Summary
Fettsyrer trophic markør tilnærming, dvs. assimilering av fettsyrer som hele molekylet og overføring til forbruker vev med ingen eller liten endring, er hemmet av kunnskapshull i fettsyrer metabolismen av små jord virvelløse dyr. Isotopologue profilering er gitt som et verdifullt verktøy for å greie trophic interaksjoner.
Abstract
Fettsyrer (FAs) er nyttig biomarkers i næringskjeden økologi fordi de er vanligvis assimilert som et komplett molekyl og overført til forbruker vev med liten eller ingen endring, slik at kosttilskudd ruting mellom ulike nivåer i næringskjeden. FA trophic markør tilnærming er imidlertid fortsatt hindret av begrenset kunnskap i lipid metabolismen av jord faunaen. Denne studien brukt helt merket palmitinsyre (13C16:0, 99 atom %) som en tracer i fettsyrer metabolisme stier av to utbredt jord Collembola, Protaphorura fimata og Heteromurus nitidus. For å undersøke skjebnen og metabolske modifikasjoner av dette forløper, presenteres en metode for isotopologue profilering, utført av massespektrometri bruker enkelt ion overvåking. Videre er oppstrøms laboratoriet fôring eksperimentet beskrevet, og utvinning og metylering dominerende lipid fraksjoner (nøytral lipider, fosfolipider) og relaterte formelen og beregninger. Isotopologue profilering ikke bare gir samlede 13C anriking på fettsyrer avledet fra 13C merket forløper men produserer også mønster av isotopologues overstiger masse overordnede ion (dvs. FA molekylær ion M+) av hver merket FA med én eller flere masse enheter (M+ 1M2M3, etc.). Denne kunnskapen kan konklusjoner på forholdet mellom kosttilskudd ruting av en helt fortært FA i forhold til de novo biosyntesen. Isotopologue profilering er foreslått som et nyttig verktøy for evaluering av fettsyrer metabolismen i jord dyr å greie trophic interaksjoner.
Introduction
Kryptiske livsmiljøet som jord, trophic relasjoner er vanskelig å adresse og er begrenset av den lille størrelsen på dyrelivet. Det siste tiåret har sett fremskritt i biokjemiske økologi, spesielt i bruk av fettsyrer som biomarkers for å definere fôring strategier for jord faunaen under feltet forhold1,2,3. Dette er basert på det faktum at fettsyrer fra ressurser kan innlemmes i forbruker vev som hele molekyler, en prosess kalt kosttilskudd rute4. Overføring av fettsyrer har blitt rapportert over tre nivåer i næringskjeden dvs fra sopp å nematoder Collembola5. Nylig ROV faunaen ble ansett6,7 og første anmeldelser på fettsyrer som trophic markører i jord næringskjeder har vært publisert8,9.
Mer detaljert informasjon om trophic interaksjoner er oppnådd ved fettsyrer stabil isotop undersøkelser (FA-SIP). Fastsettelse av 13C /12C prosenter i fettsyrer i kosten og forbrukere kan tilskrive binære koblinger og beregne tilhørende carbon flyten, og har vært ansatt i bakkenettet, ferskvann og marine næringskjeder10,11 ,12,13. Den grunnleggende forutsetningen er at kosttilskudd distribuert fettsyrer ikke er underlagt enzymatisk prosesser; derfor deres 13C signal, dvs. den 13C /12C fettsyrer, i forbrukeren er lik som i kosthold1. Imidlertid er en gradvis uttømming av 13C signaturen opp i næringskjeden rapportert i akvatiske systemer, og dermed hindre bred anvendelse av FA-SIP i trophic studier14,15,16. Videre er kunnskap i lipid stoffskiftet i de fleste dyr i terrestriske næringskjeder fortsatt begrenset.
En forståelse av lipid metabolisme veier i forbrukere er viktig for bruken av trophic markør fettsyrer som betyr for fastsettelse av kvantitative karbon flyten i næringskjeden økologi. Med dette i bakhodet, 13C-isotopologue profilering, som i prinsippet kan brukes for undersøkelse av karbon metabolismen av noen biologiske system17, er en lovende metode. Etter innføringen av et 13C-merket karbon substrat fordelingen av 13C i metabolske nettverket er sporbare siden generert metabolske produktene i forbruker viser en bestemt isotopologue distribusjon. Dette kan bli vurdert av kvantitative kjernefysiske metabolske resonans spektroskopi18,19 eller massespektrometri20,21, med de siste favorisert i biologiske prøvene med lav biomasse på grunn av sin høyere følsomhet.
Selv om isotopologue profilering har blitt med hell brukt aminosyrer og innsikt i karbon i vivo metabolismen av bakteriell patogener17,22,23, gjennomføringen fatty syrer ligget. Den første detaljerte analysen på skjebnen til en stabil isotop merket forløper fettsyrer, sin kosttilskudd ruting eller degradering via β-oksidasjon, i jord virvelløse forbrukere, ble nylig utført av Menzel et al. 24. her, det metodologiske grunnleggende for inkorporering eksperimenter med 13C merket fettsyrer etterfulgt av isotopologue analyse av viktige etterkommere i hyppige jord dyr, Collembola, tilbys. Disse microarthropods er en god modell som de danner viktige komponenter av jord næringskjeden og er godt undersøkt for sin trophic markør fettsyrer8,25.
En forståelse av lipid metabolisme veier i forbrukere er viktig for bruken av trophic markør fettsyrer som betyr for fastsettelse av kvantitative karbon flyten i næringskjeden økologi. Nåværende protokollen gir utformingen og oppsettet til et laboratorium fôring eksperimentet og biokjemiske prosedyrer for utvinning og metylering av dominerende lipider fraksjoner (nøytral lipider, fosfolipider) fra Collembola. Den viser hvordan isotopologue sammensetningen av fettsyrer analyseres av massespektrometri beskriver relaterte formelen og beregninger. Denne prosedyren gir: (i) prosenter av isotopologues overstiger masse overordnede ion (dvs. fettsyrer molekylær ion M+) med en masse enheter (M+ 1M2M3, etc.) og (ii) totalt 13 C berikelse på fettsyrer avledet fra 13C merket forløperen. Selv om brukes til Collembola, kan denne tilnærmingen generelt brukes på noen andre rovdyr-byttedyr interaksjon på premisset om at disse er culturable i tilstrekkelig mengde under kontrollerte forhold å sikre en vellykket merket uptake og påfølgende verifikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Beskrevet protokollen faller ikke inn under kompetanse dyreetikk. Men når folk tilpasse beskrevet protokollene som dyr, ta vare at institusjonelle dyreetikk komiteen godkjent protokollen for dyr håndtering.
1. dyrking av dyr
Merk: Alt forklart eksperimentelle trinnene er basert på veletablerte protokoller26,27,28. Biotests i laboratoriet må en kontinuerlig tilførsel av lett culturable organismer. Her, har den Collembola arten Protaphorura fimata (Gisin, 1952) og Hetermurus nitidus (Templeton, 1835) blitt brukt. Begge er enkle å vedlikeholde som produktiv laboratorium kulturer med gjær.
- I plast microcosms med stram tettsittende lokk (diameter 7 cm, høyde 4,5 cm), legge til en blanding av aktivt kull, gips av Paris, og destillert vann for å gi en svært fuktig avl substrat (figur 1A).
- Når du forbereder microcosms blanding nok underlaget, f.eks for 10 microcosms i en bunke. Mix 9 deler av gips av Paris (225 g) og 1 del av tørr aktivt kull (25 g) sammen i en gips pott, Legg nøye ca 10 deler av destillert vann (250 mL) og la sitte i 5 minutter uten stirring ved romtemperatur.
- Rør med en lab skje i moderat fart på klokken å unngå luftbobler til en tykk soupy konsistens er oppnådd. Hell umiddelbart i microcosms til en høyde på ca 1 cm.
- Glatt puss av milde tapping på benken og virvler. Merk at hull (tilfeldig produkter luftbobler) og furer (aktivt lagt med en bakteriefri slikkepott) kan oppmuntre fruktbare Collembola å legge egg der. Denne studien unngått hull og furer for å ha samme reproduserbar vilkår. Men for demonstrering presenterer figur 1B noen hull.
- La tørke i ca 1-2 dager ved romtemperatur; inkubasjon på 60 ° C kan redusere den tiden til 1-2 h.
- Fukt microcosms før bruk ved å legge vann med en pipette til underlaget er fuktig. Holde mikrokosmos fuktig ved regelmessig å legge destillert vann som Collembola har en myk cuticle og er utsatt til uttørking.
- Overføre Collembola lett til gips sokkelen med en enkel luftpumpe, dvs. en lang silisium tube ca 25 cm lang med en pipette spissen utstyrt med en liten mesh å hindre sugekraft dyr inn i røret. Du kan også overføre dyr ved å tillate dem å følge på bust av en liten børste.
- Overføre (se trinn 1.2) 30 fersk klekket Collembola i nye microcosms og gi granulert tørr gjær som mat (om en kniv-tip) (figur 1B); fornye minst to ganger i uken. Plan tre uavhengige replikerer prøvetaking døgnet; i denne studien dager 0 - 7 og 14. Ruge på 15 ° C i mørket. Opprettholde en konstant temperatur er viktig, som fettsyrer endres av dyr metabolisme oppfyller kravene for membran flytende.
- Feed Collembola med gjær i fire uker før eksponering eksperimenter for å få en homogen 13C /12C signal og mønster i fettsyrer. Bruke en luftpumpe eller en pensel til å fjerne alle eggene (figur 1 c), fecal pellets, og exuviae regelmessig som dyr kan mate dem og dermed endre sine lipid profil.
Figur 1: dyrking av Collembola. (A) mikrokosmos fylt med avl substrat, en tørket blanding av gips av Paris, aktivt kull og destillert vann. (B) og (C) representant prøven av en Protaphorura fimata kultur; Merk liten nuggets av tørr gjær brukes som matkilde og også som hull i avl underlaget (svart pil) (B) og to egg (hvit pil) (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. merking Diet, Harvest og prøve håndtering
- Merking
- Fire uker etter å etablere Collembola kulturer, plassere 30 individer i nye microcosms og ruge på 15 ° C i mørket.
- Introdusere puls etiketten ved å mate dem bakere gjær som inneholder en helt 13C-merket palmitinsyre (13C16:0, 99 atom %) ved å blande 13C-merket palmitinsyre med gjær med en slikkepott på et forhold 0.5:1, f.eks5 g 13 C16:0 og 10 g tørr baker's gjær. Sett om en kniv spissen på hver mikrokosmos.
- Etter 6 h og erstatte dette merket mat med helt umerkede gjær.
-
Ytterligere dyrking
- I løpet av eksperimentet fornye gjær diett alle tre dager og legger beløpene høyere enn hva Collembola bruker i denne perioden. Viktigst, bruk en luftpumpe eller børste til å fjerne Collembolan egg, fecal pellets exuviae regelmessig for å sikre eksklusive foring av dyrene på medfølgende maten.
- Harvest
- Prøve microcosms destructively hver dag til dag 7. Deretter på dag 14, samle tre uavhengige replikater ved hver prøvetidspunkt; ulike prøvetaking er mulig.
- Forberede 10 mL BILLEDRØR utstyrt med Teflon belagt skrulokk, én for hvert utvalg. Forhånd rense disse rørene i en glass vaskemaskin og skyll to ganger med deionisert vann etterpå. Til slutt, for å fjerne alle spor av hydrofobe miljøgifter vaske to ganger ved å legge til 2 mL kloroform (HPLC klasse), vortex omtrent og kast løsemiddelet.
- For kontroll prøver (dag 0), ta 3-30 ikke-utsatt Collembola fra før kulturer som dag 0 prøver.
- For utsatt prøver (dag 1 og utover), ta for daglig prøvene i hvert tilfelle 3 30 utsatt Collembola fra kulturer intermediately matet med blanding av 13C-merket palmitinsyre og gjær.
- Registrer Collembola frisk vekt ved en ultra-microbalance. Overføre dyr bruker exhauster eller børste for å riktig skala-panner. Sikre enkel håndtering av Collembola under vekt skala-pans, sjokk-cool dyrene tidligere (-80 ° C for 2t). Alternativt kan en CO2 strøm i 10 min trygt svimeslå dyr.
- Direkte etter veiing inn dyr fra skala-pans nøye 10 mL-reagensglass. Fyll rør med 1 mL av metanol (HPLC grad) og butikk på 20 ° C før analysen.
Merk: Dette trinnet og utover, unngå eksempel håndtering med plast utstyr som organiske løsemidler er involvert; i stedet bruk dispensere og Pipetter som er egnet for løsemidler som glass fartøy.
3. lipid utvinning fra dyr vev og Methanolysis
- Forberede tre-reagensglass (utstyrt med Teflon belagt skrulokk) per bunken som bare 1 mL av metanol som tomme verdier. Viktigere, legge til eller overføre løsemidler brukes i denne protokollen bare av glass Pipetter eller kloroform/metanol skylles væske-resistent dispensere.
- På begynnelsen av lipid utpakkingen, redusere metanol brukes for lagring (eller blanking) for av fordampning; en kompakt Borstemmaskin roterende vakuum konsentrator (RVC) en vakuumpumpe og en kald felle anbefales. Overføre åpne rør inn i RVC og fordampe til tørr på 50 ° C og vakuum presset av 200 hPa for 20 min.
- Legge til 5 mL enfase utvinning løsemiddel (chloroform/methanol/0.05 M fosfat buffer 1:2:0.8, pH 7.4) hvert utvalg (inkludert mellomrom) og ekstra Collembolan lipider ved romtemperatur av risting natten (~ 200 rpm).
- Overføre løsemiddelet til nye rør og pakk ut prøver av risting 3 h med en ekstra 2,5 mL utvinning løsemiddel. Etter at kombinere utdrag fra begge trinnene; Bruk av glass Pasteur Pipetter anbefales. Legge til 0,8 mL kloroform og 0,8 mL destillert vann, og bland og sentrifuge 2000 g ved 20 ° C i 5 minutter. Endelig tillate å stå i 5 minutter for utskillelse av vandige og kloroform faser.
- For fettsyrer mønster analyse, dele de totale mobilnettet lipider av Collembola i nøytral lipid, glycolipid og phospholipid fraksjoner.
- For hver prøve, forberede en silica syre kolonne (kommersielle kolonne med 0,5 g kiselsyre, maske størrelse 100-200 µm, se Tabellen for materiale) ved å legge til 1 mL av kloroform (preconditioning). For å fremskynde prosessen, montere kolonnene på vakuum blokk som vanligvis brukes i kromatografi for solid fase utvinning. Ikke bruk nylon nåler; bruke rustfritt stål over rørene.
- Etter kloroform brukes for preconditioning har gått gjennom kolonnen overføring fullført lavere kloroform fasen av hvert utvalg til en enkelt kolonne. For å forenkle denne prosedyren, kan den øvre vandige fasen fjernes på forhånd. Bruk Pasteur Pipetter av glass, men vare ta at kolonnene ikke tørr.
- Suksessivt elute lipid fraksjoner med 5 mL kloroform (inkludert nøytral lipid fettsyrer, NLFAs), 10 mL av acetone (glycolipids - ikke analysert i dette prosjektet) og 5 mL av metanol (inkludert phospholipid fettsyrer, PLFAs). Samle hver fraksjon i individuelle glass fartøy.
- På slutten av utvinning, redusere kloroform (NLFAs) og metanol (PLFAs) via fordampning i en RVC. Overføre åpne rør til RVC og fordampe til tørr, ~ 90 minutter til 60 ° C og en vakuum 24 hPa.
- Start forsåpning av lipider (NLFA og PLFA brøkdeler) følger protokollen fra Welch (1991)29 med tillegg av 1 mL av natriumhydroksid-metanol løsning (45 g av natriumhydroksid, 150 mL av metanol og 150 mL destillert vann) og ruge på 100 ° C i 30 min i et vannbad. Cool eksemplet i iskalde vannet i 2 minutter, deretter sett prøvene tilbake på benken og fortsette arbeidet ved romtemperatur.
- Legge til interne standard hvert utvalg inkludert de tomme feltene. Velg en fettsyre som er ikke vanlig i eksperimentell organismene; også bruke en mettede fettsyrer minimere tap av cleavage og velge et molekyl med middels kjedelengde. For mange formål, oddetalls-nonadecanoic syre (19:0) fungerer godt. Så legge 30 µL av en 0.74 mM løsning i isooctane. Det nøyaktige antallet er svært viktig - Sørg for å ha sjekket presisjonen for din pipette med en microbalance på forhånd.
- Legg 2 mL saltsyre-metanol (mix 325 mL 6.0 N saltsyre med 275 mL av metanol), ruge ved 80 ° C i 10 min i et vannbad og avkjøles raskt på is 2 min. Dette trinnet er tid og temperatur følsom; bruke 80 ± 1 ° C og 10 ± 1 min. Sjekk med hvor mange eksempler kan gå inn i vannbad samtidig beholde de 80 ° C.
Merk: Denne fremgangsmåten fører fatty syren methyl ester (FAMEs), dvs. fettsyrer analytter stabilisert for fordamping i gass kromatografi. - Til slutt legger 1,25 mL Heksan/metyl-tertiær-butyl-Eter (1:1) og rock forsiktig i 10 min, så sentrifuge 2000 g for 5 min. fjerne bunnen fase og hold den øverste fasen består av FAMEs; bruke glass Pasteur pipetter. Legge 3 mL vandig natriumhydroksid (10,8 g av NaOH oppløst i 900 mL destillert vann) for en vask trinn.
- Rock og sentrifuger igjen.
- Ta den komplette øvre lipid inneholder fasen med et glass Pasteur pipette og overføring til gass kromatografi eksempel ampuller utstyrt med en Teflon septum. Unngå inkludert selv små mengder den vandige fasen, som dette vil forårsake problemer med GC målingen. Kapsle medisinglass og lagre på 20 ° C før analysen.
4. kvantifisering av fettsyrer av GC-FID
- Bruke gass Ture til å identifisere og telle FAMEs i NFLA og PLFA fraksjoner av Collembola (dyr) lipider. En gasskromatograf (GC) som er utstyrt med flammen ionisering detektor (FID) er en etablert og dokumentert utstyr30.
- Sammenligne tiden av toppene i utvalget til de i BERØMMELSE standard for identifisering av FAMEs. Dette er kvalitative og kvantitative standard blanding av nøkkel FAMEs som dekker en rekke matvarer og organismer.
- Ansette BERØMMELSE standard blandinger bestående av representant FAs for undersøkte organisme gruppe og eksperimentelle kosthold. I Collembola er disse fettsyrer karakteristisk for eukaryoter, f.eks, langkjedede flerumettede fettsyrer som arakidonsyre (20:4ω6). Når ansette gjær som diett er dette sopp markører som linolsyre (18:2ω6). Et godt valg er såkalte BERØMMELSE miksen, består av 37 forskjellige fettsyrer hyppige i dyr, sopp og plantemateriale og bakteriell acid methyl ester (BAME) bland (se Tabell for materiale).
- Kjøre prøver på GC-FID, kan du definere en sekvens med respektive programvare av instrumentet. Se produsentens håndbok for instruksjoner. Sekvensen starter med eksterne standard blandinger (f.eks BERØMMELSE og BAME mix), etterfulgt av prøvene. Merk at det er en oppbevaring tidsforskyvningen, dvs. en liten forsinkelse i elueringsrørets tid av fettsyrer fra kolonnen GC med hvert løp, mens du kjører prøver! Enten inneholder en standard hvert 10th i eksempel rekkefølgen eller bruke tiden låsing for palmitinsyre (16:0).
- Tilpasse GC innstillinger avhengig av instrumentet. Følgende program er foreslått for en høy ytelse (HP) kapillær kolonne (25 m x 0.2 mm ID, film tykkelse 0,33 µm. Angi injeksjon volumet til 1 µL i splitless modus og bruke hydrogen som bærer gass. Bruke en temperatur begynnelsen på 50 ° C (holdt til 1 min) og øker med 25 ° C min-1 til 175 ° C etterfulgt av 3 ° C min-1 230 ° c (holdt i 5.7 min).
- Beregne nmol fettsyrer per gram ferske (tørr) vekt av organismer med svaret oppnås ved FID for hver BERØMMELSE bruke kjent beløpene for respektive fettsyrer bruker følgende formel:
EnBERØMMELSE: Peak området av respektive BERØMMELSE i utvalget
MWFM: molekylvekt av respektive BERØMMELSE i µg/µmol
Cer: konsentrasjonen av interne standarden i µg
Ener: Peak området av interne standard
mCol: frisk (tørr) vekt av respektive Collembola prøve g
1000: konverteringsfaktor fra µmol til nmol
cBW: konsentrasjonen av respektive BERØMMELSE i gjennomsnittet av tilsvarende tomme verdier i nmol
5. 13C analyse av Isotopologue profilering
- Bruk en GC system kombinert til en masse selektiv detektor (MS) leveres med et elektron ionisering (EI) kilde for isotopologue vilje.
- Bruk en polar kapillær kolonne (f.eks DB 23, CP-Sil 88) som dette gir separasjon av umettede fettsyrer selv med samme antall dobbel obligasjoner. Valg av kolonnen GC er avgjørende for resultatet fordi den avgjør god representasjon av molekylet ion i fettsyrer.
- For en DB 23 kolonne (60 m x 0,25 mm ID, filmen tykkelse 0,15 µm), starte ovn temperatur på 130 ° C og øke med 6,5 ° C/min til 170 ° C. Følg med en økning på 3 ° C/min 203 ° c og holde for 1,9 min. følger med en økning på 40 ° C/min 230 ° c og holde 8.3 min. Angi overføring linje temperaturen 280 ° C. Igjen, justere GC metoden på apparatet.
- Bruk kvantitativ standarder bestående av kjente mengder FAMEs for alle fettsyrer undersøkes for 13C innlemmelse. Sette disse standardene i starten og slutten av hvert eksempel kjøre. Ta tid av fettsyrer interesse fra disse standardene.
- Mål prøver fra eksperimentene alltid starter med umerkede prøvene, og merket sonder etterpå. Bruke en delt ratio tilsvarer for eksempel konsentrasjonen, f.eks 1:12.5.If tilgjengelige instrumentet, bruke en etterskuddsvis med helium etter hvert utvalg kjøre for å tømme ut kolonnen fra gjenværende analytter.
- Bruke tiden låsing for metoden GC-MS slik at SIM oppkjøpet ikke lider skiftende og det er reproduserbare analytt tid.
- Bestemme 13C innlemmelse i molekylær ion av fettsyrer av GC/EI-MS bruker valgte ion overvåking (SIM)-modus av instrumentet. Operasjonen i SIM-modus lar deg oppdage bestemte analytter med økt følsomhet i forhold til full skannemodus.
- Kjøre en innledende skanning først å se hva er tilstede og Kjør SIM på riktig ioner. Hente data av interesse ved å velge m/z skanning windows (SIM grupper) omfatter brukt kromatografiske peak tid respektive fettsyrer. Vanligvis overvåke to til fire ioner per analytt og tid.
- For å øke følsomhet, justere masse skanning og bo ganger (tiden ser på hver masse). Beste kvalitet dataene hentes på lavest mulig hastighet, og generelt regelen i SIM er 8 til 12 skanner over analytt toppen. En proxy for instrument-innstillingene er en gjennomsnittlig bor tid per masse 9 ms, gangen syklus av 6 s og skanning tiden 175 ms cyle-1.
- Oppdage den molekylære ion (M+) av respektive fettsyrer og alle dens isotopologues (M1, M2 og så videre). Profileksempler representant resultater.
- Oppføring av hver ion fragment (isotopologue). Merk at overfloden av molekylet ion og dens isotopologues er relativt lav og kvaliteten på kvantifisering avhenger sterkt på ytelsen til MS systemet. Kjøre en låt før du starter en stort utvalg sekvens (eksperimentet) og rengjør ion kilden om nødvendig.
Merk: For det første disse dataene gi den samlede 13C enrichments av hver fettsyrer av brukte forløperen (her 16:0). - Bruk andelen isotop sammensetningen av merket fettsyrer fra sine umerkede kolleger for å tilordne trophic karbon fluks. Bruke atom % formelen i trinn 6.1 for å beregne prosentdelen av merket karbon (atom prosent, atom %) i respektive fettsyrer. Sammenlign prosentdelen av 13C i fettsyrer av Collembola mellom merket (dag 1 og senere) og umerkede dyr (dag 0) som relative indikasjon for strømmen av 13C fra kostholdet til forbruker.
- Tilordne plasseringen av 13C inkorporering fettsyrer kjeden. Basert på fordelingen av isotopologues greie kosttilskudd ruting av hele merket tracer fettsyrer (her 16:0) fra kjeden forlengelse av lipid metabolisme. Mens assimilering av hele markør molekylet øker overflod av isotopologues ytterst til overordnede ion (M+), f.eksM15, M+16, med kjede forlengelse ved bruk av 13C merket C2 fragmenter (13C acetyl-CoA) isotopologues nær molekylær ion bli hyppigere.
6. beregninger 13C berikelse
- I henhold til fordeling av isotopologues, beregne totale prosentandelen av merket karbon (i atom %) i respektive fettsyrer bruker følgende forhold: atom % = (forholdet 13C isotopologue innlemmet) x (frekvens respektive isotopologue)
Dette beregnes etter Kuppardt et al. 31 som:
der N er antallet karbonatomer i fettsyrer, J er antall 13C isotoper, enM + J er overflod av de respektive isotopologue, og enT totale overflod av alle isotopologues. - For beregning, summere peak området verdiene av molekylære ion (M+) av de respektive og alle isotopologues (M+ 1M2og så videre), oppdaget av SIM-MS analyse og satt til 100% relativ overflod. Beregne delen av hver oppdaget isotopologue er lett etter regelen av tre.
- Trekk ikke-merket dag 0 kontrollverdien (naturlig 13C bakgrunn) fra experimental verdiene for å få siste data spores bare tilbake til utføres ekstern 13C-merking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Frisk vekt og lipid innhold av Collembola
I løpet av beskrevet eksperimentet endret innholdet i NLFAs og PLFAs ikke betydelig over tid, mens frisk vekten av økt litt men ikke signifikant24. Begge parameterne angir et god fysisk trening av de Collembola prøvene. Vær oppmerksom på å undersøke Collembolas ferske vekt og lipid innhold gjennom hele eksperimentet tilsvarer de prøvetaking dagene for fettsyrer og isotop analyse. Merk at tap av vekt og/eller en reduksjon av lipid innhold i eksperimentell perioden indikerer en redusert fitness av testen organismen og avledede dataene drastisk miste betydning.
Isotopologue detection
Spesielle betydningen av isotopologue profilering prosjekter ligger i individuelle gjenkjenning og kvantifisering av både den molekylære ion og alle isotopologues i en bestemt fettsyrer. For eksempel ved 16:0 spenner ionene fra 270, dvs. molekylær ion M+ (C skjelett hovedsakelig består av 12C atomer) til 286 (isotopologue M+16 - karbonkjeden helt erstattet med tunge 13C). Figur 2A presenterer et SIM-MS spekter av ren 16:0, palmitinsyre. Naturlige overflod av 13C i denne forbindelsen blir synlig ved M1 og M2 isotopologues i tillegg til den molekylære ion (M+). Sammenligning viser figur 2B spectrogram av den helt merket palmitinsyre (99 atom % 13C) brukt i denne studien. Her, gjenspeiler den eneste forekomsten av ion M+16 høy renhet dette syntetisk merket sammensatt.
Figur 2: representant SIM skanninger av ren (A) umerkede og (B) helt merket palmitinsyre. Merk at naturlig mange M1 og M2 isotopologues i tillegg til den molekylære ion (M+) i den umerkede C 16:0 (A) men eksklusive tilstedeværelsen av M+16 isotopologue i helt merket fettsyrer (99 atom % 13C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Forlengelse/desaturation versus de novo syntese
Etter høsting test organismer, lipid utvinning og derivatization, er de genererte FAMEs klar til å bli analysert av GC og SIM-MS. Av undersøkelse av isotopologue profildata, kan man nå skille mellom de novo syntese og desaturation/forlengelse hendelser av fettsyrer hele merket markør. Den tidligere kan skje, i hvert fall delvis basert på 13C Acetyl-CoA som produkt av nedbrytning av merket forløperen via beta-oxidation. Figur 3 viser eksemplene SIM skanner avledet fra fire dominerende fettsyrer i PLFA delen av H. nitidus på første prøvetaking dagen etter merking. Assimilering av merket markør molekylet i palmitinsyre blir synlig av overflod av de M+16 - isotopologue, som representerer helt merket fettsyrer (figur 3A - 16:0). Videre desaturation 16:0 (figur 3B - 16:1ω7) eller forlengelse pluss desaturation (Figur 3 c - 18:1ω9, figur 3D - 20:4ω6) kan tilordnes. Dermed demonstrere gjenkjenning av isotopologues større enn M+16, f.eks M+17 og M18 kjeden forlengelse av merket forløperen 16:0 ved bruk av 13C2-fragmenter. De novo biosyntesen basert på 13C Acetyl-CoA av fettsyrer angis hvis isotopologues nær molekylær ion, dvs. M+ 1 M2 få betydelig flere hyppig enn i kontrollen representert ved dag 0 prøvetaking.
Figur 3: Representant SIM (valgte ion monitoring) skanner fragment ioner i fettsyrer av Heteromurus nitidus (PLFA brøk, en dag etter merking). (A) palmitinsyre (16:0) (B) Palmitoleic syre (16:1ω7) (C) oljesyre (18:1ω9), og (D) arakidonsyre (20:4ω6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Videre illustrerer dette, sammenligner Figur 4 første isotopologue mønster av de fem mest tungt merket fettsyrene (analysert både i PLFAs og NLFAs); forhold er dataene fra den Collembola arten P. fimata på 0 og dagen 1. På dag 1, var 13C signalet i C16 og C18 FAs nesten utelukkende basert på forekomsten av M+16molekyl ion, skyldes helt merket 13C 16:0, supplert til maten. Som nevnt ovenfor, foreslå observerte spor av M18 18:0 og 18:1ω9 innføring av en mindre del av 13C Acetyl-CoA via kjeden forlengelse fra 16:0 til 18:0. For 18:1ω9 var dette mer uttalt i den PLFA faction. Slike 13C acetyl-CoA stammer fra β-oksidasjon av merket 13C 16:0 molekyler. Innlemmelse av 13C acetyl-CoA også skjedde i forlengelse trinn fra kjedelengde C18 C20, som tildelt av 20:4ω6 PLFA prøvene. Dermed 13C anriking M+16 og M18 betydelig økt med tid inntil dag 14 (Figur 4). Videre økte M2 av denne PLFA 20:4ω6 på dag 14 sammenlignet med dagen 0 eller 1. Denne 13C tildeling i de forskjellige isotopologues angir at dannelsen av 20:4ω6 er basert både på de novo syntese med inkludering av acetyl-CoA merket med 13C eller naturlig 13C overflod og forlengelse/desaturation av hele 13C16:0 Forløperen molekylet. I kontrast, vises tydelig merket 20:4ω6 ikke i NLFA fraksjonen (Figur 4).
Figur 4: Isotopologue mønster av 13C inkorporering av SIM (valgte ion monitoring). Presenteres er de relative delene av den ioner M+ 1 M3 og M+16 for M+20 av fem mest tungt merket NLFAs og PLFAs fra Protaphorura fimata, beregnet på dag 0 og dag 1. Bare for 20:4ω6 presenteres dag 14 dataene i tillegg. P< 0,05 (Dunnett's test dag 0 data brukes som referanse). Dette tallet er et opptrykk av figur 5 publisert i Menzel et al. 24 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isotopologue profilering
En detaljert analyse av de kvantitative aspektene i 13C distribusjon i FAs må banebrytende teknologi tilordne karbon partisjonering i næringskjeder. Dette arbeidet ansatt isotopologue profilering for å vurdere den 13C /12C prosenter i vanlige FA biomarkers for tropic interaksjoner. Denne metoden er godt etablert for aminosyre analyse av flytende kromatografi (LC-MS) og ble brukt for undersøkelser av karbon stoffskiftet i patogene bakterier17,23. Bare nylig ble isotopologue profilering ytterligere utviklet som et verktøy for å studere kosttilskudd ruting av lipider i små jord dyr av Menzel et al. 24 siden denne metoden ikke er hemmet av "carry over" av 13C, er det derfor fordelaktig for vurdering av organisk vev høyanriket med en bestemt isotop forhold til GC-C-IRMS32.
Med denne tilnærmingen, masse-til-charge (m/z) verdiene i molekylær ion og dens isotopologues bestemmes av GC-MS med EI og SIM-modus. I forhold til en fullstendig skanning, kan følsomheten i SIM økes ved om faktor 100, som overgår selv de GC-FID kvantifisering utvalg33. Videre, ved kjøp av en bestemt gruppe ioner i tidsvindu, analytt måles pålitelig til tross for en bakgrunn av co eluting topper30. Thurnhofer og Vetter34 viste at SIM er egnet for både FA identifikasjon og kvantifisering i mat prøver selv med lave mengder lipider tilgjengelig.
Når du bruker SIM for 13C isotopologue profilering har minst to metodologiske begrensningene vurderes. Først molekylær ioner er relativt lav overflod og deres isotopologues er enda mindre. Med en skitten ion kilde, disse blitt mindre rikelig og som en konsekvens av SIM-metoden blir bare semi kvantitative33. Dernest reduserer økt forekomst av 13C på én eller flere karbon posisjoner av FA 13C naturlige overflod av tilknyttede karbonatomer. Disse endringene med merking er ikke-lineær, et fenomen kalt "Forskyv" i naturlige overflod, som kan føre til undervurdering av berikelse på disse massene20. Denne skjeve effekten må regnskapsføres ved hjelp av en korreksjon matrise basert på BERØMMELSE standarder (se Fernandez et al.) eller ved inkludert naturlig kontroller, dvs. FAs fra experimental organismer uten etikett. Sistnevnte ble utført i den nåværende arbeidet sammenligne de samme merket (dag 1 og senere) og ikke-merket Collembola (dag 0).
Kosttilskudd ruting og 13C fluks
Mens metodologiske fordelene isotopologue profilering for 13C vilje i FAs er tydelig, kan i vivo metabolismen av organismer bli hindret av biologiske midler. Isotopanrikning og metabolske steady state er vanskelig å oppnå når, f.eks, kosthold bruk eller fysiologiske status for forbrukere er ikke kjent, hindrer få absolutt karbon flukser. Men ved å sammenligne 13C isotopologues profiler av FAs diett og forbruker, kan den relative andelen FA assimilering og metabolske veier oppnås. Denne tilnærmingen gjør følgende bestemte skjebnen til en markør FA basert på plateselskapet 13C ved å spore sin kosttilskudd ruting. MS-SIM vist at markøren FA var hovedsakelig rutet til NFLA fraksjoner av begge Collembola arter analysert24. Videre lagret markøren FA i de nøytrale lipider med bare mindre eller ingen endringer. Bare forlengelse av kosttilskudd 13C16:0 18:0 og desaturation monoenoic enheter ble funnet (se Figur 4). Tilstedeværelsen av ion M+16 i C16 og C18 FAs av dag 1 prøver bekrefter at disse FAs er etterkommere av den supplert helt merket palmitinsyre. Dette funnet underbygger tidligere studier som var basert på FA mønster av forbruker og kosthold kun5,35 , og antyder at markøren FAs er innlemmet som hele molekyler i forbruker vev (for en vurdering, se Ruess og Chamberlain8).
I mellomtiden avslørt isotopologue 13C mønster av PLFAs at den observerte økningen i 13C20:46 over tid er både forlengelse/desaturation av helt merket forløper FAs og de novo syntese med sistnevnte også inkludert 13 C merket acetyl-CoA som angitt av tilstedeværelsen av M18 ion spor i C20 samt C18 FAs (se Figur 4). Figur 5 oppsummerer kosttilskudd ruting av supplert 13C16:0 PLFAs og NLFAs av observert Collembola arter. Interessant, er bare 13C palmitinsyre av PLFAs underlagt sterkere endringer, mens metabolske transformasjonen i NLFAs var begrenset til bare én forlengelse og to desaturation trinn.
Figur 5: Skjebnen til kosttilskudd 13C palmitinsyre i forbruker lipider. Den flow-charts vise foreslåtte skjebne innarbeidet 13C16:0 i undersøkte Collembola arter. Piler symboliserer de ulike nivåene av metabolske omsetning med forskjellig tykkelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å oppsummere, viser isotopologue profilering av MS-SIM tydelig at FA bruk trophic markør er en robust og pålitelig metode i økologien i næringskjeder. Selv om eksperimentell design ikke tillot den nøyaktige kvantifiseringen av 13C fluks (f.eks som atom % 13C av supplert FA) for de ulike trinnene i veier av FA metabolisme, er isotopologue profilering et nyttig verktøy for Alle økologiske studier med fettsyrer som trophic markører. Et mål for fremtiden er å få en kvantitativ forbruker FA co budsjett ved hjelp av lukkede mikrokosmos filsystemer og fôring forbrukere definert mengder merket forløpere for fettsyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til R. Menzel og L. Ruess av Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) er takknemlig anerkjent. R. Nehring ble finansiert av RU 780/10-1. Til slutt, vi er svært takknemlig til Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke for korrekturlesing av våre manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | --- | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
References
- Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
- Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands - Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
- Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
- Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
- Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
- Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
- Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
- Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
- Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
- Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
- Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
- Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
- Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
- Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059 (2012).
- Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
- Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
- Garton, N. J., O'Hare, H. M.
- Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
- Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
- Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
- Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
- Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
- Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
- Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
- ISO, I. O. fS. Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , ISO 11267:1999 (1999).
- Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
- Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
- Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
- Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
- Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
- Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
- Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).
