Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Radionukleid-fluorescens Reporter gen Imaging for at spore Tumor Progression i gnavere Tumor modeller

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

Vi beskriver en protokol for prækliniske i vivo sporing af kræft metastaser. Det er baseret på en radionukleid-fluorescens reporter kombinerer natrium Iodid symporter, opdaget af non-invasiv [18F] tetrafluoroborate-PET, og en fluorescerende proteiner for strømlinet ex vivo bekræftelse. Metoden er anvendelig for prækliniske i vivo celle tracking uden for tumor biology.

Abstract

Metastaser er ansvarlig for de fleste kræftdødsfald. Trods omfattende forskning, den mekanistiske forståelse af de komplekse processer for metastaser er stadig ufuldstændig. In vivo modeller er altafgørende for metastaser forskning, men kræver raffinement. Sporing spontan metastase af non-invasiv i vivo billeddannelse er nu muligt, men er fortsat udfordrende, da det kræver lang tid observation og høj følsomhed. Vi beskriver en langsgående kombineret radionuklid og fluorescens hele kroppen i vivo billeddannelse tilgang til sporing af tumor progression og spontane metastaser. Denne reporter gen metode beskæftiger natrium Iodid symporter (NIS) smeltet til en fluorescerende proteiner (FP). Kræftceller er manipuleret til stabilt udtrykkelige NIS-FP efterfulgt af valg baseret på fluorescens-aktiveret celle sortering. Tilsvarende tumor modeller er etableret i mus. NIS-FP udtrykker kræftceller er spores ikke-invasivt i vivo på niveauet hele kroppen af positron emissions tomografi (PET) ved hjælp af NIS radiotracer [18F] BF4-. PET er i øjeblikket den mest følsomme i vivo imaging-teknologi tilgængelig på denne skala og giver mulighed for pålidelige og absolut kvantificering. Nuværende metoder enten er afhængige af store kohorter af dyr, der er aflivet for metastaser vurdering på varierende tidspunkter, eller stole på knapt målbare 2D billeddannelse. Fordelene ved den beskrevne metode er: (i) meget følsomme ikke-invasive i vivo 3D PET imaging og kvantificering, (ii) automatiseret PET tracer produktionen, (iii) en betydelig reduktion i kræves animalske numre på grund af gentagne billeddannelse muligheder, (iv). erhvervelse af parrede data fra efterfølgende imaging sessioner giver bedre statistiske data, og (v) den iboende mulighed for ex vivo bekræftelse af kræftceller i væv af Fluorescens mikroskopi eller flowcytometri. I denne protokol beskrive vi alle foranstaltninger for rutinemæssig NIS-FP-ydes non-invasiv i vivo kræft celle sporing ved hjælp af PET/CT og ex vivo bekræftelse af i vivo resultater. Denne protokol har applikationer uden for kræftforskning, når i vivo lokalisering, ekspansion og mangeårige overvågning af en celle population er af interesse.

Introduction

Metastatisk sygdom er årsag til de fleste cancer-relaterede dødsfald 1. Trods omfattende forskning i metastatisk processer er pålidelig overvågning af kræft metastaser i dyremodel systemer vanskeligt at opnå. De seneste fremskridt i hele kroppen billeddannelsesteknologier og multimodale imaging tilgange har aktiveret non-invasiv i vivo celle tracking2,3,4,5. Sidstnævnte kan bruges som et redskab til at overvåge tilstedeværelsen, fordeling, antal og levedygtighed af celler, ikke-invasivt og gentagne gange i et levende dyr eller et menneske.

Formålet med metoden beskrevet her er på langs og ikke-invasivt spore kræftceller i 3D i levende gnavere tumor modeller. Brug denne metode, vil forskere være i stand til nøjagtigt kvantificere tumor progression herunder metastatisk spredning i 3D. Sammenlignet med traditionelle ikke-imaging-baserede teknikker, giver denne metode erhvervelse af kvantitative data med stort set reduceret animalske numre. En anden funktion i denne metode er, at det giver mulighed for korrelation af i vivo billeddannelse med strømlinede downstream ex vivo analyse af de registrerede celler i høstede væv af histologi eller flowcytometri3,6.

Begrundelsen for udviklingen af denne metode var at give en in vivo -værktøj til overvågning og kvantificering af den hele metastatisk proces i gnavere tumor modeller. Vigtigere er, var det designet til at minimere brug af dyr samtidig reducere Inter animalske variabilitet. Langsgående non-invasiv hele kroppen imaging er glimrende egnet til at informere på metastatisk udvækst, for hvilke i sig selv er det svært at forudsige nøjagtigt tidspunkt og sted for dens forekomst. Hele kroppen 3D imaging har derfor været i centrum for metodeudvikling. For at lukke skala kløften mellem hele kroppen i vivo vedtaget billeddannelse og potentiale downstream ex vivo histologiske bekræftelse, en multi-skala imaging tilgang baseret på en dual-mode radionukleid-fluorescens reporter blev3, 6.

Positronemissionstomografi (PET) er den mest følsomme 3D hele kroppen imaging-teknologi i øjeblikket tilgængelige tilbyder fremragende dybde penetration og absolut kvantificering7 med en opløsning på < 1 mm8,9. I øjeblikket, kan prækliniske celle sporing på hele kroppen niveau af radionuklid imaging pålideligt registrere celler ved tætheder af ~ 1.000 celler pr. volumen af en million celler3,6 med beslutninger i regionen sub millimeter. I modsætning til intravital mikroskopi, det kan ikke afsløre enkelt sprede kræftceller, men det kræver ikke kirurgiske procedurer (fx vindue kamre), er ikke begrænset til et mindre synsfelt, og ikke af lav væv penetration og scatter. Bioluminescens imaging er giver et billigt alternativ, men forbundet med scatter og lysabsorption spørgsmål samt ringe dybde penetration, og derfor alvorligt begrænset i kvantificering2. Fluorescens hele kroppen imaging har været anvendt til erhvervelse af 3D-billeder, men det er langt mindre følsomme i forhold til bioluminescens eller radionukleid teknologier2. Ikke desto mindre tilbyder fluorescens mulighed for at udføre ex vivo downstream væv analyse ved flowcytometri eller mikroskopi. Sidstnævnte lukker skala-kløften mellem makroskopisk hele kroppen imaging (mm opløsning) og fluorescens mikroskopiske væv analyse (µm opløsning)3. Derfor, radionukleid og fluorescens modaliteter supplerer hinanden, lige fra hele kroppen niveau (sub-) cellulære-skala.

Reporter gen imaging er ideelt egnet til langvarig celle sporing som krævet i metastase forskning. I dette program det er overlegen i forhold til direkte celle mærkning som det er (i) ikke er berørt af etiketten fortynding og dermed ikke begrænset i at spore tid, og (ii) bedre afspejler levende celle numre. Derfor er hele kroppen celle tracking især nyttigt for programmer som spores celler formere eller udvide i vivo, for eksempel i kræft forskning3,6, til påvisning af teratom dannelse i stilken celle forskning, eller til kvantificering af immun celle ekspansion5.

Forskellige radionukleid-baserede reporter gener er tilgængelig2. Disse omfatter enzymer såsom herpes simplex virus HSV11 thymidine kinase (HSV1 -tk), transportører som natrium Iodid symporter (NIS) eller noradrenalin transporter (netto), samt celle overfladen receptorer som dopamin D2-receptoren ( D2R). NIS er et glykosyleret trans-membran protein, der aktivt medierer Iodid optagelsen, for eksempel i follikulære celler i skjoldbruskkirtlen til efterfølgende syntese af thyreoideahormoner10. Denne proces er drevet af symport af Na+ og afhængig af den cellulære natrium graduering, som vedligeholdes af Na+/K+-ATPase11. Derfor, NIS bedre afspejler levende celle numre end andre journalister som Iodid/radiotracer udbredelse er knyttet til en aktiv Na+/K+ gradient snarere end den blotte tilstedeværelse af transportøren. Traditionelt har radioiodide har været brugt til NIS billeddannelse. For celle tracking, er alternative NIS radiotracers, der ikke er metabolisk indesluttet i skjoldbruskkirtlen blevet rapporteret at være overlegen6. Dette nyligt udviklede PET radiotracer [18F] tetrafluoroborate ([18F] BF4-)12,13 viser overlegen farmakokinetik i forhold til radioiodide6 samtidig være tilgængelige på høje specifikke aktiviteter14 uden behov for komplekse radiokemi faciliteter. [18F] BF4- kan syntetiseres via to forskellige måder. Den første metode er baseret på isotop udveksling af ikke-radioaktive 19F i BF4- med radioaktivt 18F12. Den anden metode er gennem tilsætning af 18F til ikke-radioaktive boron trifluoride14. Sidstnævnte metode blev rapporteret til at give højere enkeltforanstaltninger14 og er den foretrukne metode for prækliniske billeddannelse.

NIS er stærkt udtrykt i skjoldbruskkirtlen væv. Det kommer også til udtryk i mælkekirtlerne spyt, lachrymal og ammende samt maven, men på et lavere niveau i forhold til skjoldbruskkirtlen10. Derfor, fremragende kontrast imaging i andre regioner, kroppen kan opnås ved hjælp af NIS. Det er også yderst homologe mellem menneskelige, rotte og mus10. Desuden er der ingen rapporter om toksicitet ved ektopisk NIS udtryk i ikke-thyroidal celler. Vigtigere er, har NIS heller ikke været forbundet med værten immunrespons, hverken hos mennesker eller i gnavere. NIS har været brugt som en reporter gen for at måle promotor aktivitet15,16,17 og gen expression18,19,20,21,22 ,23 i flere forskellige sammenhænge. Det har også været brugt til ikke-invasive billeddannelse gen terapi vektorer24,25, og til at spore celler i hjerte4, hæmatopoietisk26, inflammation5og neurale studier27. For nylig, NIS er også blevet brugt som en reporter gen for at spore kræft metastaser i vivo3,6.

Sammenfattende er de vigtigste fordele ved denne metode over tidligere teknikker: (i) meget følsomme ikke-invasiv 3D i vivo lokalisering og kvantificering af metastatisk sprede, (ii) automatiseret produktion af [18F] BF4- på stor kindtand aktiviteter, (iii) en betydelig reduktion i kræves dyr gennem langsgående imaging, (iv) erhvervelse af parrede data fra efterfølgende imaging sessioner resulterer i forbedrede statistiske data, som igen yderligere reducerer brug af dyr, og (v) den iboende mulighed for ex vivo bekræftelse af kræftceller i væv ved flowcytometri eller Fluorescens mikroskopi.

Protocol

Denne protokol opfylder alle krav, som Det Forenede Kongerige (UK) lovgivning og den lokale etiske Review panel. Efter denne protokol, sikre procedurerne, der også opfylder alle krav er dikteret af nationale lovgivning og lokale etiske Review panel. Sikre, at alle eksperimenter, der involverer radioaktivitet er kompatibel med lovgivning og lokale bestemmelser og udføres sikkert.

1. engineering og karakterisering af kræftceller til at udtrykke radionukleid-fluorescens fusion reporter NIS-FP

Bemærk: For enkelhed, mEGFP A206K er forkortet som "Normal god landbrugspraksis", og mCherry som "RFP" i de efterfølgende afsnit i denne protokol.

  1. Generation af lentiviral partikler
    1. For at producere lentivirus partikler, co transfect 293T celler med de følgende fire plasmider ved hjælp af en egnet Transfektion metode: (i) den reporter gen kodning plasmid (pLNT SFFV NIS-NGL eller pLNT SFFV NIS-RFP (jf. supplerende oplysninger), (ii) tredje generation lentiviral emballage plasmider pRRE og (iii) pRSV-Rev og (iv) en virus kuvert indeholdende plasmid, fx, pMD2.G. Pre-mix plasmider før du tilføjer dem til Transfektion mix. Udføre Transfektion i en celle kultur hætte.
      Bemærk: Yderligere Transfektion oplysninger er fastsat i supplerende oplysninger.
    2. Vurdere Transfektion succes efter 48 h af standard wide-felt Fluorescens mikroskopi med filterindstillinger passer til den valgte fusion reporter (NIS-normal god landbrugspraksis eller NIS-RFP).
      Bemærk: Fluorescens signaler er betegnende for reporter gen Transfektion og derfor kun et surrogat for vellykket Co Transfektion, ikke en indikator for vellykket virus produktion.
    3. Høste virus partikel-holdige supernatanten ved hjælp af en sprøjte og fjerne flydende celler og celle debris ved filtrering gennem et 0,45 µm filter, steril polyethersulfone (PES). Overførsel til en sterile 1,5 mL polypropylen reaktion tube. Udføre virus arbejde i en celle kultur hætte og sikrer ingen levende virus forlader den indesluttede miljø.
  2. Transduktion og udvalg af NIS-FP udtrykker kræft cellelinjer
    1. Brug ren frisk virus fra trin 1.1.3 blandes 1:1 (v/v) med optimal vækstmediet i hver cancer cellelinie (DMEM for MDA-MB-231 celler og RPMI 1640 for 4T1 celler, se materialer tabel for medierne sammensætning). Udføre transduktion i en celle kultur hætte.
      Bemærk: En mere generel protokol er omhandlet i supplerende oplysninger.
    2. Transduce kræftceller med virus indeholdende medium i en inkubator med fugtig atmosfære indeholdende 5% (v/v) CO2 ved 37 ° C i 72 h (arbejde på 6-godt eller 12-godt skala ved hjælp af 1 mL eller 0,4 mL af virus blanding fra trin 1.2.1).
    3. Overvåge mål celle NIS-FP udtryk ved Fluorescens mikroskopi.
    4. Udvide med held transduced celler til en skala af 3-10 millioner celler ved hjælp af standard kultur betingelser (Se ATCC for MDA-MB-231 og 4T1 cellelinier).
    5. Bruge fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til at rense NIS-FP udtrykker celler fra ikke-transduced celler.
      Bemærk: FACS kan være en kilde til mycoplasma infektioner; Det anbefales at tjekke for mycoplasma før virus produktion og transduktion men også efter FACS og før trin 1.3.
  3. Karakterisering NIS-FP udtrykker kræft cellelinjer
    1. Bekræfte reporter udtryk af standard flowcytometri som beskrevet andetsteds28.
    2. Bekræfte reporter integritet af standard immunoblotting som beskrevet andetsteds29.
    3. Analysere intracellulære fusion reporter lokalisering af Konfokal Fluorescens mikroskopi.
      Bemærk: Farvning med eller co udtryk af et plasma membran markør6 og efterfølgende Co lokalisering analyse30 vil lette dette trin.
    4. Analysere radiotracer optagelse i NIS-FP udtrykker cellelinjer.
      Bemærk: Alle radioaktive NIS substrat kompatibel med eksisterende udstyr er egnede, fx Iodid isotoper (123jeg-, 124jeg-, 125jeg-, 131jeg-), 99 m TcO4-, 188ReO4-, [18F] så3F- eller [18F] BF4-.
      1. Frø 106 renset celler i 6-godt plader i deres optimale vækstmediet (se tabel af materialer) en dag forud for forsøget. Forberede alle prøverne i tre eksemplarer og omfatte kontrolprøver: (i) "specificitet kontrol", dvs. NIS-FP udtrykker celler pre inkuberes med en konkurrencedygtig NIS substrat til at teste optagelsen specificitet; (ii) "forældrenes celle kontrol", dvs celler ikke udtrykker NIS-FP men modtager radiotracer for at teste basal anvendelse i Forældrekontrol celler.
      2. Den næste morgen, vaske cellerne en gang med serumfrit vækstmediet.
      3. Inkuber celler i serumfrit vækstmediet 50 kBq 99 mTcO4- eller [18F] BF4- i 30 minutter ved 37 ° C (1 mL samlede volumen). For specificitet kontrol, præ Inkuber celler i 30 min med konkurrencedygtige substrat NaClO4- (12,5 µM endelige koncentration). Holde den konkurrencedygtige substratkoncentrationen konstant gennem hele eksperimentet.
      4. Indsamle supernatanten og overføre 100 µL til en forberedt collection tube mærket "supernatanten".
      5. Cellerne vaskes to gange med 1 mL iskold phosphat bufferet saltvand (PBS) indeholdende Ca2 +/Mg2 +. Indsamle hver vaskeopløsning og overføre 100 µL af hver i en rede collection tube mærket "wash1" eller "wash2", henholdsvis.
      6. Løft cellerne ved at tilføje 500 µL PBS indeholdende 0,25% (w/v) trypsin og 0,53 mM EDTA, og inkubere ved 37 ° C, indtil cellerne frigøre (check visuelt ved hjælp af et mikroskop). Overføre suspension i en rede collection tube mærket "celler". Brøndene vaskes med 500 µL iskold PBS indeholdende Ca2 +/Mg2 + og tilføje til tube "celler". Sammenpresse cellerne ved centrifugering (250 x g, 4 min., 4 ° C).
      7. Tælle alle fire prøve typer fra hver brønd med en gamma counter korrekt indstillet for radioisotop valg (her: 99 mTc eller 18F).
        Bemærk: På grund af det store antal stikprøver i denne analyse, er det anbefales at bruge en automatiseret γ-counter habil i automatisk henfald korrektion.
      8. Analysere data ved at addere opnåede gamma tællinger af prøver fra hver brønd til at bestemme en samlet radioaktivitet tæller pr. brønd.
        Bemærk: tage aliquoting i trin 1.3.4.4 og 1.3.4.5 i betragtning af multiplikation numre af 10 for "supernatanten", og "vaske" fraktioner.
      9. Express cellulære radiotracer optagelse som % optagelse som angivet i Equ.1. Beregne gennemsnit og standardafvigelser fra tredobbelt eksperimenter.
        Equation 1(Equ.1)
        Bemærk: Her, reporter validering eksperimenter er beskrevet, men ikke-reporter-relaterede cellulære funktioner (fx spredning, kræft celle invasion, genekspression osv.) er i sidste ende programspecifikke og ansvar for hver bruger.

2. etablering af i vivo tumor modeller

  1. Brug kun fuldt karakteriseret og validerede celler i vivo undersøgelser. Kontrollere fluorescens af celler inden indgift af enhver egnet teknik (fx Fluorescens mikroskopi, flowcytometri) hver gang.
  2. Etablere tumor model i 5-6 uger gammel unge voksne hunmus. Bruge BALB/cAnNCrl eller BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (BALB/c nøgen) mus for 4T1 tumor model og hilsen. CG-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ (NSG) mus for MDA-MB-231-baserede tumor model. Barbere dyr lokalt og bruge aseptisk teknik. Direkte injicere 50 µL af en opslaemning indeholdende 106 NIS-FP udtrykker kræft celler/mL i den mammary fedt pad mellem fjerde og femte brystvorten31.
    Bemærk: For at forbedre injektion nøjagtighed, anbefales udfører indsprøjtning under generel anæstesi ved hjælp af en inhalerbar narkose som isofluran (1-2% (v/v) i O2).
    Bemærk: Kirurgisk implantation af tumoren stykker fra NIS-FP udtrykker tumorer er en alternativ tilgang til tumor model etablering31.
  3. Kontrollere fluorescens af celler på injektionssteder efter administration og i de tidlige dage post injektion. Bruge et fluorescens fakkel og filter glas egnet til FP valg.
  4. Overvåge tumorvækst og kontrollere for eventuelle kliniske symptomer (især på senere tidspunkter).
    Bemærk: For overfladiske tumorer, dvs orthotopic bryst tumorer i denne protokol, brug calipers og formlen for den gennemsnitlige tumor diameter (MTD) = ½· (L + W) 32.

3. fremstilling af [18 F] BF 4- ved hjælp af en automatiseret radiotracer syntese (ARS) platform.

Bemærk: Her, automatiske [18F] BF4- syntese baseret på metoden af 18F tilføjelse til bortrifluorid er beskrevet. Brugere af en mere bredt tilgængelige ARS platform (se tabel af materialer), kan downloade den tilsvarende Extensible Markup Language (XML)-fil kræves for at køre den automatiske sekvens på denne platform (supplerende fil). En detaljeret forklaring af kassette layout vist i figur 1 er fastsat i (tabel 1) samt en detaljeret beskrivelse af hvert trin i filen XML-sekvens (tabel 2) til at understøtte oversættelse til nogen anden automatiseret platform.

  1. Oprette ARS platform som beskrevet i tabel 1 og sikre, at det er operationelt med den korrekte XML-fil indlæst på kontrol computer. Sikre ARS platform er placeret i en kemisk hood egnet til sikkert arbejde med GBq mængder af radioaktivitet.
  2. Opsug den cyclotron-produceret [18F] F- (typisk 1,5-2 GBq i 2-7 mL [18O] H2O) via inlet reservoir (V6).
  3. Fælde radioaktivitet på en anion ionbytteren (fx kvaternære ammonium anion exchange patron; V5 til V4), genoprette [18O] H2O i en separat hætteglas (V1).
  4. Elueres [18F] F- (omvendt eluering, V5 til V4) ind i reaktoren (V8) med 750 µL af 0,9% (w/v) saltopløsning (V2), efterfulgt af 1,5 mL acetonitril (V16).
  5. Fjerne vandet af azeotropic fordampning under vakuum og kvælstof flow ved opvarmning til 105 ° C og derefter 120 ° C i 5 min.
  6. Reducere reaktor temperatur til 80 ° C.
  7. Tilføje 800 µL af 15-krone-5 i vandfri acetonitril (46 mg, 0.21 mmol) til tørt [18F] F- gennem den centrale havn af reaktor (V8).
  8. Tilføje 850 µL af BF3. OEt2 i vandfri acetonitril (0.16 mg, 1.13 µmol) til reaktoren.
  9. Reagere i 5 min mens vender tilbage til stuetemperatur.
  10. Passere reaktionsblandingen gennem en aluminiumoxid patron (V17 til V18) til at fælde trifluoroborate.
  11. Returnere reaktionsblandingen til at sprøjte S2 og fortyndes med vand (ca. 1,6 mL).
  12. Passere reaktionsblandingen gennem en anden anion exchange patron (V19 til V20) til at fælde [18F] BF4- produkt.
  13. Vask reaktor med vand (ca. 5,5 mL).
  14. Passere den resulterende løsning gennem aluminiumoxid og anden anion exchange patroner.
  15. Skyl sprøjter S2 og S3 med vand.
  16. Vask den anden anion exchange patron med vand og tør det med nitrogen gas.
  17. Elueres produktet (V19 til V20) med 1 mL 0,9% NaCl (V14) ind i sprøjten S3.
  18. Overføre produkt (400-500 µL) via linjen outlet (V21) til en 1 mL hætteglas samling.
    Bemærk: Molar aktivitet er et vigtigt aspekt af hver radiotracer. Men dens rutinemæssig bestemmelse er ikke kun tidskrævende men også kræver betydelige mængder af frisk syntetiserede [18F] BF4-, således at det bliver en begrænsende faktor for antallet dyr, der kan være afbildet. At teste reproducerbarhed og kindtand aktiviteter af resulterende [18F] BF4-, anbefales det at planlægge et par dedikerede prøvekørsler til dette formål. For flere detaljer om aktiviteter, kindtand, henvises til afsnittet diskussion.

4. in vivo billeddannelse af NIS-FP udtrykker celler ved nanoPET/CT

  1. Animalske forberedelse
    1. Bedøver mus med 1,5-2,0% (v/v) isofluran i O2 på en gennemstrømningshastighed på 1,0-1,5 L/min i en induktion kammer. Hen til indskrive nemlig tilstrækkelig anæstesi look for fravær af den pedal refleks.
    2. Sørge for at anvende vet salve på dyrs øjne til at forhindre tørhed under anæstesi
    3. Flyt musen på en varmepude med næsen i en bedøvende levering maske og varm halen (f.eks. ved at dyppe det i 37 ° C vand eller ved hjælp af en infrarød lys lampe).
    4. Fortynd den frisklavede sterile-filtreret [18F] BF4- løsning 5 MBq pr. 50 µL med 0,9% sterilt saltvand.
    5. Ved hjælp af en sprøjte, der er tilsluttet en kanyle (måler 29-31), tegne 100 µL af opløsningen [18F] BF4- , måling af radioaktivitet i sprøjten og Bemærk værdien og tidspunktet for målingen.
    6. Intravenøst administrere 50 µL af opløsningen [18F] BF4- i pre varmede hale vene.
    7. Måle den resterende radioaktivitet i sprøjten og noter værdien og tidspunktet for målingen. Forskellen mellem værdier, der måles på trin 4.1.7 og 4.1.5 er den injicerede dosis (ID).
    8. Indstille en timer til at tælle ned fra 45 min (starttidspunkt for PET imaging = 0 min).
    9. Placer musen på sengen af nanoPET/CT-scanneren og sikre bedøvelsesmiddel levering er korrekt tilknyttet igen.
    10. Check anæstesi forbliver fuldstændig ved at teste for fravær af den pedal refleks.
    11. Sikre, at musen er placeret på sengen i den ønskede måde, fx "sphinx"-som stilling.
    12. Installere dyr overvågningsudstyr ifølge producentens anbefalinger, fx en rektal temperatur sonde, en sonde måling dyr vejrtrækning eller elektroder til optagelse elektrokardiogrammer. Kontrollere den rette funktion af alle instrumenter.
      Bemærk: For in vivo specificitet tests med NIS radiotracer [18F] BF4-, dyr er afbildet som beskrevet ovenfor, og derefter hvilede vågen indtil radioaktivitet er henfaldet tilstrækkeligt for at blive betragtet som ubetydelig, f.eks. 48 timer senere, da kun 1.3·106% resterende 18F radioaktivitet vil være til stede i dyret. I den efterfølgende imaging session, konkurrencedygtige substratet ClO4- gives i en dosis på 200 mg/kg 30 min før radiotracer administration og billedbehandling er udført som beskrevet ovenfor.
  2. Billedbehandling af nanoPET/CT
    1. Indstille de ønskede CT billeddannelse parametre, fx ved hjælp af nanoPET/CT 55 kVp tube spænding, indstille eksponeringstiden til 1200 ms med one-grad vinklet stepping og 180 graders fremskrivninger.
    2. Angiv parametre for PET billede erhvervelse. Brug statiske Skan PET parametre med en varighed på 30 min., 1:5 tilfældighed tilstand og 400-600 keVp energi vindue.
    3. På nedtællingstid = 15 min start CT image erhvervelse.
    4. På nedtællingstid = 0 min start PET billede erhvervelse.
      1. Hvis serie dyr imaging er tilbagesøge påkrævet, lad dyr fuldt anæstesi, dvs genvinde bevidsthed under tilsyn. Derefter, overføre dem til en vedligeholdelse enhed.
      2. Hvis dette er terminalen imaging session, lade dyr eutanasi ved enten bedøvelse overdosis, stigende koncentration af kuldioxid, eller dislokation af halsen.

5. in vivo dataanalyse

  1. Rekonstruere den PET/CT data ved hjælp af en Monte Carlo-baserede fuld 3D iterativ algoritme. Sikre, at rettelser for dæmpning, dødtiden og radioisotop henfald betragtes. For detaljer henvises til fabrikantens anvisninger af PET/CT instrument i anvendelse.
  2. Check CT og PET billeder registreres korrekt Co og gemme data i en egnet exchange format såsom "Digital Imaging and Communications in Medicine" (DICOM).
  3. Analysere billeder
    1. Indlæse de rekonstruerede DICOM-filer i et passende billede analyse software, der giver mulighed for anerkendelse og afgrænsning af regioner af interesse (ROIs) og efterfølgende PET signal kvantificering i disse ROIs.
    2. Segmentere ROIs bruger manuel eller adaptive tærskel til at definere ROIs33,34 ved hjælp af en egnet softwarepakke. Anatomiske billedinformation fra CT-scanning hjælper guide ROI tildeling, fx overfladiske tumorer eller lunge diskenheder.
    3. Brug analyse software ifølge producentens anvisninger og sikre, at data er kalibreret til injiceret radioaktivitet dosis og korrigeret for dæmpning og radioaktivt henfald.
  4. Tegne grafer viser data fra dette i vivo kvantificering. Express-data som enten procent injiceres dosis/volumen (%ID/mL) eller standard optagelse værdi (SUV), som er en alternativ foranstaltning i betragtning af radioaktivitet i hele kroppen af emnet.
    1. Beregn %ID/g værdier idet væv massefylde forudsættes at være som vand, dvs ~ 1 g/L. Det er bemærkelsesværdigt, at denne antagelse kan være ugyldige for organer med væsentligt forskellige tætheder, såsom lunge eller knogle.
    2. Beregne forskellige SUV'er for at vurdere de sande SUV (fx. SUVmean, SUVmax); SUVmax er mere pålidelige for små genstande og bruges oftere end SUVmean35.

6. ex vivo analyser

Udføre de angivne downstream analyser: a fluorescens billeddannelse af organer, der indeholder fluorescerende kræftceller (primær tumor og metastaser) under animalske dissektion, (ii) måling af radiotracer væv distribution, og (iii) histologisk eller (iv) cytometric vurdering af kræft organer.

  1. Måling af radiotracer distribution af γ-optælling (ex vivo biodistribution) og ex vivo fluorescens billeddannelse af kræft væv.
    1. Måle radioaktivitet af den hele døde dyr og noter værdien og tid.
    2. Dissekere dyr og høste følgende væv: lunge, hjerte, blod (ved hjælp af 20 mm glas kapillærer), lever, mave, nyrer, milt, små og store tarme, skjoldbruskkirtlen og spytkirtler, et stykke af muskel fra benet, og knoglen af de bageste lårben, og relevante og dissectible lymfeknuder og kræft væv.
    3. Måle radioaktivitet af den resterende slagtet først herunder så eksklusive halen og Bemærk værdierne og tidspunkter for måling.
      Bemærk: Radioaktivitet i halen kan betragtes som stammer fra radiotracer, der var mis injiceres og dermed nåede ikke omsætning; Dette beløb af radiotracer derfor ikke bidrager til den injicerede dosis. Hale radioaktivitet fungerer også som en retrospektiv parameter af injektion kvalitet.
    4. Veje alle væv (brug pre vejes rør).
    5. Tage fotografier af kræft organer, i dagslys og under fluorescens lys.
      Bemærk: Brug et kamera stativ til at holde afstand mellem kameralinsen og orgel konstant (eller bruge en dedikeret kommercielle instrument til dette formål).
    6. Integrere organer/væv beregnet til downstream histologi i OCT eller nedsænke dem i formalin til fiksering. Prøveforberedelse kan afviger for andre downstream applikationer.
    7. Forberede radiotracer Kalibreringsstandarder i dublerede, fx 0 til 1000 kBq [18F] BF4-.
      Bemærk: Kalibreringsstandarder er forpligtet til at (i) vedrører radioaktivitet værdier (i kBq) til de målte tæller pr. min, og (ii) forenkle henfald korrektion; 18 F- kan erstatte [18F] BF4-.
    8. Tælle alle høstede væv ved hjælp af en γ-tæller sammen med radioaktivitet Kalibreringsstandarder fra trin 6.1.7 radioaktivitet. Bemærk målingen. Hvis tæller satser er for høje (dvs. uden for lineariteten af kalibrering standard eller angivet ved for høj detektor døde gange), re tælle prøver to radiotracer halveringstid senere.
    9. Præsentere data enten som %ID/g eller standard optagelse værdier (SUV) (Equ.2).
      SUV = Equation 2 (Equ.2)
    10. Kassér alle høstede væv, der ikke er påkrævet for videre downstream analyse efter lokale affaldshåndtering regler.
  2. Analysere kræft væv ved flowcytometri eller histologi efter brugerens præferencer og standard protokoller (som beskrevet andetsteds3,6,28).

Representative Results

Det første skridt kræver genteknologi af kræftceller af interesse. Her, resultaterne af lentiviral transduktion af metastatisk murine inflammatorisk 4T1 brystkræftceller og menneskelige metastatisk MDA-MB-231 celler med lentivirus partikler transporterer DNA kodning enten NIS-normal god landbrugspraksis eller NIS-RFP er vist. Transduktion effektivitetsgevinster varierede mellem kræft cellelinjer (figur 2A, venstre kolonne). Men alle resulterende transduced kræftcelle linjer blev udvalgt af FACS til renhed (figur 2A, højre). Konfokal Fluorescens mikroskopi (figur 2B) viste korrekte plasmamembran lokalisering af NIS-FPs. NIS-FP funktion var kvantificeres ved hjælp af NIS-ydes radiotracer optagelse (figur 2 c-2E) og demonstreret NIS funktion og specificitet. Navnlig ingen væsentlige forskelle mellem 4T1. NIS-normal god landbrugspraksis og 4T1. NIS-RFP udtrykker cellelinjer med lignende NIS udtryk niveauer blev fundet (figur 2 c).

Efter fuld i vitro celle linje karakterisering, tumor modeller blev oprettet med de nyligt oprettede spores kræft cellelinjer. Som et eksempel, 4T1. NIS-normal god landbrugspraksis tumor model, en model for Inflammatorisk brystkræft, er vist her (figur 3). I tumor-bærende dyr langsgående hele kroppen PET imaging derefter informeret på tumor progression herunder metastatisk spredning (figur 3B). PET radiotracer [18F] BF4- var nødvendigt for billeddannelse og fremstillet frisk i morgen af hver PET imaging session. Syntese af [18F] BF4- blev udført ved hjælp af metoden beskrevet ARS. Typisk blev ~1.6 GBq 18F- brugt som input og opnået ~ 244 MBq [18F] BF4- i 40.5±3.9 min. (N = 17). Produktet blev analyseret af radio tyndtlagskromatografi eller ion kromatografi og viste en radiokemiske renhed 94.7±1.4%. Den radiokemiske udbytte var 19.4±4.0% (decay-korrigeret).

Dag 19 efter tumor podning, den primære tumor var klart identificeret ved hjælp af PET, men fandt ingen metastaser. Ti dage senere (dag 29), de samme tumor-bærende mus blev igen afbildet og fjern metastaser på forskellige steder i alle dyr (lunge metastase, metastaser til forskellige lyskebrok og/eller aksil lymfeknuder) blev identificeret. Eksemplet i figur 3 viste omfattende lunge metastaser med flere klart identificerbare og kvantificerbare knuder i lungerne (figur 3B-3E). Derudover dyret præsenteret med regionale spredning af svulsten til peritoneal væg samt metastaser til den lyskelymfeknuder og begge aksil lymfeknuder. % Id-værdier for individuelle metastaser i lungerne (figur 3E) afveg bredt, men det gjorde de besatte bind af de underliggende metastatisk knuder. Derimod var volumen-normaliserede %ID/mL værdier (figur 3E) langt mere ensartet. Dette var forståelig for forskellige metastaser på lignende udvikling stadier (dvs. udviklet mellem dage 19 og 29; Figur 3B). I modsætning, var den normaliserede %ID/mL værdi for den primære tumor lavere end for lungemetastaser, som er i overensstemmelse med en tumor masse, der havde mere tid til at gøre fremskridt og remodel, herunder tilstrømningen af andre celletyper (stromale celler, immunceller) , især i denne model af Inflammatorisk brystkræft.

Styret af i vivo billeder og fluorescens af kræftceller (synlig under animalske dissektion under fluorescens lys), lille dybtliggende organer såsom lymfeknuder var pålideligt høstet og på samme tid, vurderet for kræft knude indhold ( Figur 4A). Mens fluorescens signal under animalske dissektion var betegnende for tumor celle tilstedeværelse, var det vigtigt at sikre denne klassificering blev ledsaget af ex vivo radioaktivitet målinger af de høstede væv. Figur 4B viser de standard optagelse (SUV) opnåede værdier for de forskellige væv på tværs af en kohorte af tre dyr, som alle præsenteres med metastaser. Endogent NIS-udtrykker organer såsom skjoldbruskkirtlen og spytkirtler (høstet kombineret) eller maven viste også den forventede høje radiotracer udbredelse. Desuden, denne NIS-FP tilgang tilladt ligetil kræft celle identifikation under histologi (figur 4 c). Denne immunofluorescens histologi eksempeldata viste tumor vascularization i 4T1. NIS-normal god landbrugspraksis tumor model. Denne data viste også, at NIS-normal god landbrugspraksis reporter opholdt sig overvejende i plasma membraner af tumor celler også i vivo (figur 4 c), derved validering optagelse resultater.

Figure 1
Figur 1. Ordningen beskriver opsætning af automatiserede radiotracer syntese platform for produktion af [18F] BF4- via metoden fluor-18-til-bortrifluorid tilføjelsen. Reagensnavne er trykt på de respektive rør i ordningen. QMA er forkortelsen for kvaternære ammonium anion exchange, og indikerer, at den anvendte fast-fase kromatografisk separation materiale. Yderligere oplysninger findes i tabel 1 og 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Typiske karakterisering resultaterne af kræft cellelinjer stabilt udtrykker NIS-normal god landbrugspraksis eller NIS-RFP. (A) de angivne cellelinjer blev foretaget ved hjælp af lentiviruses overførsel enten NIS-normal god landbrugspraksis eller NIS-RFP. Venstre kolonne viser den transduced befolkning (grøn eller rød fluorescerende) i forhold til de respektive forældre celler (grå; 4T1 og MDA-MB-231 celler, henholdsvis). Procenter Vis transduktion effektivitetsfordele som bestemt ved flowcytometri. Den højre kolonne viser resultaterne af flow cytometric analyser efter FACS rensning af de blandede befolkninger i venstre kolonne. Alle cellelinjer fandtes for at være > 99% rent for angivne NIS-udtrykker celler (ved flowcytometri). (B) Konfokal Fluorescens mikroskopi af renset cellelinjer viser plasmamembran lokalisering af NIS-normal god landbrugspraksis eller NIS-RFP i de respektive cellelinjer. WGA-Alexa633 blev brugt som plasma membran markør. (C, D) Funktionelle validering af NIS-FP protein udtrykt i den angivne nyligt genererede kræft cellelinjer. NIS funktion blev målt ved hjælp af radiotracer 99 mTcO4- (50 kBq pr. million celler). Som kontrol, blev forældrenes celler brugt samt fusion reporter udtrykker celler, der blev behandlet med NIS Co substrat perchlorat før og under analysen (specificitet kontrol). Resultater klart viser NIS-FP funktion og specificitet i alle cellelinjer. (E) funktionelle validering af 4T1. NIS-FP cellelinjer bruger [18F] BF4- som en radiotracer for NIS. Alle andre betingelser var identiske med (C). Vigtigere, begrunde meget ens relative optagelse resultater blev opnået for både 4T1-afledte cellelinjer med begge radiotracers (figur 2 c og E), derved udskiftelige brugen af både for in vitro- funktionelle karakterisering af NIS-FP udtrykker cellelinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Repræsentativt resultat af metastaser sporing af [18F] BF4--PET/CT billeddannelse i musen forsynet med en 4T1. NIS-normal god landbrugspraksis tumor. (A) en million 4T1. NIS-NGL celler blev injiceret ind i de mammary fedtpuder af 5-6 uger gamle BALB/c CanN.Cg-Foxn1nu/Crl mus og tumorvækst blev fulgt over tid ved hjælp af calipre. På grund af normal god landbrugspraksis fluorescens af kræftceller var rå visuelle identifikation/vækst vurdering også muligt ved hjælp af et fluorescens fakkel og passende filter briller (Se indsatser). (B/venstre) På dag 19 post tumor podning, var den primære tumor (gul stiplet linje) klart identificeret, men ingen metastaser. Billedet præsenteret er en maksimal intensitet projektion (MIP) af PET billede. Endogene NIS signaler (hvid deskriptorer) blev også registreret, dvs skjoldbruskkirtlen og spytkirtler (Th + SG), mave (S), og på et meget lavt niveau, nogle dele af brystkirtler og lachrymal kirtler. Blære (B) signal stammer fra tracer udskillelse. (B/højre) På dag 29 indlæg tumor podning, metastase var klart identificeret: flere metastaser i lungerne (gul stiplede linje) samt metastatiske lymfeknuder (ILN, AxLN, gul pilespidser). Billedet præsenteret er en Mindsteimportpris af PET/CT-billede. Den primære tumor (gul stiplet linje) voksede ikke kun i en kugleformede form på dette tidspunkt, men også havde invaderet ind i peritoneal væggen. (C) en 3D gennemførelsen af Otsu tærskel teknik aktiveret 3D overflade rendering af kræft væv; disse er overlejret på en PET MIP. Lungemetastaser er vist i hvid, metastatisk aksil lymfeknuder i rød, metastatisk ingvinal lymfeknude i gul og den primære tumor, der invaderede ind i peritoneal væggen i turkis. (D) en blow-up billede af PET/CT MIP (B/højre) til at angive individuelle lungemetastaser. (E) Radiotracer optagelse i kræft væv var kvantificeres fra 3D billeder (% ID) og normaliseret af deres respektive mængder (%ID/mL). Enkelte lungemetastaser svarer til nummereringen i (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Typiske eksempler på ex vivo -data tilgængelige fra NIS-FP tumor-bærende mus. (A) væv høst for downstream analyser, de fluorescerende egenskaber af NIS-FP udtrykker tumorceller fungerede som indikator vejlede animalske dissektion. Som eksemplarer, væv fra dyr i figur 3, er dvs lunge med flere metastatisk læsioner og to positive lymfeknuder vist. Dagslys fotografering samt fluorescens billeder vises. Fluorescens billeder blev taget med samme kamera som dagslys billeder men under blå lys excitation (450±10 nm bandpass filter) med en grøn emission filter (530±30 nm bandpass filter) placeret foran kameralinsen. (B) fordeling af radiotracer i forskellige organer ('biodistribution') af dyr med 4T1. NIS-normal god landbrugspraksis tumorer (N = 3, dag 29 indlæg tumor podning, 5 MBq [18F] BF4-). Standard optagelse værdier (SUV) blev beregnet og værdier > 1 angiver specifikke ophobning af radiotracer i de respektive organer. Dataene viser specifikke radiotracer optagelse i kræft væv, dvs primær tumor, metastatiske lymfeknuder (som identificeret af imaging og dissektion under fluorescens lys), lunge (blev dissekeret som helhed uden at adskille enkelte metastaser), samt organer udtrykker endogent NIS, dvs skjoldbruskkirtlen og spytkirtler og mave. (C) immunofluorescens histologi af den primære tumor fra samme mus som vist i figur 3. Den primære tumor blev høstet, indlejret i OLT og frosset før sektioneret (10 µm) og forarbejdet til farvning. NIS-normal god landbrugspraksis udtrykker kræftceller identificeredes direkte uden brug af antistoffarvning. Blodkar var farves med en kanin antistof mod mus PECAM-1/CD31 (2 µg/mL) og en Cy5-konjugeret gede anti-kanin sekundær antistof. Kerner blev farves med 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 µg/mL) og stikprøven monteres i poly (vinylalkohol - vinylacetat) indeholdende 2,5% (w/v) Dabco som en antifade. Konfokal billeder blev opnået ved hjælp af en Konfokal mikroskop med indstillinger er relevant for 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, normal god landbrugspraksis og Cy5. Disse eksempeldata viser klart, at 4T1. NIS-normal god landbrugspraksis tumor er vaskulariserede men også denne vascularization adskiller sig i dens omfang (jf. øverste venstre med bunden midten). Det viser også, at NIS-normal god landbrugspraksis reporter overvejende bosat i plasma membraner i tumor celler vivo (indsat), derved validering af in vitro- uptake resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

FASTlab mangfoldige ventil Reagens, opløsningsmiddel, patron eller slange * Detaljer
V1 Silikoneslanger [18O] H2O affald flaske 14 cm
V2 0,9% NaCl opløsning, 750 µL 11 mm hætteglas
V3 Sprøjte S1 1 mL
V4 anion exchange patron C1, pre aircondition med 1 M NaCl (10 mL) og H2O (10 mL) f.eks. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus lys (farvande, kat. Lol WAT023525)
V5 Silikoneslanger til anion exchange patron C1 14 cm
V6 [18O] H2O /18F inlet reservoir Max 5 mL
V7 Silikoneslanger til reaktortanken (venstre side, gas inlet) 14 cm
V8 Silikoneslanger til reaktortanken (central havn, flydende indløb/udløb) 14 cm
V9 Lukket
V10 Lukket
V11 Sprøjte S2 5 mL
V12 15-krone-5, 46 mg i 800 µL MeCN 11 mm hætteglas
V13 Trifluoroborate diethyletheren etherate, 0,14 µL i 850 µL MeCN (fortyndet 14 µL af BF3. OEt2 med 1 mL MeCN. Fortyndet 10 µL af denne løsning til 850 µL med MeCN). 13 mm hætteglas
V14 0,9% NaCl opløsning, 1 mL 13 mm hætteglas
V15 Vand taske spike
V16 Acetonitril (MeCN), 1,5 mL 13 mm hætteglas
V17 Silikoneslanger til aluminiumoxid neutral patron C2 14 cm
V18 Alumina neutral patron C2, pre aircondition med H2O (10 mL), acetone (10 mL) og luft (20 mL) f.eks. Sep-Pak Alumina N Plus lys (farvande, kat. Lol WAT023561)
V19 Silikoneslanger til anion exchange patron C3 14 cm
V20 anion exchange patron C3, pre aircondition med 1 M NaCl (10 mL) og H2O (10 mL) f.eks. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus lys (farvande, kat. Lol WAT023525)
T2S Silikoneslanger til samling hætteglas 40 cm
V22 Lukket
V23 Lukket
V24 Sprøjte S3 5 mL
V25 Silikoneslanger til reaktortanken (højre side, vakuum port) 40 cm
* Bemærk: På grund af de plast pigge, dødvolumen for 11 mm hætteglas og 13 mm hætteglas er ca. 0,35 mL og 0,4 mL, henholdsvis. Derfor, de faktiske beløb af reagenser overført til reaktoren er lidt anderledes. Alle mængder, der er angivet i denne metode henviser til de faktiske beløb indført i hvert reagens hætteglas.

Tabel 1. Beskrivelse af kassette layout for automatiseret [18F] BF4- syntese via metoden fluor-18-til-bortrifluorid tilsætning (jf. figur 1).

Sekvens trin Kommentar
[1 - 2] Presse systemet og Indfældet manifold med N2
[3-15] Skyl sprøjte S3 to gange med H2O (V15), Indfældet manifold med N2
[16-23] Presse reagens hætteglas i positionerne V16, V14, V13 og V12, rødmen manifold med N2 mellem hvert hætteglas
[24-26] Åbne aktivitet inlet (V6)
Tilslut hætteglasset indeholdende 18F. Hvis den samlede mængde er > 5 mL, kun indsætte nålen halvvejs i hætteglasset før du fortsætter.
[27-39] Lukke aktivitet inlet (V6), fælde 18F i QMA patron C1 (V5), indsamle [18O] H2O i affald flasken (V1). Hvis den samlede mængde er > 5 mL, pause sekvens på løntrin 37, vende tilbage til trin 26, fuldt indsætte nålen ind i hætteglasset indeholdende 18F, og genoptage processen.
[40] Luk [18O] H2O affald flaske (V1), Indfældet manifold med N2
[41] Presse elueringsvæsken hætteglasset i position V2
[42-44] Åben reaktor ventil V8, aspirat elueringsvæsken fra V2 til sprøjte S1
[45-50] Elueres QMA patron C1 reaktoren (V8) ved hjælp af saltvand fra sprøjten S1, Indstil reaktor temperaturen til 90 ° C
[51] Skyl QMA patron C1 med N2 og hæve temperaturen i reaktoren til 105 ° C
[52-53] Drage V16 acetonitril ind sprøjten S2
[54-57] Overføre acetonitril fra sprøjten S2 til reaktor (V8)
[58-60] Varme i reaktoren ved 120 ° C i 5 min. fordampe opløsningsmiddel med en strøm af N2 til reaktor (V7).
[61-65] Indstil temperaturen til 105 ° C, tør sprøjte S1 med N2
[66-69] Trække 15-krone-5 løsning fra V13 ind i sprøjten S2, hæve temperaturen i reaktoren til 120 ° C
[70-71] Reducere temperaturen til 105 ° C, skyl manifold med N2
[72] Køle reaktoren (sæt temperaturen til 40 ° C) i 5 min
[73-78] Indstil reaktor temperaturen til 80 ° C, 15-krone-5 opløsning overføres fra sprøjten S2 til reaktor (V8)
[79-81] Tegne BF3. OEt2 løsning fra V14 ind sprøjten S2
[82-87] Overføre BF3. OEt2 løsning fra sprøjten S2 reaktor (V8), skyl linjen reaktor med N2
[88] Indfældet manifold med N2
[89] Reagere i 5 min, lad temperaturen, vende tilbage til RT
[90-95] Overføre reaktionsblandingen (V8) til sprøjte S2
[96-104] Passere reaktionsblandingen gennem Alumina N patron C2, ind i sprøjten S3
[105] Indfældet manifold med N2
[106-109] Returnere reaktionsblandingen til at sprøjte S2
[110-112] Tomme sprøjte S3, trække H2O (V15) ind i sprøjten S2 til at fortynde reaktionsblandingen
[113-115] Indlæse reaktionsblanding på QMA patron C3
[116-118] Trække H2O (V15) ind i sprøjten S2
[119-124] Skyl reaktor (V8) med H2O fra sprøjten S2, Opsug vask i sprøjten S2
[125-128] Passere vask gennem patroner C2 og C3
[129-130] Tør patronerne og manifold med N2
[131-136] Vask sprøjten S1 med H2O (V15)
[137-142] Vask sprøjten S2 med H2O (V15)
[143] Indfældet manifold med N2
[144-147] Trække H2O (V15) ind i sprøjten S2
[148-151] Skylle QMA patron C3 med H2O fra sprøjten S2
[152-153] Tørre QMA patron C3 med N2 og Indfældet manifold med N2
[154-157] Elueres QMA patron C3 med 0,9% NaCl (V14) ind i sprøjten S3
[158-161] Overføre produktet fra sprøjten S3 til samling hætteglas (V21)
[162-163] Flush QMA patron C3 med N2 til samling hætteglas (V21)
[164-166] Indfældet manifold med N2
[167-170] Flush patroner C2 og C3 (at spilde flaske) og manifold med N2
[171] Skyl samling slanger (V21) med N2

Tabel 2. Beskrivelse af trinene i filen XML-sekvens.

Discussion

Det første skridt til at gengive kræft celler kan spores i vivo ved denne metode kræver engineering dem for at udtrykke NIS-FP fusion reporter. Valget af de fluorescerende proteiner i fusion reporter er kritisk, da oligomerizing fluorescerende proteiner kan føre til kunstige reporter klyngedannelse, dermed negativt påvirker dens funktion. Vi har haft succes med dokumenteret monomere fluorescerende proteiner som mEGFP (med monomerizing mutationen A206K36,37), mTagRFP eller mCherry. NIS kan enten være af menneskelige eller museoprindelse (hNIS eller msNIS) afhængigt af formålet med forsøget, og kræft model. Transduktion effektivitet generelt varierer mellem forskellige kræft cellelinjer. Imidlertid er genereret kræft cellelinjer efterfølgende renset af FACS i denne protokol, hvilket reducerer behovet for at optimere transduktion betingelser. Transduktion med høj mangfoldighed af infektion er ikke altid tilrådeligt, da flere konstruere integration i genomet kan forventes at resultere i højere konstruere udtryk, men også i flere uønskede/ureguleret genom ændring. Det er derfor vigtigt at lade polyklonale transduced celler vokse til stabiliteten i udtrykket (overvåges ved flowcytometri) og undgå sortering de lyseste kloner kun af FACS. Det også gør funktionelle validering af ikke-reporter funktioner afgørende før disse celler skal bruges til i vivo eksperimenter. En nyligt udviklede alternativ til virale gen levering er gen redigering teknologi38, som tilbyder mere specifik kontrol over viral integration websteder. Udtrykket analyse ved flowcytometri og immunoblotting er vigtige. Flowcytometri giver mulighed for erhvervelse af befolkningen-baserede enkelt celledata, for eksempel at undersøge, om der er nogen drift i reporter udtryk niveauer over tid. Den bygger på FP gruppe kun, medmindre celler også farves med et antistof rettet mod overfladen eller samlede NIS. Flowcytometri informerer ikke om fusion reporter integritet. Derimod rapporter immunoblotting om integriteten af fusion reporter. Molekylevægt af NIS og FP skal føjes til at bestemme den forventede molekylvægt af den valgte NIS-FP. Konfokal Fluorescens mikroskopi demonstreret fusion reporter colocalization med plasma-membran markør hvedekim agglutinin i alle nyligt lavet cellelinjer. Dette var den forventede cellular placering for de fleste af protein og angivet en grønt lys milepæl for efterfølgende funktionelle validering. Hvis minimal/nej NIS-FP blev fundet på plasma membran (f.eks. kun i intern cellulære rum), dette ville betyde en celle biologiske problem med fusion reporter i denne cellelinje, eller en potentiel mutation af fusion reporter påvirker dens intracellulære handel. Det er bemærkelsesværdigt, at vi ikke har observeret en sådan i nogen af kræftceller vi testet indtil videre, som omfattede: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (menneskelige melanom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (human brystkræft); NCI-H1975 (human lungekræft); SK-Hep1 (human leverkræft); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (murine Inflammatorisk brystkræft); B16F0, B16F3, B16F10 (murine melanom); MTLn3 (rotte bryst adenocarcinom).

NIS funktion skal måles ved hjælp af optagelsen assays med radioaktivt NIS substrater. På grund af den SPECT radiotracer 99 mTcO4- at være generator-produceret og derfor bredt tilgængelige på hospitaler uden behov for nogen radiotracer syntese samt at have en mere bekvem længere halveringstid (6.01 h for 99 m TC i forhold til 110 min. 18F), vi brugte denne NIS substrat for rutinemæssig funktionelle validering af nye NIS-FP udtrykker cellelinjer. Pre blokering af NIS-udtrykker celler med NIS Co substrat natrium perchlorat resulterede i den forventede begrænsning/afskaffelse af radiotracer udbredelse, hvilket viser specificitet for radiotracer optagelse. Denne NIS specificitet test er en kritisk valideringstrinet. Hvis en NIS specificitet eksperiment ikke ville resultere i reducerede radiotracer optagelse svarende til de respektive forældre celler, der er opstået en teknisk fejl under eksperimentet, eller radiotracer udbredelse var ikke på grund af NIS. Det er også muligt at natrium perchlorat pre blokering reducerer radiotracer optagelse i en parental cellelinie; Dette ville identificere cellelinjer med endogene funktionelle NIS udtryk (fx stimuleret skjoldbruskkirtlen celler6).

En afgørende fordel ved denne billeddannelse protokol er at oplysninger er indsamlet i 3D og over tid. Dette giver mulighed for sammenligning af billeder fra de samme dyr over tid, hvilket giver parrede data og dermed overvinde de problemer forårsaget af indbyrdes animalske variabilitet. Dette er i kontrast med de fleste ikke-imaging relaterede metastase vurderingsmetoder, der er baseret på at ofre forskellige dyr på forskellige tidspunkter. Figur 3B er det tydeligt, hvordan metastatisk spredning og udvækst skred over tid i et bestemt dyr. Signaler registreres af PET/CT billeddannelse er fundamentalt forårsaget af NIS udtryk. Dette omfatter alle signaler fra NIS-udtrykker eksogent kræftceller og alle organer endogent udtrykker NIS. Typiske endogene NIS signaler er fundet i skjoldbruskkirtlen og spytkirtlerne, mavesækken, og på et lavt niveau i nogle dele af brystkirtler og lachrymal kirtler. Ud over endogene NIS udtryk, er NIS radiotracer [18F] BF4- også udskilles via nyrerne, dermed forklarer radiotracer optagelse i urin-fyldt blærer. Nyre optagelse er ikke længere kan påvises for den billeddiagnostiske tidspunkt anbefalet i denne protokol (45 min post radiotracer injektion6). Hvis signalerne fra urin-fyldt blærer bør føre til signal-til-baggrund spørgsmål, kan blæren tømmes mekanisk under anæstesi før billeddannelse. Vigtigere, kan de endogene signaler variere mellem dyr stammer. Det er også bemærkelsesværdigt at endogene NIS udtryk i mælkekirtlerne kan være højere under ammende betingelser10. I sagen præsenteres og i tilfælde af disse metastatisk cellelinjer held karakteriseret før (jf. ovenstående liste), fandt vi ikke endogene NIS udtryk væsentligt forstyrre metastase påvisning. Det er bemærkelsesværdigt, at [18F] BF4- er stadig mere tilgængelige for optagelse i kræft væv i forhold til Iodid, fordi Iodid metaboliseres i thyreoideahormoner6. Dette fænomen kan også bidrage til større mængder af radioiodide i blodet i forhold til [18F] BF4- 6. Til forskellige applikationer (kræftcelle sporing i andre kræftformer eller ikke-kræft celle registreringsprogrammer), dette kan være meget forskellig, og det anbefales derfor at vurdere, om endogene NIS udtryk er tilbøjelige til at give signal til baggrund problemer gennem foreløbige forsøg. Et vigtigt aspekt i prækliniske imaging er de molar aktivitet af radiotracer. Metoden beskrevet her bruger ~1.5 GBq 18F- som udgangspunkt materielle14 og har vist sig at producere kindtand aktiviteter betydeligt over de tidligere rapporterede substitution metode12. [18F] BF4- produceret på kindtand aktiviteter ≤1 GBq/µmol12 kan føre til nedsat optagelse i NIS-udtrykker væv. Dette er af særlig betydning, når den injiceres mængden af radioaktivitet pr. kilogram er høj, dvs når små dyr som mus er afbildet39; Det er mindre vigtigt i den menneskelige indstilling40. Stor kindtand aktiviteter er derfor bydende nødvendigt for høj kvalitet prækliniske PET billeddannelse. Kindtand aktiviteter fremstillet ved den boron trifluoride tilsætning metode14, som er vist i sin automatiseret form i denne protokol, overvinde dette problem. Desuden er det bemærkelsesværdigt, at den præsenterede protokol for [18F] BF4- syntese ikke er kompatibel med god fremstillingspraksis (GMP) og derfor uegnet til brug i humane kliniske forsøg i denne form. Et GMP-protokollen (via metoden 18F substitution til radiolabel BF4-) er tilgængelig andetsteds40.

PET/CT billeddannelse giver mulighed for visualisering af radiotracer udbredelse, som er vejledende for NIS-medieret radiotracer optagelse stammer fra NIS-FP udtrykker kræftceller. Endnu vigtigere, kan de tilknyttede PET signaler kvantificeres. Det er nødvendigt at anvende pålidelige tærskel procedurer for at sikre en ensartet og objektiv differentiering af relevante signaler fra enhver potentiel baggrund. Da baggrunden varierer i forskellige steder i vivo, er det vigtigt at overveje lokale/regionale tærskel og segmentering. En sådan metode blev udviklet af og opkaldt efter Otsu34, og dens 3D gennemførelse er ansat for 3D-gengivelse af den primære tumor og metastaser i denne protokol. Generelt svarer billede set observatøren visuelt bedst til kvantificerede % injiceres dosis (% ID) værdier. Som for image-baserede kvantificering er det også vigtigt at normalisere de målte radioaktivitet værdier af de forskellige væv til deres diskenheder. Der er to overvejende brugt måder at udtrykke normaliserede resultater, a % ID pr. volumen (f.eks. %ID/mL), og (ii) standard optagelse værdi (SUV35). De adskiller sig ved at %ID/mL tager hensyn til de enkelte bind kun, mens SUV er en foranstaltning, der er i forhold til den gennemsnitlige radioaktivitet på tværs af hele dyret. Det er også vigtigt at bemærke, at NIS imaging gengiver live tumor volumen (LTV) tilgængeligt, fordi død/døende celler ikke syntetisere ATP kan ikke længere importere radiotracer10. Dette forklarer det store lav-signal område inden for den primære tumor ("doughnut formet" tumor) angiver områder af tumor celle død/nekrose. Vigtigere, var LTV en langt mere pålidelig måling af tumor byrde i forhold til den rå tumor volumen tilgængeligt med skydelære målinger (som tager ikke hensyn levedygtighed og vurderer kun overfladisk tumor regioner).

En stor fordel ved denne dual-mode tracking strategi er indlysende, når hovedkød væv efter dyr nedslagtning. Styret af i vivo billeder og bistået af fluorescerende kræftceller under animalske dissektion, kan små og dybtliggende organer/metastaser også være pålideligt høstet. Frossen væv bevarelse/skæring metode giver mulighed for direkte fluorescens billeddannelse af normal god landbrugspraksis uden behov for farvning med et antistof, anti-normal god landbrugspraksis, men på bekostning af reduceret strukturelt væv bevarelse sammenlignet med formalin-fast paraffin-embedded metode (FFPE). Sidstnævnte kræver kritisk også anti-FP farvning, fordi metoden FFPE er uforenelig med intakt bevarelse af fluorescerende proteiner (på grund af fiksering/dehydrering/rehydrering). Mens fluorescens signal er vejledende af tumor celle tilstedeværelse, er det vigtigt at sikre denne klassificering er bekræftet af ex vivo radioaktivitet målinger af de høstede væv ('biodistribution'). Ex vivo radioaktivitet målinger er mere følsomme end visuel genkendelse af fluorescens, dermed kan tillade identifikation af kræft celle-afhængige signaler, der ellers ville forblive uopdaget. I tilfælde af en terminal imaging session, er afgørende for præcist Bemærk de injicerede radiotracer beløb samt gange af radiotracer radioaktivitet målinger, animalsk injektion, animal nedslagtning og kalibreret scintillation counter målinger af høstede væv. Det er afgørende at sikre korrektion for radiotracer forfald og dermed muliggøre pålidelige biodistribution analyse.

PET/CT imaging giver gentagne non-invasiv 3D kvantificering af tumor progression herunder vurdering af metastatisk spredning på en hel-krops niveau. Denne funktion er en betydelig fordel i forhold til konventionelle metoder, som ofte er afhænger af store kohorter af dyr, der er aflivet for vurdering af tumor progression på varierende tidspunkter. Fordelene ved denne imaging-baseret tilgang er: (i) meget følsomme ikke-invasiv 3D i vivo kvantificering, (ii) en betydelig reduktion i animalsk numre på grund af muligheden for Gentag imaging, (iii) erhvervelse af langsgående parrede data fra efterfølgende imaging sessioner forbedre statistik ved at udelukke Inter animalske variabilitet, som igen yderligere reducerer animalske numre, (iv) automatiseret produktion af [18F] BF4- på høje specifikke aktiviteter, og (v) den iboende mulighed for ex vivo bekræftelse i væv ved metoder, Fluorescens mikroskopi eller flowcytometri.

In vivo celle tracking er et voksende område. Det har fået næring af de seneste fremskridt i imaging-teknologi, hvilket resulterede i forbedret opløsning, detektionsgrænser og multiplex kapacitet (via multimodale imaging). I denne protokol anvender vi dette begreb til at spore tumor progression herunder spontan kræft celle metastase i 3D ved at gentage billeddannelse. Applikationerne omfatter undersøgelser med henblik på optrevling mekanismerne for spontan kræft celle metastaser. For eksempel kunne spores tumorceller bruges til at studere virkningerne af forskellige immun celle komponenter (som dag/funktionelle i animalske stammer af forskellige niveauer af immunocompromisation) på metastatisk processen. Ligeledes, effekten af enkelte gener, enten i den animalske stamme eller cancer cellelinie, kunne undersøges. Derudover kunne præsenteres protokollen bruges til at vurdere/validere effekten af specifikke stoffer eller terapeutiske begreber på tumor progression. Vigtigst, denne reporter gen: radiotracer par for PET imaging (NIS: [18F] BF4-) kan også bruges til forskellige celle registreringsprogrammer. Eksempelvis flere celle behandlinger i øjeblikket nye så lovende terapeutiske tilgange. Dette omfatter cellulære therapeutics for kræft behandling41 , men også i transplantation42 og regenerativ medicin43,44 indstillinger. Hele kroppen i vivo celle tracking bliver stadig vigtigere for udviklingen og kliniske oversættelse af cellulære therapeutics, for eksempel, for at vurdere sikkerhed og for overvågning af terapi.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forskningen blev støttet af King's College London og UCL omfattende Cancer Imaging Center, finansieret af Cancer Research UK og EPSRC i forening med MRC og DoH (England); det nationale Institut for sundhed Research (NIHR) Biomedical Research Centre baseret på fyr og St Thomas' NHS Foundation Trust og King's College London; Centre of Excellence i medicinsk Engineering finansieres af Wellcome Trust og EPSRC grant nummer WT 088641/Z/09/Z; en Cancer Research UK tværfaglige projekt Award GOF og PJB og en konge sundhed partnere tilskud til GOF. NanoPET/CT og nanoSPECT/CT-scannere blev købt og vedligeholdes af en udstyr tilskud fra the Wellcome Trust. De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis NHS, NIHR eller DoH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. Noninvasive molecular imaging using reporter genes. J Nucl Med. 54, (2), 167-172 (2013).
  3. Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments. J Nucl Med. 55, (4), 686-694 (2014).
  4. Terrovitis, J., et al. Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 52, (20), 1652-1660 (2008).
  5. Seo, J. H., et al. Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation. J Nucl Med. 51, (10), 1637-1643 (2010).
  6. Diocou, S., et al. [18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model. Scientific Reports. 7, (1), 946 (2017).
  7. Lajtos, I., et al. Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom. Phys Med Biol. 59, (11), 2727-2746 (2014).
  8. Nagy, K., et al. Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system. J Nucl Med. 54, (10), 1825-1832 (2013).
  9. Deleye, S., et al. Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, (5), 744-758 (2013).
  10. Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact. Endocr Rev. 35, (1), 106-149 (2014).
  11. Dohan, O., et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev. 24, (1), 48-77 (2003).
  12. Jauregui-Osoro, M., et al. Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (11), 2108-2116 (2010).
  13. Weeks, A. J., et al. Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS. Nucl Med Commun. 32, (2), 98-105 (2011).
  14. Khoshnevisan, A., et al. [(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity. EJNMMI Res. 6, (1), 34 (2016).
  15. Groot-Wassink, T., et al. Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice. Cancer Res. 64, (14), 4906-4911 (2004).
  16. Chen, L., et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene. J Nucl Med. 47, (5), 854-862 (2006).
  17. Sieger, S., et al. Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30, (5), 748-756 (2003).
  18. Chisholm, E. J., et al. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res. 69, (6), 2655-2662 (2009).
  19. Klutz, K., et al. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res. 15, (19), 6079-6086 (2009).
  20. Merron, A., et al. Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (7), 1377-1385 (2010).
  21. Merron, A., et al. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther. 14, (24), 1731-1738 (2007).
  22. Dingli, D., et al. Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor. Mol Imaging Biol. 8, (1), 16-23 (2006).
  23. Carlson, S. K., et al. Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene. AJR Am J Roentgenol. 192, (1), 279-287 (2009).
  24. Barton, K. N., et al. GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo. Mol Ther. 8, (3), 508-518 (2003).
  25. Siddiqui, F., et al. Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials. Hum Gene Ther. 18, (4), 312-322 (2007).
  26. Rad, A. M., et al. AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study. BMC Biotechnol. 9, 28 (2009).
  27. Hwang do, W., et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35, (1), 135-145 (2008).
  28. Edmonds, S., et al. Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines. ACS Nano. 10, (11), 10294-10307 (2016).
  29. Zhang, R., et al. Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy. ACS Nano. 11, (1), 249-257 (2017).
  30. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  31. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. Chapter 20 Unit 20.22 (2001).
  32. Workman, P., et al. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer. 102, (11), 1555-1577 (2010).
  33. Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. A review on segmentation of positron emission tomography images. Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).
  34. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  35. Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy. Semin Ultrasound CT MR. 31, (6), 496-505 (2010).
  36. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  37. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J Cell Biol. 163, (2), 257-269 (2003).
  38. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  39. Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals. Eur J Nucl Med. 25, (2), 173-176 (1998).
  40. O'Doherty, J., et al. 18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients. J Nucl Med. 58, (10), 1666-1671 (2017).
  41. Couzin-Frankel, J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342, (6165), 1432-1433 (2013).
  42. Boardman, D. A., et al. Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. American Journal of Transplantation. (2017).
  43. Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. Novel strategies for liver therapy using stem cells. Gut. 64, (1), 1-4 (2015).
  44. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
Radionukleid-fluorescens Reporter gen Imaging for at spore Tumor Progression i gnavere Tumor modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter