TELVIIL + 21KB R AACACCTTGCAAAACACAGG
    oEG280 TELXVL च ATCCTGCAATTGGGCCACTAT
    oEG281 TELXVL आर AGCGGAAGGCATATTAACGT
    oEG282 TELXVL + 5KB च AGGCGATGTAATCTCACCAA
    oEG283 TELXVL + 5KB R CATTCACACATCCTGCTACCA
    oEG568 ERG11 च CCTCTTATTCCGTCGGTGAA
    oEG569 ERG11 आर TGTGTCTACCACCACCGAAA
    oEG963 SPR3 च TCTGGATTCGCTGAGGAAGT
    oEG964 SPR3 आर TTTCAGTTCAGGGCTTTTCG

    तालिका 2: इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमर ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    यहां वर्णित प्रक्रिया immunoprecipitation द्वारा खमीर कोशिकाओं में संशोधित histones के साथ जुड़े डीएनए के कुशल वसूली के लिए अनुमति देता है । यह qPCR द्वारा पीछा किया है जो स्थानीय संवर्धन या विशिष्ट citrullinated संशोधनों की कमी का निर्धारण करने के लिए ब्याज की क्षेत्रों बढ़ाना जो प्राइमरों का उपयोग कर । के बावजूद एक विधि के रूप में लगभग 20 साल पहले विकसित किया जा रहा है, चिप अलग जीनोमिक क्षेत्रों में और विभिंन स्थितियों के तहत citrullinated संशोधन की स्थिति की जांच के लिए परिभाषित परख रहता है । हालांकि चिप अगली पीढ़ी sequencing प्रौद्योगिकियों के लिए युग्मित एक जीनोम चौड़ा स्केल6,7पर citrullinated संशोधनों पूछताछ कर सकते हैं, लागत और इन तरीकों की आवश्यक डेटा विश्लेषण कुछ प्रयोगशाला सेटिंग्स में उनके उपयोग को सीमित कर सकता है । इसके अलावा, इन epigenomic प्रयोगों अक्सर qPCR को युग्मित चिप द्वारा पीछा कर रहे है कुछ जीनोमिक loci में citrullinated संशोधन की स्थिति की टिप्पणियों को मांय । वहां कुछ तुलनीय तरीके है कि शारीरिक रूप से एक citrullinated चिह्न (या अंय प्रोटीन) जीनोम के भीतर एक विशिष्ट स्थान को जोड़ने और विभिंन पर्यावरणीय या जैविक स्थितियों के तहत इस बातचीत की गतिशीलता का विश्लेषण में चिप की उपयोगिता प्रदान कर रहे है . हालांकि परिभाषित जीनोमिक क्षेत्रों से क्रोमेटिन को अलग करने में हाल ही में सफलता मिली है और जन स्पेक्ट्रोमेट्री8,9,10,11का उपयोग कर स्थानीय citrullinated के निशान की पहचान करते हुए इन तरीकों को पोज तकनीकी चुनौतियों और विविध प्रयोगशाला प्रकार भर में उनकी उपयोगिता जन स्पेक्ट्रोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन और डेटा विश्लेषण संसाधनों के लिए पर्याप्त पहुंच द्वारा सीमित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित तकनीकी और आर्थिक विविध प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए सुलभ है, प्राथमिक संभव बाधा के साथ एक qPCR मशीन का उपयोग किया जा रहा है । चिप खमीर और अंय प्रणालियों में संशोधित histones के जीनोमिक स्थानीयकरण को परिभाषित करने के लिए सोने के मानक रहता है ।

    यह कदम है कि एक साथ कई म्यूटेंट या पर्यावरणीय स्थितियों का परीक्षण सहित विभिंन प्रयोगात्मक शर्तों, सूट अनुकूलित किया जा सकता है की एक संख्या के साथ एक बहुमुखी प्रोटोकॉल है । वैकल्पिक रूप से, पर्याप्त क्रोमेटिन आमतौर पर एक lysate से उत्पन्न होता है करने के लिए के साथ कई आईपीएस प्रदर्शन करने के लिए कम से चार अलग एंटीबॉडी. इस प्रोटोकॉल भी epitope-टैग कर रहे हैं, या जिसके लिए एंटीबॉडी उत्पन्न किया गया है गैर citrullinated क्रोमेटिन प्रोटीन की चिप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि इस प्रोटोकॉल के लिए गैर चिप citrullinated प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा रहा है, निर्धारण समय सहित मापदंडों, आईपी और एंटीबॉडी एकाग्रता में क्रोमेटिन एकाग्रता अक्सर पृष्ठभूमि पर लक्षित प्रोटीन के संवर्धन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । सबसे अधिक, यह ४५ और ६० मिनट के बीच करने के लिए formaldehyde के साथ निर्धारण समय को बढ़ाने के लिए और आईपी में इस्तेमाल क्रोमेटिन की मात्रा में वृद्धि करने के लिए उपयोगी है (कुल प्रोटीन का २०० µ जी तक).

    वहां संभावित चर की एक संख्या है कि गुणवत्ता और citrullinated संशोधन चिप प्रयोगों के reproducibility में योगदान कर रहे हैं । हालांकि एक उप-इष्टतम प्रयोग अक्सर धनात्मक परिणामों की तुलना करते समय हो सकता है (उदाहरण के लिए, wildtype या set1Δ कक्षों में H3K4me2 का स्तर, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है), और अधिक सूक्ष्म अंतर में मास्क किए जाने की संभावना होती है अनुचित तरीके से किया गया प्रयोग (जैसे कि wildtype या TEL07L में H4K16ac के भिंन स्तरों के रूप में, जो कि चित्र बीमें दिखाया गया है, के रूप में दिखाई देती है । प्रयोगात्मक मापदंडों पर विचार करने के लिए इस्तेमाल किया खमीर कोशिकाओं की मात्रा शामिल हैं, निर्धारण समय, क्रोमेटिन आईपी में इस्तेमाल अंश की एकाग्रता, पचा डीएनए के आकार टुकड़ा-प्रोटीन परिसरों और एंटीबॉडी गुणवत्ता और एकाग्रता । इस दृष्टिकोण की एक सीमा है कि प्रयोगात्मक मापदंडों का अनुकूलन आम तौर पर प्रत्येक citrullinated संशोधन के लिए आवश्यक है परीक्षण किया जा रहा है और उत्परिवर्ती उपभेदों और/ citrullinated मार्क स्तर या विभिन्न स्थितियों के तहत स्थानीयकरण में सूक्ष्म अंतर हो सकता है, और इन मतभेदों का पता लगाने की क्षमता ऊपर वर्णित मापदंडों पर निर्भर है । हम नीचे सबसे संवेदनशील प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के विकास के लिए महत्वपूर्ण बातों में से कुछ पर चर्चा ।

    प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, यह MNase के कई सांद्रता परीक्षण करने के लिए एक पूर्ण चिप प्रयोग करने से पहले इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है । सुनिश्चित करना है कि आईपी के भीतर डीएनए पर्याप्त रूप से खंडित उच्च संकल्प चिप परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । भले ही qPCR उत्पादों के amplicon आकार छोटा हो सकता है (आम तौर पर कम से १०० bp), यदि डीएनए का टुकड़ा आकार काफी बड़ा है, qPCR झूठा एक विशिष्ट लोकस पर संवर्धन संकेत हो सकता है जब, वास्तविकता में, citrullinated निशान स्थानीयकृत हो सकता है सैकड़ों basepairs दूर । इस प्रोटोकॉल MNase पर निर्भर करता है, जबकि मोनो में क्रोमेटिन solubilize और di-nucleosomes, अन्य चिप प्रोटोकॉल भी आमतौर पर क्रोमेटिन6कतरनी करने के लिए sonication का उपयोग करें,7. हालांकि कतरनी आकार कम वर्दी हो जाते हैं और यह प्रयोगों के बीच लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए और अधिक कठिन हो सकता है, यद्यपि Sonication भी solubilizing क्रोमेटिन टुकड़े के लिए एक विश्वसनीय तरीका है । हालांकि sonication कुछ गैर citrullinated प्रोटीन की चिप के लिए बेहतर हो सकता है, MNase के उपयोग में क्रोमेटिन को पचाने के लिए मुख्य रूप से मोनो nucleosomes citrullinated संशोधन चिप प्रयोगों के संकल्प में सुधार कर सकते हैं ।

    एक सफल चिप प्रयोग के लिए एक आवश्यकता एक एंटीबॉडी है कि विशिष्ट और उच्च संबंध के साथ ब्याज की citrullinated संशोधन पहचानता है । citrullinated संशोधन का पता लगाने के लिए एक विधि के रूप में चिप की प्राथमिक सीमा एक उच्च गुणवत्ता, सत्यापित एंटीबॉडी पर अपनी निर्भरता है; इस तरह के एक एजेंट के बिना, चिप से प्राप्त परिणाम के लिए जैविक रूप से प्रासंगिक होने की संभावना नहीं कर रहे हैं । वहां citrullinated संशोधनों के खिलाफ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के एक नंबर रहे है नवोदित खमीर में पाया, हालांकि गुणवत्ता और एंटीबॉडी की वैधता चर रहा है । इन एंटीबॉडी को मांय करने के प्रयासों के लिए एक दिया प्रयोग के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध एंटीबॉडी निर्धारित करने के लिए उपयोगी संसाधनों का उत्पादन किया है26। यह सिफारिश की है कि एंटीबॉडी चिप के लिए इस्तेमाल किया उनकी विशिष्टता के लिए तरीकों की विविधता के साथ मान्य हैं, संशोधित और uncitrullinated पेप्टाइड्स की जांच arrays सहित, पूरे सेल निष्कर्षों और शुद्ध histones के पश्चिमी दाग प्रदर्शन, और में इस तरह के एक संशोधित एंजाइम के साथ उपभेदों के रूप में उचित नियंत्रण, के साथ चिप प्रयोगों नष्ट कर दिया या संशोधित citrullinated अवशेषों में अंक उत्परिवर्तनों को ले जाने. नए एंटीबॉडी के लिए कि पहचाने जाने वाले चिह्न या लैब जनित एंटीबॉडी, इन विशिष्टता प्रयोगों कि एंटीबॉडी चिप के लिए एक वैध एजेंट हो सकता है निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।एंटीबॉडी की विशिष्टता को मांय करने के अलावा, एक wildtype तनाव और एक नकारात्मक नियंत्रण तनाव से आईपी के लिए एक एंटीबॉडी अनुमापन प्रदर्शन अक्सर आवश्यक एंटीबॉडी की राशि का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है (एक सेट क्रोमेटिन एकाग्रता के सापेक्ष) उपभेदों या जीनोम के क्षेत्रों के बीच संवर्धन में सही मतभेदों का पता लगाएं । इसके अलावा, यदि मार्क के जीनोमिक वितरण पैटर्न के बारे में कुछ डेटा जाना जाता है, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्राइमर सेट सभी qPCR प्रयोगों में शामिल किया जाना चाहिए किसी भी व्यक्ति के प्रयोग को मांय करने और प्रयोगों के बीच तुलना को सरल बनाने के लिए ।

    कुल मिलाकर, यह काम नवोदित खमीर में किसी भी जीनोमिक क्षेत्र में citrullinated संशोधन स्थिति पूछताछ में रुचि शोधकर्ताओं के लिए एक मूलभूत विधि का वर्णन है । इस प्रोटोकॉल के बहुमुखी प्रतिभा और विविध प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए लागू यह आणविक स्तर पर क्रोमेटिन गतिशीलता विदारक के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण बनाता है ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    लेखक सहायक विचार विमर्श के लिए ग्रीन लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को NIH पलाश R03AG052018 और R01GM124342 ने भाग में समर्थन दिया था E.M.G.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Yeast Extract Research Products International (RPI) Y20025-1000.0
    Peptone Research Products International (RPI) P20250-1000.0
    Dextrose ThermoScientific BP350-1
    Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
    Glycine Fisher Scientific AC12007-0050
    Tris Amresco 0497-5KG
    EDTA Sigma-Aldrich E6758-500G
    NaCl ThermoScientific BP358-10
    4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma-Aldrich 74385 Equivalent to NP-40
    MgCl ThermoScientific S25533
    CaCl2 Sigma-Aldrich 20899-25G-F
    LiCl ThermoScientific AC413271000
    Sodium Dodecyl Sulfate Amresco M107-1KG
    Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich 30970-100G
    Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
    NaHCO3 ThermoScientific S25533
    PMSF Sigma-Aldrich P7626-5G
    Yeast protease inhibitor cocktail VWR 10190-076
    25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol VWR Life Science 97064-824
    Ethanol Sigma-Aldrich E7023
    Nuclease-Free Water VWR 100720-992
    Micrococcal Nuclease Worthington Biochemical LS004797
    Glycogen ThermoScientific R0561
    Proteinase K Research Products International (RPI) P50220-0.1
    RNase A  Sigma-Aldrich R6513-50MG
     Bradford Assay Reagent ThermoScientific 23238
     BSA Standard 2 mg/mL ThermoScientific 23210
    α H4 EMD Millipore 04-858
    α H4K16ac EMD Millipore ABE532
    α H3 Abcam ab1791
    α H3K4me2 Active Motif 39142
     High Rox qPCR Mix Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix ACC-PR2000-L-1000
    Protein A/G Magnetic Beads ThermoScientific 88803
    magnetic stand for 1.5mL tubes Fisher Scientific PI-21359
    Acid-Washed Glass Beads Sigma-Aldrich G8772
     Microtube Homogenizer Benchmark D1030
    2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings Sigma-Aldrich Z763837-1000EA
    Gel loading tips Fisher Scientific 07-200-288
    Cuvettes Fisher Scientific 50-476-476
    Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
    50 mL conical tubes Fisher Scientific 14-432-22
    384-Well PCR Plate Fisher Scientific AB-1384W
     Gyratory Floor Shaker New Brunswick Scientific Model G10
    Spectrophotometer ThermoScientific ND-2000c
     Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
    2. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
    3. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
    4. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
    5. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
    6. Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
    7. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
    8. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
    9. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
    10. Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
    11. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
    12. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
    13. Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
    14. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
    15. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
    16. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
    17. Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
    18. Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
    19. Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
    20. Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
    21. South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
    22. Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
    23. Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
    24. Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
    25. Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
    26. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).

    Tags

    जेनेटिक्स इश्यू १३० Epigenetics क्रोमेटिन citrullinated संशोधन मिथाइल acetylation क्रोमेटिन immunoprecipitation यीस्ट
    <em>Saccharomyces cerevisiae</em> से citrullinated संशोधनों की क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप)
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., … More

    Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (130), e57080, doi:10.3791/57080 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter