Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En eksperimentel Model af kost-induceret metabolisk syndrom i kanin: metodiske overvejelser, udvikling og vurdering

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57117
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 5, 2,3, 6, 2, 2, 1,3, 6
1CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, 2Department of Physiology, Universitat de València, 3INCLIVA, 4Department of Electronic Engineering, Universidad Politécnica de Valencia, 5UCIM, Universitat de València, 6Department of Physiotherapy, Universitat de València

Summary

Vi beskriver metoder til at udvikle en eksperimentel model af kost-induceret metabolisk syndrom (MetS) i kaniner ved hjælp af en højt fedtindhold, high saccharose diet. Dyr udviklet centrale fedme, mild hypertension, præ-diabetes og dyslipidæmi, dermed gengive de vigtigste komponenter i menneskelige MetS. Denne kroniske model giver mulighed for erhvervelse af viden underliggende mekanismer for sygdomsprogression.

Abstract

I de seneste år, er fedme og metaboliske syndrom (MetS) blevet et voksende problem for folkesundheden og klinisk praksis, givet deres øget forekomst på grund af stigningen i stillesiddende livsstil og usunde spisevaner. Takket være dyremodeller, kan grundlæggende forskning undersøge de underliggende patologiske processer såsom MetS mekanismer. Her, beskriver vi metoderne til at udvikle en eksperimentel kanin model af kost-induceret MetS og sin vurdering. Efter en periode med akklimatisering fodres dyrene en højt fedtindhold (10% hydrogenerede kokosolie og 5% fedt), høj-saccharose (15% saccharose opløst i vand) kost til 28 uger. I denne periode flere eksperimentelle procedurer blev udført for at vurdere de forskellige komponenter i MetS: morfologiske og blodtryksmålinger, glucose tolerance bestemmelse og analyse af flere plasma markører. Ved udgangen af forsøgsperioden, dyr udviklet centrale fedme, mild hypertension, præ-diabetes og dyslipidæmi med lavt HDL og høj LDL forhøjelse af triglycerid (TG), gengiver således hovedkomponenterne i menneskelige MetS. Denne kroniske model giver nye perspektiver for at forstå de underliggende mekanismer i progression af sygdommen, påvisning af prækliniske og kliniske markører, der tillader identifikation af patienter i fare, eller endda afprøvning af nye terapeutiske tilgange til behandling af denne komplekse patologi.

Introduction

Fedme og metaboliske syndrom (MetS) er blevet et voksende problem for folkesundheden og klinisk praksis, givet deres øget forekomst på grund af stigningen i stillesiddende livsstil og usunde spisevaner vaner1. Der er flere definitioner af MetS, men de fleste af dem beskrive det som en klynge af hjerte-kar- og metaboliske ændringer såsom abdominal fedme, nedsat HDL og forhøjet LDL-kolesterol, forhøjet triglycerider, glucose intolerance og hypertension2 ,3,4. Diagnosen kræver, at tre af disse fem kriterier er til stede.

På grund af dyremodeller har grundlæggende forskning kunnet undersøge de underliggende patologiske processer såsom MetS mekanismer. Flere dyremodeller har været brugt, men det er af afgørende betydning at model valg gengiver de vigtigste kliniske manifestationer af den menneskelige patologi (figur 1). Med dette formål, har dyremodeller betragtes som ligner mennesker, hovedsagelig hunde og svin, udviklet (Se Verkest5 og Zhang & Lerman6 til gennemsyn). Imidlertid viser canine modeller ikke alle komponenter i MetS, eftersom udviklingen af åreforkalkning eller hyperglykæmi i hunde gennem kosten er tvivlsom5. Svin modeller præsentere de mest anatomiske og fysiologiske lighed med mennesker, og dermed tilbyde betydelige intelligent strøm til belyse de underliggende MetS mekanismer, men deres vedligeholdelse og kompleksiteten af de eksperimentelle procedurer gør brug denne model meget arbejdskraft intensiv og bekostelig6.

På den anden side gnavere modeller (mus og rotter), kost-induceret spontan og transgene, har været flittigt brugt i litteratur for studiet af fedme, forhøjet blodtryk, og MetS og dens patologiske konsekvenser i forskellige organer og systemer (Se Wong et al. 7 til gennemsyn). Selv om brugen af disse modeller er mere overkommelig end hunde eller svin, har de vigtige ulemper. Faktisk, afhængigt af stammen, dyr udvikle nogle komponenter i MetS, mens andre såsom hypertension, hyperglykæmi, og hyperinsulinemia er fraværende7. Desuden en af de vigtigste komponenter i MetS, fedme, i nogle genetisk modificerede stammer, kun afhænger ikke af faktorer i forbindelse med kosten, snarere det har vist sig at nogle dyr bliver overvægtige med normale eller endda reduceret mad indtag8. Endelig, mus og rotter viser en naturlig mangel i cholesteryl ester overførsel protein (CETP) og bruge HDL som den store transportmiddel kolesterol, hvilket gør dem relativt resistente over for udviklingen af åreforkalkning. Dette er en vigtig forskel i lipid metabolisme med mennesker, der udtrykker CETP og transportere deres kolesterol hovedsagelig i LDL9.

Omvendt, laboratorium kanin repræsenterer et mellemstadium mellem de større dyr og gnaver eksperimentelle modeller. Således, kaninen kan nemt fremsendes til forskellige typer af protokoller med minimale krav af personale og vedligeholdelse, at være mere let håndteres i eksperimentelle procedurer end større dyremodeller. Endvidere, det er blevet rapporteret, at kaniner fodres med et højt fedtindhold kost har lignende hæmodynamiske og neurohumoral forandringer som fede mennesker8,10,11. Bemærk, om lipid metabolisme, kanin har rigelige CETP i plasma og deres lipoprotein profil er LDL-rige12, som er også ligner for mennesker. Derudover udvikle kaniner hyperlipidæmi ganske hurtigt idet som planteædere, de er meget følsomme over for kosten fedt13.

Figure 1
Figur 1: sammenligning af MetS dyremodeller. Se Verkest5, Zhang og Lerman6og Wong et al. 7 til gennemsyn. "Equation 1" angiver en fordel og "Equation 2" angiver en ulempe. *kontroversielle, afhænger af undersøgelsen, *som pegede ud af Carroll et al. 8, nogle genetisk modificerede stammer blive fede uafhængigt af fødeindtagelse. CEPT: cholesteryl ester overførsel protein. GTT: glukose tolerance test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at belyse de grundlæggende mekanismer de patologiske remodeling produceret af MetS i forskellige organer og systemer og opnå forståelse af dette komplekse patologi, valget af en eksperimentel model, der gengiver de vigtigste komponenter i menneskelige MetS er afgørende. Kaninen kan give mange fordele givet sin lighed med menneskets fysiologi og prisoverkommelighed af brug i kronisk protokoller og målinger. I denne linje, par kost-induceret kanin modeller ved hjælp af højt fedtindhold og højt-saccharose diet har været brugt14,15,16,17,18,19 (tabel 1), og en karakterisering af de forskellige komponenter i MetS er af stor betydning når vedrørende en fænotype med orgel remodellering. Således, denne artikel Hovedformålet er at beskrive metoderne for at udvikle en model for kost-induceret MetS i kaniner, der giver mulighed for undersøgelse af dens Patofysiologi og indvirkning i orgel remodellering.

Undersøgelse Kost Varighed Racen MetS komponenter
OB HT HG DL
Yin et al. (2002)14 ·    10% fedt 24 uger ·      Mandlige NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    37% saccharose ·      2 kg
Zhao et al. (2007)15 ·    10% fedt 36 uger ·      Mandlige JW Equation 1 Equation 2 Equation 2 Equation 2
·    30% saccharose ·      16 uger
Helfestein et al. (2011)16 ·    10% fedt 24 uger ·      Mandlige NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    40% saccharose ·      12 uger
·    0,5-0,1 kolesterol
Ning et al. (2015)17 ·    10% fedt 8-16 uger ·      Mandlige WHHL Equation 2 - Equation 2 Equation 1
·    30% fructose * ·      12 uger
Liu et al. (2016)18 ·    10% fedt 48 uger ·      Mandlige NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    30% saccharose ·      12 uger
Arias-Mutis et al. (2017)19 ·    15% fedt 28 uger ·      Mandlige NZW Equation 1 Equation 1 Equation 1 Equation 1

Tabel 1: kost-induceret MetS kanin modeller med højt fedtindhold, high saccharose diet. Symbolet "Equation 2"angiver fravær,"Equation 1" tilstedeværelse, og "-" ikke evalueret. * begrænset. WHHL, Watanabe arvelige hiperlipidemic kaniner. JW, japansk hvide kaniner. OB, fedme. HT, hypertension. HG, hyperglykæmi. DL, dyslipidæmi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Pasning af dyr og de eksperimentelle protokoller, der bruges i denne undersøgelse overholdt EU direktiv 2010/63 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, og blev godkendt af det institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (2015/VSC/ærter/00049).

Bemærk: Protokollen består af kronisk indgift af et højt fedtindhold, høj-saccharose diet til 28 uger, og vurderingen af de vigtigste komponenter i MetS. Vi brugte 11 voksne mandlige New Zealand White (NZW) kaniner vejer 4,39 ± 0,14 (s.d.) kg, hvilket var 20-22 uger gammel i begyndelsen af den forsøgsplan. De blev anbragt i et rum med fugtighed (50 ± 5%) og (20 ± 1,5 ° C) kontrollerede temperaturforhold med en 12-h lys cyklus. Ord "chow" og "kost" anvendes synonymt i protokollen trin.

1. kost Administration

  1. Opnå eller forberede kostvaner
    1. Opnå en kommercielt tilgængelig højt fedtindhold kost med ekstra hydrogenerede kokosolie (10%) og svinefedt (5%)19. Denne kost vil give 3,7 kcal·g-1.
    2. Forberede 5 til 15% saccharose løsninger ved at opløse de mængder saccharose i steriliseret vand (f.eks.brug 300 g saccharose i 2 L lager for en 15% rørsukkeropløsning). En 15% løsning vil give 0,6 kcal·mL-1.
    3. Opnå en kommercielt tilgængelig kontrol kost19, hvilket giver 2,7 kcal·g-1.
  2. Vænne dyrene til 4 uger
    1. Feed hvert dyr i kontrolgruppen 120 g af kontrol kost dagligt. Give vand ad libitum.
    2. Dyrefoder i MetS gruppe 250 g chow begyndende med en 50% kontrol og 50% højt fedtindhold chow, øge gradvist til 100% højt fedtindhold chow inden udgangen af uge 4.
      Bemærk: Formålet er at opnå: (i) kontrol 35% og 65% højt fedtindhold chow inden udgangen af uge 1; (ii) kontrol 25% og 75% højt fedtindhold chow inden udgangen af uge 2; (iii) 15% kontrol og 85% højt fedtindhold chow inden udgangen af uge 3. (iv) 100% højt fedtindhold chow inden udgangen af uge 4.
    3. Give dyrene i MetS gruppe vand med 5% saccharose i begyndelsen, og øge saccharose på 15% ved udgangen af det 4th uge.
    4. Registrere den daglige indtagelse af chow og saccharose løsning til at beregne kalorieindtag pr værdier i 1.1.1. og 1.1.2.
  3. Fremkalde MetS (28 uger)
    1. Feed hvert dyr i kontrolgruppen 120 g kontrol chow og vand ad libitum hver dag.
    2. Fodre dyrene i gruppen MetS 250 g højt fedtindhold chow og 15% saccharose i vand. Erstat chow dagligt og rørsukkeropløsning hver tredje dag.
    3. Veje de resterende chow og vand dagligt at anslå daglige indtag.

2. morfologiske vurdering

  1. Måle dyrenes legemsvægt på ugebasis.
  2. Måler højde, længde, abdominal konturog tibial længde, og vurdere BMI før administration af den eksperimentelle kost og i uge 14 og 28 i bedøvede dyr.
    1. Kanyleres højre øre marginale vene med et sterilt engangs kateter (18-22 G) og injicere propofol (8 mgkg-1) efterfulgt af 1,5 mL 0,9% NaCl opløsning. Udføre de målinger, der er anført i de efterfølgende trin i den bedøvede kanin.
    2. Foranstaltning højde og længde. Ved hjælp af måle bånd, måle og registrere afstanden fra næsen til hælen i laterale decubitus position (længde). I samme situation, tage afstand fra acromion i skulderen til spidsen af pote (højde).
    3. Beregne Body mass index (BMI)20 som legemsvægt (kg) · [krop længde (m) × højde (m)] -1.
    4. Placer målebåndet forsigtigt omkring den abdominale kontur og tage en måling med dyret i liggende stilling.
    5. Måle tibial længde fra den nederste del af knæleddet til indsættelse af achillessenen.

3. fasting Glycemia og intravenøs glukose Tolerance Test (IVGTT)

Bemærk: Det er tilrådeligt at starte procedurerne det samme tidspunkt på dagen (dvs., 2-3 PM).

  1. Forberede en glucose stamopløsning (60%) med 60 g glukose i 100 mL 0,9% NaCl opløsning.
  2. Hurtigt dyr for 7 h (fjernelse af fødevarer og vedligeholde vand), derefter placere den bevidste kanin i en Tilbageholderen i liggende stilling. Forberede blodsukkerapparat (Indsæt en ny stribe i meter), og tage den første prøve fra den venstre øre marginale vene ved hjælp af en lancet til at få en dråbe blod. Derefter røre blod drop med test strip og foranstaltning blodsukkerniveauet bruger blodsukkerapparat til at bestemme fastende glykæmi.
  3. Kanyleres højre øre marginale vene med en engangs kateter (18-22 G) og indsprøjtes en bolus af 60% glucose opløsning (0,6 g·kg-1).
    Bemærk: For at forberede bolus, tilsættes 1 mL/kg af glucose lager.
  4. Tage blodprøver bruge lancet (en dråbe blod) på 15, 30, 60, 90, 120, og 180 min. efter glukose injektion og analysere dem med blodsukkerapparat som i 3.2.
  5. Fjerne den disponible kateter og knivspids site af kateter indsættelse med en gaze. Når blod er koaguleret, fjerne gaze og kontrollere status for dyret.

4. blodtryk

  1. Forberede erhvervelse systemet herunder en tryktransduceren, en 10-mL sprøjte med 0,9% NaCl, en tre-vejs stophane, en forstærker og en PC/laptop med erhvervelse software (for blodtryk optagelse).
  2. Opsætning af udstyr. Første sted tre-vejs stophane og sprøjten i tryktransduceren mellem transduceren og kateter, og tilsluttes forstærkeren tryk transducer. Derefter forstærker til PC/laptop.
  3. Udføre tryk transducer kalibrering efter fabrikantens anvisninger.
  4. Placer den bevidste dyr i en kanin Tilbageholderen i liggende stilling. Varme op øre før cannulation, så topisk anvendelse en lokalbedøvelse (2,5% lidocain/prilocaine) i øre rundt på hjemmesiden for indsættelse. Forsigtigt trykke området hvor pakken vaskulære kører til nemt for at identificere arterie. Derefter indsætte et sterilt kateter (18-22 G) i den venstre øre centrale arterie. Løsn begrænsninger og tillader dyr at holde stille i 30 min.
  5. Optage blodtryk uafbrudt i 20 min direkte fra den arterielle kateter, anbringe tryk transducer placeret ved siden af dyret på hjerte niveau (sampling-frekvens: 1 KHz, se figur 5B).
    Bemærk: At holde blodtrykket (BP) optagelse gratis fra blod koagulation indblanding (BP signal taber amplitude eller forsvinder), en NaCl (0,9%) injektion bør gøres. Ved hjælp af trevejs-stophane lukke kredsløbet, der går fra transduceren til kateteret, åbne det kredsløb, der går fra sprøjten til kateteret, og indsprøjtes 1-2 mL. Dette vil fjerne blodpropper, der kan danne i kateteret. Derefter åbne kredsløb mellem transduceren og kateteret, og fortsætte optagelsen, når signalet er blevet tilbagebetalt.
  6. Når optagelsen er færdig, Fjern kateteret og knibe med en gaze i stedet for kateter indsættelse at stoppe blodtab. Når blodet har koagulerede, fjerne gaze og kontrollere status for dyret.

5. plasma målinger

Bemærk: Det er tilrådeligt at starte procedurerne det samme tidspunkt på dagen (dvs., 2-3 PM).

  1. Hurtigt dyr for 7 h (fjernelse af fødevarer og vedligeholde vand), derefter placere den bevidste dyr i en Tilbageholderen i den liggende stilling og indsætte en steril 21 G kanyle i venstre øre marginale vene. Når blodet begynder at dryppe, kassere den første dråbe og indsamle blodprøver i EDTA-rør op til det niveau, som angives i røret. Gemme prøver på is.
  2. Centrifugeres blodprøver på 1.500 x g, 15 min, 4 ° C. Efter centrifugering, suge plasma ved hjælp af en pipette og forberede prøver af 250 µL.
  3. Analysere de friske prøver straks. Grundlæggende parametre er som følger: triglycerider, total kolesterol, HDL og LDL kolesterol.
    Bemærk: Prøver ikke frisk analyseret skal opbevares straks i et-80 ° C fryser. Hvis du er interesseret i at analysere blodglukose fra plasmaprøver, bør blod glucose test bruge rør med fluor oxalat i stedet for EDTA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MetS repræsenterer en klynge af metaboliske og kardiovaskulære misdannelser hvis undersøgelse kan lettes ved hjælp af eksperimentelle modeller. Faktisk, for at belyse de underliggende den patologiske remodeling produceret af MetS mekanismer, valget af en eksperimentel model, der passende ligner den menneskelige tilstand og er velegnet til forskning er af afgørende betydning. Vi præsenterer her, metoder til at fremkalde MetS i kanin ved hjælp af en kost med højt indhold af mættet fedt og saccharose og en detaljeret karakteristik for vurdering. Brug af kost i stedet for en genetisk modificerede dyr model er af stor betydning da kost påvirker hele kroppen stofskifte19, således der ligner nøje hvad der sker i menneskets MetS. Vi brugte et Fakultet (blandet model) ANAVA med to faktorer, en gentagen foranstaltninger eller "inden for" faktor (tid: pre, uge 14 og uge 28, afhængigt af analysen) og en "mellem" faktor (gruppe: kontrol og MetS) for statistisk analyse. Betydning blev accepteret når p < 0,05.

Den høj fedtindhold, høj-saccharose diet tåles godt af dyrene. En acclimation periode på 4 uger er nødvendige for korrekt overgangen fra det tidligere fodring regime til højt fedtindhold, high saccharose diet. Dyrene i kontrolgruppen fodres 120 g chow, som har vist sig at være relevant for vedligeholdelse af voksen kanin8. Kaniner i gruppen MetS øges gradvist i vægt indtil udgangen af forsøgsplan (tabel 2). Dyr bør få 50-100 g pr. uge. Det er vigtigt, at kaniner er opstaldet enkeltvis i bure med nok plads, lys og miljøberigelse (figur 2 c), og en daglig kontrol af dyrene er udført. Også på daglig basis, skal chow og drikke indtag være overvåget og registreret, for at opnå vægtøgning og opdager eventuel helbred problematik, da kaniner er nemt stressede og reaktionen kan være at stoppe næring forbrug. Derudover, da højt fedtindhold pellets har tendens til at være meget ustabil og mister sammenhæng meget let at dreje til pulver som kaniner ikke spiser, er det af afgørende betydning at forberede de daglige portioner af chow meget omhyggeligt (figur 2A). I figur 3A, vi kan observere adfærd energiindtag og dets udsving, spænder fra 250 til 815 kCal i gruppen MetS. I figur 3B, er det relative bidrag fra de forskellige energikilder (chow og drink) afbildet. Der er kritiske perioder i uge 14 og 28, fordi stress produceret af eksperimentelle procedurer, kaniner kan mindske chow og vand indtag. Den daglige kvantificering giver mulighed for hurtig identifikation af dette problem, som kan undgås ved at indføre kontrol chow (80% højt fedtindhold, 20% kontrol) og faldende rørsukkeropløsning fra 15% til 10%, eller endda 5%, i løbet af 2-3 dage indtil dyr inddrive deres normale indtag værdier. Dyr også udviklet centrale fedme som vist af stigningen i vægt, abdominale omkreds og BMI (tabel 2), som er nært beslægtet med de risikofaktorer, der definerer MetS3.

Figure 2
Figur 2: kost administration. I panelet A, styre chow (øverst) og højt fedtindhold chow (nedenfor) er afbildet, viser forskellene mellem to på grund af det ekstra fedt. For at undgå det pulver, der gør højt fedtindhold pellets mindre velsmagende, det er nødvendigt at bruge en si til at adskille fedtrig pellet pulver (Panel A, nederst). I panelet B, vi kan observere de materialer, der er nødvendige for at gøre drikke løsningen (venstre), og hvordan det er tilrådeligt at gøre en stamopløsning til at distribuere i vand dispenser. Endelig, dyrenes velfærd er meget vigtigt, og de skal være opstaldet individuelt i bure (C) med nok plads og lys og, om muligt, miljøberigelse (dvs., platforme, legetøj, osv.). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: energiindtag. Udviklingen af ugentlige indtag i løbet af 28 ugerne af forsøgsperioden er afbildet i panelet A for kontrol og MetS. Den relative indtagelse (i procent) af kCal fra højt fedtindhold chow og drikke løsningen af MetS dyr er vist i panelet B. kontrol (n = 5), MetS (n = 6). Fejllinjer: SD. ændret fra Arias-Mutis mfl. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Før kost Uge 14 Uge 28
Kontrol MetS Kontrol MetS Kontrol MetS
Vægt (Kg) 4.35(0.15) 4.43(0.14) 4.49(0.12) 5.42(0.17) 4.51(0.13) 5.75(0.6)
Længde (cm) 52.4(1.6) 53.6(1.7) 52.5(0.8) 54.4(1.7) 53.7(0.7) 54.6(0.8)
Højde (cm) 25.9(0.7) 25.5(1.1) 25.9(2.2) 26.1(5.3) 26.0(1.0) 26.1(1.5)
Abdom. omkredsen (cm) 39.8(1.7) 40.5(1.4) 38.5(1.5) 47.5(2.2) 38.1(1.0) 49.7(3.5)
Tibial længde (cm) 16.4(0.8) 16.3(0.7) 16.7(0.3) 16.7(0.4) 17.4(0.4) 16.8(0.6)
BMI (Kg/m2) 32.8(1.9) 32.9(2.6) 32.8(1.2) 36.8(1.9) 32.6(2.1) 39.3(6.0)

Tabel 2: morfologiske karakteristika. Vi fandt forskelle, når man sammenligner kontrol vs. MetS uger 14 og 28 i vægt (vigtigste effekt p = 0,003, η2 = 0,6; parvise sammenligninger på uge 14 p < 0,001 og uge 28 p < 0,001), abdominale omkreds (vigtigste effekt p < 0,001, η2 = 0,9 parvis sammenligninger på uge 14 p < 0,001 og uge 28 p < 0,001), og BMI (vigtigste effekt p = 0.016, η2 = 0,5; parvise sammenligninger på uge 14 p < 0,001 og uge 28 p < 0,001). Kontrol (n = 5) og MetS (n = 6). Værdier udtrykkes som mener (SD). Ændret fra Arias-Mutis mfl. 19.

Vedrørende fastende blodglucose spiller svar på IVGTT en central rolle i karakterisering af glukose homøostase21. Vi observerer milde hyperglykæmi ved uge 14, som når et plateau og opretholder tilsvarende værdier på uge 28 (figur 4A). Arealet under kurven (AUC) øger også i gruppen MetS (figur 4B). Selvom cut-off værdier til at identificere type II diabetes i kaniner baseret på fastende blodsukker har endnu ikke anerkendt19med denne forsøgsplan, kaniner indsendt til 28 uger med højt fedtindhold, udviklet høj-saccharose fodring præ-diabetes med nedsat fastende glukose og glukose intolerance.

Figure 4
Figur 4: blod glucose regulering. Resultaterne af IVGTT i kontrol og MetS dyr på uger 14 og 28 er vist i panelet A. Kvantificering af arealet under kurven (AUC) fra 0 til 180 min. er afbildet i panelet B med en boks og whiskers plot. Denne parameter er steget i MetS dyr i uge 14 og 28 versus kontrolelementer (vigtigste effekt p = 0,001, η2 = 0,5; parvise sammenligninger på uge 14 p = 0,001 og uge 28 p = 0,002). Kontrol (n = 5), MetS (n = 6). Ændret fra Arias-Mutis mfl. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Hypertension er tæt og direkte relateret til sværhedsgraden af fedme. Kaniner fodres en højt fedtindhold, high saccharose diet til 28 uger viste en stigning i systolisk, diastolisk og gennemsnitlige blodtryk allerede i uge 14, og denne stigning i blodtrykket er fastholdt i uge 28 (figur 5 c - E). I betragtning af den nære sammenhæng mellem blodtryk og BMI22, er det af stor betydning at sikre, at dyrene får vægt gradvist for at opnå en betydelig stigning i blodtrykket.

Figure 5
Figur 5: ændringer i blodtryk. Panel A skildrer kateter indsat i auricular arterie. Bemærk, at venen og auricular arterie løber gennem tandsæt af øret nøje, er det af afgørende betydning at differentiere dem. Før cannulation er det tilrådeligt at varme op i øret og efter aktuel anæstesi, til at trykke forsigtigt området hvor pakken vaskulære kører. Arterie har en tykkere vaskulære væg og en lysere farve end venen, og blodet pulser kan observeres. Panelet B viser den eksperimentelle setup med tryktransduceren, som er tilsluttet en forstærker og registrerer kontinuerligt signal (BP optagelse). Paneler C og D viser boks og whiskers parceller af systolisk og Diastolisk blodtryk på uge 14 og 28 i både eksperimentelle grupper. Middel-arterielt tryk (kort) er præsenteret i panelet E. Vi fandt forskelle, når man sammenligner kontrol vs. MetS uger 14 og 28 i systolisk (vigtigste effekt p = 0,003, η2 = 0,4; parvise sammenligninger på uge 14 p = 0.029 og uge 28 p = 0,013), diastolisk (vigtigste effekt p = 0,027, η2 = 0,3; parvise sammenligninger på uge 14 p = 0,036 og uge 28 p = 0,001) og kort (vigtigste effekt p = 0,006, η2 = 0,4; parvise sammenligninger på uge 14 p = 0,027 og uge 28 p = 0,001). Kontrol (n = 5), MetS (n = 6). Ændret fra Arias-Mutis mfl. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Endelig, for at vurdere udviklingen af MetS, en vurdering af ændringer i plasma biokemiske markører er nødvendige. I denne kroniske model, vi observeret en aendring i lipid profil så tidligt som uge 14, og denne ændring var stabil indtil uge 28, uden yderligere stigninger i forskellene. Ændringer i plasma lipid profil er kendetegnet ved en forhøjelse af triglycerider og LDL, et fald i HDL, og ingen ændringer i total kolesterol i MetS dyr versus kontrollen ved både tid point (uger 14 og 28) (tabel 3).

Uge 14 Uge 28
Kontrol MetS Kontrol MetS
Total kolesterol (mg·dL-1) 20.4(2.3) 24.0(9.1) 27.4(15.7) 21.2(4.4)
HDL (mg·dL-1) 9.1(4.2) 4.3(1.7) 11.2(4.2) 5.1(2.9)
LDL (mg·dL-1) 3.8(1.1) 8.7(4.5) 4.0(1.2) 13.8(9.3)
Triglycerider (mg·dL-1) 71.2(58.8) 118.0(40.7) 30.2(11.4) 76.8(28.2)

Tabel 3: vurdering af plasma biokemi. Vi fandt forskelle, når man sammenligner kontrol vs. MetS uger 14 og 28 i HDL (vigtigste effekt p = 0,008, η2 = 0,3; parvise sammenligninger på uge 14 p = 0,006 og uge 28 p = 0.037), LDL (vigtigste effekt p = 0.040, η2 = 0,2; parvise sammenligninger på uge 14 p = 0,02 8 og uge 28 p = 0,034), og triglycerider (vigtigste effekt p = 0,002, η2 = 0,4; parvise sammenligninger på uge 14 p = 0,004 og uge 28 p = 0,001). Kontrol (n = 5) og MetS (n = 6). Værdier udtrykkes som mener (SD). Ændret fra Arias-Mutis mfl. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etablering af en passende eksperimentel model kan give en mere konsistent og pålidelig metode til at studere udviklingen af MetS, og det er også nødvendigt at forstå de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for organer og systemer, remodeling. Her, vi beskriver metoderne til at udvikle en relevant eksperimentel model af kost-induceret MetS og hvordan man skal vurdere de vigtigste bestanddele i denne klynge af metaboliske og kardiovaskulære misdannelser, der karakteriserer denne model: central fedme, forhøjet blodtryk, glukose intolerance, og dyslipidæmi med lavt HDL og høj LDL forhøjelse af TG niveauer.

En styrke ved modellen er evnen til at studere den betingelse, der går forud for den kliniske manifestation af patologi. Faktisk, med hensyn til metaboliske ændringer, i 28 uger dyr udvikle ikke type II diabetes og var i en tilstand af prediabetes (figur 4). På samme måde, plasma biokemiske markører viste en tydelig ændring i lipid profil med en stigning i LDL og TG, et fald i HDL, men ingen ændringer i total kolesterol (tabel 3), som er en vigtig faktor i udviklingen af åreforkalkning. Selvom vi kan observere en stigning i systolisk, diastolisk, og kort i uge 28 (figur 5), kan dette betragtes mild hypertension. Samlet set effekter i de metaboliske og kardiovaskulære markører er beskedne, men denne model kan aktivere forskning i den stat, før de manifesterer sig (og i de fleste tilfælde uoprettelige) patologi, således at identifikation af prækliniske og kliniske markører, der kan tillade afsløring af patienterne i fare.

Desuden, i modsætning til andre MetS dyremodeller (mus, rotte som hund), spontane eller transgene kaniner modeller kan udvikle alle komponenter i MetS. Interessant, er det blevet rapporteret, at kombinationen af de forskellige komponenter i MetS kan forstærke hjerte-kar-risiko. Faktisk, den patologiske remodeling produceret af hypertension er forværret når flere komponenter i MetS vises23. Denne eksperimentelle model kan give mulighed for undersøgelse af de underliggende mekanismer, og effekten af de forskellige komponenter kombineret. Endvidere, at kost påvirker hele kroppen stofskifte, brugen af en kost-induceret model har vigtig betydning, nøje efterligne, hvad der sker i menneskets MetS19.

Den sidste, men ikke mindst vigtige styrke, er balancen mellem relevans og indvirkning på Translationel forskning og de økonomiske omkostninger. På den ene side finder vi svinepest modeller, meget ligner mennesker, men meget dyre tid, ressourcer og økonomiske omkostninger. På anden siden har vi gnavere modeller, som er let at implementere med meget små omkostninger, men har en lavere generalisering magt. Kanin modellen repræsenterer den midterste punkt, da det er fleksible nok for mange forskellige typer af undersøgelser samtidig undgå nogle af ulemperne af store dyremodeller, og viser lignende hæmodynamiske og neurohumoral observerede ændringer i menneskelige MetS8, 10,19.

Følgende begrænsninger af de beskrevne metoder bør overvejes. Centrale fedme og kroppen fat distribution, ville anvendelse af magnetisk resonans være guldstandarden, hvis tilgængelige, ellers bruge kvantificering af visceralt fedt i slutningen af 28 uger. Andre ikke-invasive metoder for longitudinelle studier, ville såsom X-ray computertomografi, være mere passende24. Vi målte abdominale omkreds og BMI i stedet (tabel 2), der har også været brugt i flere undersøgelser i kaniner som en foranstaltning af centrale fedme25,11,26. Tibial længde målemetode kan også være mere præcise, ved hjælp af abdomen eller et ben radiografi. For at fastslå, hvis årsagen til glukose intolerance i denne kroniske model er insulinresistens eller nedsat insulinproduktion, insulinresistens skal bestemmes ved hjælp af en insulin tolerance test eller bestemmelse af fastende insulin niveauer.

Endelig, for at forbedre modellen, kunne flere foranstaltninger træffes. Vi kunne formentlig have opnået en hurtigere stigning i Glycemia med kombinationen af korte perioder af alloxan injektion og højt fedtindhold, high saccharose diet, men derefter fænotype kunne ikke henføres kun til kosten. Alder kunne spiller også en vigtig rolle, da vi arbejdede med unge voksne kaniner (4,5 måneder gammel da dyrene ankom i de animalske faciliteter, 12,5-13 måneder gamle ved udgangen af den eksperimentelle protokol) og MetS ofte opstår på ældre alder27. Ældre kaniner var desværre ikke kommercielt tilgængelige. Det ville være interessant at afprøve denne model hos ældre dyr og observere hvis fænotype er forværret.

De metoder, der præsenteres her for udviklingen af denne eksperimentelle model af MetS i laboratoriet kaniner bør give et værdifuldt redskab for undersøgelser med henblik på at belyse de grundlæggende mekanismer de patologiske remodeling produceret af MetS i de forskellige organer og systemer, og forståelse for denne komplicerede patologi. Endelig, da NZW kaniner er stillesiddende dyr, denne diæt-induceret model kan være nyttigt at undersøge, hvordan de forskellige komponenter i patologi udvikler sig i en lignende måde end opstår i menneskelig MetS, og kan give nye perspektiver for forståelse af patofysiologiske mekanismer involveret i progression af sygdommen, identifikation af prækliniske og kliniske markører til at identificere patienter i fare, eller endda afprøvning af nye terapeutiske tilgange til behandling af denne komplekse patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Generalitat Valenciana (GV2015-062), Universitat de València (UV-INV-PRECOMP14-206372) til MZ, Generalitat Valenciana (PROMETEOII/2014/037) og Instituto de Salud Carlos III-FEDER midler (CIBERCV CB16/11/0486) til FJC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veterinary scale SOEHNLE 7858 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Shovel for aluminum feed COPELE 10308 Shovel for aluminum feed
http://copele.com/es/herramientas/48-pala-para-pienso-de-aluminio.html
Balance PCE Ibérica PCE-TB 15 Balance
http://www.pce-iberica.es/medidor-detalles-tecnicos/balanzas/balanza-compacta-pce-bdm.htm
Strainer (20 cm diam.) ZWILLING 39643-020-0 Strainer
https://es.zwilling-shop.com/Menaje-del-hogar/Menaje-de-cocina/Menaje-especial/Accesorios/Colador-20-cm-ZWILLING-39643-020-0.html
Bowl ZWILLING 40850-751-0 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Funnel BT Ingenieros not available Funnel
http://www.bt-ingenieros.com/fluidos-y-combustibles/961-juego-de-4-embudos-de-plastico.html?gclid=EAIaIQobChMIuInui_y-1QIVASjTCh28Zwf-EAQYBSABEgK7xPD_BwE
Introcan Certo 22G blue B Braun 4251318 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Propofol Lipuro 10 mg/ml vial 20 ml B Braun 3544761VET General intravenous anesthetic
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/propofol-lipuro-1-
FisioVet serum solution 500ml B Braun 472779 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Film Vet 1,25cm x 5m B Braun OCT13501 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Askina Film Vet 2,50cm x 5m B Braun OCT13502 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Injekt siringe 10ml luer B Braun 4606108V Injection-aspiration syringe of two single-use bodies
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/injekt-
Seca 201 seca seca 201 Ergonomic tape for measuring perimeters
https://www.seca.com/es_es/productos/todos-los-productos/detalles-del-producto/seca201.html#referred
Sterican 21Gx1" - 0,8x25mm verde B Braun 4657543 Single Use Hypodermic Needle
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/agujas-hipodermicas-sterican-
CONTOURNEXT-Meter BAYER 84413470 Blood glucose analysis system
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-meter-2
CONTOUR NEXT test strips BAYER 83624788 Blood glucose test strips
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-test-strips-100-ct-package
MICROLET NEXT LANCING DEVICE BAYER 6702 Lancing device
http://www.contournextstore.com/en/new-microlet-next-lancing-device
MICROLET 2 Colored Lancets BAYER 81264857 Ultra-thin sterile lancet for capillary puncture
http://www.contournextstore.com/en/microlet2-colored-lancets-100s
Injekt 20ml luer siringe B Braun 4606205V Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Mullkompressen 7,5x7,5cm - sterile B Braun 9031219N Sterile gauze packets in envelopes
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-mullkompressen-esteril
Emla lidocaine/prilocaine AstraZeneca not available Local anesthetics
https://www.astrazeneca.es/areas-terapeuticas/neurociencias.html
Introcan Certo 18G short B Braun 4251342 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Introcan Certo 20G B Braun 4251326 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Blood Pressure Transducers-MA1 72-4497 Harvard Apparatus 724497 Transducer for monitoring blood pressure
http://www.harvardapparatus.com/physiology/physiological-measurements/transducers/pressure-transducers/research-grade-pressure-transducers.html
PowerLab 2/26 AD Instruments ML826 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/powerlab
LabChart ver. 6 AD Instruments not available Acquisition software
https://www.adinstruments.com/products/labchart
Animal Bio Amp AD Instruments FE136 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/bio-amps#product-FE136
K2EDTA 7.2mg BD 367861 Blood collection tubes
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=367861
Centrifuge SciQuip 2-16KL Centrifuge
http://www.sigma-centrifuges.co.uk/store/products/refrigerated-sigma-2-16k-centrifuge/
Eppendorf Reference 2, 100 – 1000 μL Eppendorf 4920000083 Pipette
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Pipeteo-44563/Pipetas-44564/Eppendorf-Reference2-PF-42806.html
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30121023 Tubes
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Puntas-tubos-y-placas-44512/Tubos-44515/Eppendorf-Safe-Lock-Tubes-PF-8863.html
NZW rabbits (16-18 weeks old) Granja San Bernardo not available New Zealand White rabbits
http://www.granjasanbernardo.com/en/welcome/
Sucrose  Sigma S0389-5KG Sucrose for drinking solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=es&region=ES
Rabbit maintenance control diet Ssniff V2333-000 Control diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit high-fat diet Ssniff S9052-E020 High-fat diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit rack and drinker Sodispan not available Rack for rabbits
https://www.sodispan.com/jaulas-y-racks/racks-conejo-y-cobaya/
Rabbit restrainer Zoonlab 3045601 http://www.zoonlab.de/en/index.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornier, M. A., Dabelea, D., Hernandez, T. L., Lindstrom, R. C., Steig, A. J., Stob, N. R., et al. The metabolic syndrome. Endocr rev. 29 (7), 777-822 (2008).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P., Shaw, J., Grundy, S. M. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements.html (2006).
  3. Alberti, K. G., Eckel, R. H., Grundy, S. M., Zimmet, P. Z., Cleeman, J. I., Donato, K. A., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
  4. Grundy, S. M. Pre-diabetes, metabolic syndrome, and cardiovascular risk. JACC. 59 (7), 635-643 (2012).
  5. Verkest, K. R. Is the metabolic syndrome a useful clinical concept in dogs? A review of the evidence. Vet J. 199 (1), 24-30 (2014).
  6. Zhang, X., Lerman, L. O. Investigating the Metabolic Syndrome: Contributions of Swine Models. Toxicol Pathol. 44 (3), 358-366 (2016).
  7. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutr Metab (Lond). 13, 65 (2016).
  8. Carroll, J. F., Dwyer, T. M., Grady, A. W., Reinhart, G. A., Montani, J. P., Cockrell, K., et al. Hypertension, cardiac hypertrophy, and neurohumoral activity in a new animal model of obesity. Am J Physiol. 271 (1 Pt 2), H373-H378 (1996).
  9. Grooth, G. J., Klerkx, A. H., Stroes, E. S., Stalenhoef, A. F., Kastelein, J. J., Kuivenhoven, J. A. A review of CETP and its relation to atherosclerosis. J Lipid Res. 45 (11), 1967-1974 (2004).
  10. Zarzoso, M., Mironov, S., Guerrero-Serna, G., Willis, B. C., Pandit, S. V. Ventricular remodelling in rabbits with sustained high-fat diet. Acta Physiol (Oxf). 211 (1), 36-47 (2014).
  11. Filippi, S., Vignozzi, L., Morelli, A., Chavalmane, A. K., Sarchielli, E., Fibbi, B., Saad, F., Sandner, P., Ruggiano, P., Vannelli, G. B., Mannucci, E., Maggi, M. Testosterone partially ameliorates metabolic profile and erectile responsiveness to PDE5 inhibitors in an animal model of male metabolic syndrome. J Sex Med. 6 (12), 3274-3288 (2009).
  12. Waqar, A. B., Koike, T., Yu, Y., Inoue, T., Aoki, T., Liu, E., et al. High-fat diet without excess calories induces metabolic disorders and enhances atherosclerosis in rabbits. Atherosclerosis. 213 (1), 148-155 (2010).
  13. Fan, J., Watanabe, T. Cholesterol-fed and transgenic rabbit models for the study of atherosclerosis. J Atheroscler Thromb. 7 (1), 26-32 (2000).
  14. Yin, W., Yuan, Z., Wang, Z., Yang, B., Yang, Y. A diet high in saturated fat and sucrose alters glucoregulation and induces aortic fatty streaks in New Zealand White rabbits. Int J Exp Diabetes Res. 3 (3), 179-184 (2002).
  15. Zhao, S., Chu, Y., Zhang, C., Lin, Y., Xu, K., Yang, P., et al. Diet-induced central obesity and insulin resistance in rabbits. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl). 92 (1), 105-111 (2008).
  16. Helfenstein, T., Fonseca, F. A., Ihara, S. S., Bottos, J. M., Moreira, F. T., Pott, H. Jr, et al. Impaired glucose tolerance plus hyperlipidaemia induced by diet promotes retina microaneurysms in New Zealand rabbits. Int J Exp Pathol. 92 (1), 40-49 (2011).
  17. Ning, B., Wang, X., Yu, Y., Waqar, A. B., Yu, Q., Koike, T., et al. High-fructose and high-fat diet-induced insulin resistance enhances atherosclerosis in Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits. Nutr Metab (Lond). 12, 30 (2015).
  18. Liu, Y., Li, B., Li, M., Yu, Y., Wang, Z., Chen, S. Improvement of cardiac dysfunction by bilateral surgical renal denervation in animals with diabetes induced by high fructose and high fat diet. Diabetes Res Clin Pract. 115, 140-149 (2016).
  19. Arias-Mutis, O. J., Marrachelli, V. G., Ruiz-Saurí, A., Alberola, A., Morales, J. M., Such-Miquel, L., Monleon, D., Chorro, F. J., Such, L., Zarzoso, M. Development and characterization of an experimental model of diet-induced metabolic syndrome in rabbit. PLoS One. 12 (5), e0178315 (2017).
  20. Nelson, R. W., Himsel, C. A., Feldman, E. C., Bottoms, G. D. Glucose tolerance and insulin response in normal-weight and obese cats. Am J Vet Res. 51 (9), 1357-1362 (1990).
  21. Staup, M., Aoyagi, G., Bayless, T., Wang, Y., Chng, K. Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test. J Vis Exp. (117), e52895 (2016).
  22. Hall, J. E., do Carmo, J. M., da Silva, A. A., Wang, Z., Hall, M. E. Obesity-induced hypertension: interaction of neurohumoral and renal mechanisms. Circ Res. 116 (6), 991-1006 (2015).
  23. Linz, D., Hohl, M., Mahfoud, F., Reil, J. C., Linz, W., Hübschle, T., Juretschke, H. P., Neumann-Häflin, C., Rütten, H., Böhm, M. Cardiac remodeling and myocardial dysfunction in obese spontaneously hypertensive rats. J Transl Med. 10 (10), 187 (2012).
  24. Sasser, T. A., Chapman, S. E., Li, S., Hudson, C., Orton, S. P., Diener, J. M., Gammon, S. T., Correcher, C., Leevy, W. M. Segmentation and measurement of fat volumes in murine obesity models using X-ray computed tomography. J Vis Exp. (62), e3680 (2012).
  25. Kawai, T., Ito, T., Ohwada, K., Mera, Y., Matsushita, M., Tomoike, H. Hereditary postprandial hypertriglyceridemic rabbit exhibits insulin resistance and central obesity: a novel model of metabolic syndrome. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (12), 2752-2757 (2006).
  26. Shiomi, M., Kobayashi, T., Kuniyoshi, N., Yamada, S., Ito, T. Myocardial infarction-prone Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits with mesenteric fat accumulation are a novel animal model for metabolic syndrome. Pathobiology. 79 (6), 329-338 (2012).
  27. Hildrum, B., Mykletun, A., Hole, T., Midthjell, K., Dahl, A. A. Age-specific prevalence of the metabolic syndrome defined by the International Diabetes Federation and the National Cholesterol Education Program: The Norwegian HUNT 2 study. BMC Public Health. 7, 220 (2007).

Tags

Medicin spørgsmål 134 metabolisk syndrom dyremodeller kanin hjerte-kar-sygdom blodtryk glukosetolerance
En eksperimentel Model af kost-induceret metabolisk syndrom i kanin: metodiske overvejelser, udvikling og vurdering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arias-Mutis, Ó. J., Genovés,… More

Arias-Mutis, Ó. J., Genovés, P., Calvo, C. J., Díaz, A., Parra, G., Such-Miquel, L., Such, L., Alberola, A., Chorro, F. J., Zarzoso, M. An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment. J. Vis. Exp. (134), e57117, doi:10.3791/57117 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter