Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En experimentell modell av kost-inducerad metabola syndromet i kanin: metodologiska överväganden, utveckling och bedömning

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57117
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 5, 2,3, 6, 2, 2, 1,3, 6
1CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, 2Department of Physiology, Universitat de València, 3INCLIVA, 4Department of Electronic Engineering, Universidad Politécnica de Valencia, 5UCIM, Universitat de València, 6Department of Physiotherapy, Universitat de València

Summary

Vi beskriva metoder för att utveckla en experimentell modell av kost-inducerad metabola syndromet (MetS) hos kaniner med hjälp av en hög fetthalt, hög-sackaros diet. Djur framkallade central fetma, mild hypertoni, före diabetes och dyslipidemi, därmed återger de viktigaste komponenterna i mänskliga MetS. Denna kroniska modell gör att förvärvet av kunskap bakomliggande mekanismer för sjukdomsprogression.

Abstract

Under de senaste åren, har fetma och metabola syndromet (MetS) blivit ett växande problem för folkhälsa och klinisk praxis, med tanke på deras ökad prevalens på grund av ökningen av stillasittande livsstilar och ohälsosamma matvanor. Tack vare djurmodeller, kan grundläggande forskning undersöka mekanismerna bakom patologiska processer såsom MetS. Här beskriver vi de metoder som används för att utveckla en experimentell kanin modell av kost-inducerad MetS och dess bedömning. Efter en period av acklimatisering, skall djuren utfodras en hög fetthalt (10% hydrerade kokosolja och 5% ister), hög-sackaros (15% sackaros upplöst i vatten) diet under 28 veckor. Under denna period flera experimentella rutiner utfördes för att utvärdera de olika komponenterna i MetS: morfologiska och blodtrycksmätningar, glukos tolerans bestämning och analys av flera plasma markörer. I slutet av försöksperioden, djur utvecklat central fetma, mild hypertoni, före diabetes och dyslipidemi med lågt HDL och högt LDL ökning av triglycerider (TG), därmed återger de viktigaste komponenterna i mänskliga MetS. Denna kroniska modell tillåter nya perspektiv för att förstå de underliggande mekanismerna i förloppet av sjukdomen, detektion av prekliniska och kliniska markörer som tillåter identifiering av riskpatienter, eller ens den test av nya terapeutiska metoder för behandling av denna komplexa patologi.

Introduction

Fetma och metabola syndromet (MetS) har blivit ett växande problem för folkhälsa och klinisk praxis, med tanke på deras ökad prevalens på grund av ökningen av stillasittande livsstilar och ohälsosamma matvanor vanor1. Det finns flera definitioner av MetS, men de flesta av dem beskriver det som ett kluster av kardiovaskulära och metabola förändringar såsom bukfetma, minskat HDL och högt LDL-kolesterol, förhöjda triglycerider, glukosintolerans och hypertoni2 ,3,4. Diagnosen kräver att tre av dessa fem kriterier är närvarande.

På grund av djurmodeller har grundläggande forskning kunnat undersöka mekanismerna bakom patologiska processer såsom MetS. Flera djurmodeller har använts, men det är av avgörande betydelse att modellera av val reproducerar de viktigaste kliniska manifestationerna av den mänskliga patologin (figur 1). Med detta mål, har djurmodeller anses liknar människor, främst hund och svin, utvecklats (se Verkest5 och Zhang & Lerman6 för granskning). Hundarnas modeller visar dock inte alla komponenter i MetS, med tanke på att utvecklingen av åderförkalkning eller hyperglykemi hos hundar med hjälp av kosten är tvivelaktiga5. Svin modeller presentera den mest anatomiska och fysiologiska likheten med människor, och därmed erbjuda betydande prediktiva kraft för att klarlägga mekanismerna bakom MetS, men deras underhåll och komplexiteten i de experimentella rutiner gör användningen Denna modell mycket arbetskraft intensiv och kostsam6.

Å andra gnagare modeller (mus och råtta), kost-inducerad spontana och transgena, har flitigt använts i litteraturen för studier av fetma, hypertoni, och MetS och dess patologiska konsekvenser i olika organ och system (se Wong o.a. 7 för granskning). Även om användningen av dessa modeller är mer prisvärd än hund eller svin, har de viktiga nackdelar. Ja, beroende på stam, djur utveckla vissa komponenter i MetS, medan andra såsom hypertoni, hyperglykemi och Hyperandrogenism är frånvarande7. Dessutom en av de viktigaste komponenterna i MetS, fetma, i vissa genetiskt modifierade stammar, bara beror inte på faktorer som förknippas med kosten, det har snarare visat att vissa djur bli feta med normal eller ens reducerade mat intag8. Slutligen, möss och råttor visar en naturlig brist i cholesteryl ester transfer protein (CETP) och använda HDL som stora transportmedlet kolesterol, vilket gör dem relativt resistenta mot utveckling av åderförkalkning. Detta är en viktig skillnad i lipidmetabolismen med människor som express CETP och transportera deras kolesterol främst i LDL9.

Omvänt, laboratorium kaninen representerar ett mellanstadium mellan större djur och experimentella djurmodeller. Kaninen kan således lämnas enkelt till olika typer av protokoll med minimala krav på personal och underhåll, som lättare hanteras i experimentella rutiner än större djurmodeller. Dessutom har det rapporterats att kaniner som matas med en fettrik kost har liknande hemodynamiska och neurohumoral förändringar som överviktiga människor8,10,11. Notera, angående lipidmetabolismen, kaninen har riklig CETP i plasma och deras lipoprotein profil är LDL-rik12, som också liknande människor. Dessutom kan utveckla kaniner hyperlipidemi ganska snabbt eftersom det som växtätare, de är mycket känsliga för dietary fat13.

Figure 1
Figur 1: jämförelse av MetS djurmodeller. Se Verkest5, Zhang och Lerman6och Wong et al. 7 för granskning. ”Equation 1” indikerar en fördel och ”Equation 2” indikerar en nackdel. *kontroversiella, beror på studien, *som pekade ut av Carroll et al. 8, vissa genetiskt modifierade stammar bli feta oberoende av födointag. CEPT: cholesteryl ester transfer protein. GTT: glukostoleranstest. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att belysa de grundläggande mekanismerna bakom den patologiska remodeling producerad av MetS i olika organ och system, och att få förståelse av detta komplexa patologi, valet av en experimentell modell som återger de viktigaste komponenterna i mänskliga MetS är viktigt. Kaninen kan ge många fördelar med tanke på dess likhet med människans fysiologi och överkomliga priser för användning i kronisk protokoll och mätningar. I denna linje, några kost-inducerad kanin modeller med hög fetthalt och hög-sackaros diet har varit används14,15,16,17,18,19 (tabell 1), och en karakterisering av de olika komponenterna i MetS är av stor betydelse när det gäller en fenotyp med orgel remodeling. Således, denna artikels Huvudsyftet är att beskriva metoderna för att utveckla en modell för kost-inducerad MetS i kaniner som gör studien av dess patofysiologi och inverkan i orgel ombyggnad.

Studie Kost Varaktighet Rasen MetS komponenter
Ob HT HG Dl
Yin et al. (2002)14 ·    10% fett 24 veckor ·      Manliga NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    37% sackaros ·      2 kg
Zhao et al. (2007)15 ·    10% fett 36 veckor ·      Manliga JW Equation 1 Equation 2 Equation 2 Equation 2
·    30% sackaros ·      16 veckor
Helfestein et al. (2011)16 ·    10% fett 24 veckor ·      Manliga NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    40% sackaros ·      12 veckor
·    0,5-0,1 kolesterol
Ning et al. (2015)17 ·    10% fett 8-16 veckor ·      Manliga WHHL Equation 2 - Equation 2 Equation 1
·    30% fruktos * ·      12 veckor
LiU et al. (2016)18 ·    10% fett 48 veckor ·      Manliga NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    30% sackaros ·      12 veckor
Arias-Mutis et al. (2017)19 ·    15% fett 28 veckor ·      Manliga NZW Equation 1 Equation 1 Equation 1 Equation 1

Tabell 1: Diet-inducerad MetS kanin modeller med hög fetthalt, hög-sackaros diet. Symbolen ”Equation 2” indikerar frånvaro ”,Equation 1” närvaro, och ”-” inte utvärderas. * begränsad. WHHL, Watanabe ärftliga hiperlipidemic kaniner. JW, japanska vita kaniner. OB, fetma. HT, hypertoni. HG, hyperglykemi. Dl, dyslipidemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurvård och de experimentella protokoll som används i denna studie följt EU direktiv 2010/63 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål, och godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (2015/VSC/ärter/00049).

Obs: Protokollet består av kronisk administrering av en hög fetthalt, hög-sackaros diet under 28 veckor och bedömningen av de viktigaste komponenterna i MetS. Vi använde 11 vuxna manliga nya Zeeland White (NZW) kaniner väger 4.39 ± 0,14 (s.d.) kg, vilket var 20-22 veckor gamla i början av det experimentella protokollet. De inkvarterades i ett rum med luftfuktighet (50 ± 5%) och temperatur (20 ± 1,5 ° C) kontrollerade villkor med en 12-h ljus cykel. Den orden ”chow” och ”diet” kan användas omväxlande i protokollstegen.

1. diet Administration

  1. Skaffa eller förbereda Dieter
    1. Skaffa en kommersiellt tillgänglig hög fett diet med extra hydrerade kokosolja (10%) och ister (5%)19. Denna diet ger 3,7 kcal·g-1.
    2. Förbereda 5 till 15% sackaros lösningar genom upplösning i lämpliga mängder sackaros i steriliserat vatten (t.ex., användning 300 g sackaros i 2 L lager för en 15% sackaroslösning). En 15-procentig lösning ger 0,6 kcal·mL-1.
    3. Skaffa ett kommersiellt tillgängliga kontroll kost19, vilket ger 2,7 kcal·g-1.
  2. Acklimatiserar sig djuren i 4 veckor
    1. Foder varje djur i kontrollgruppen 120 g av kontroll kost dagligen. Ge vatten ad libitum.
    2. Foder i MetS grupp 250 g chow börjar med en 50% kontroll och 50% hög fetthalt chow, öka gradvis till 100% fettrik chow i slutet av vecka 4.
      Obs: Syftet är att uppnå: (i) 35% kontroll och 65% hög fetthalt chow i slutet av vecka 1. (ii) 25% kontroll och 75% hög fetthalt chow i slutet av vecka 2. (iii) 15% kontroll och 85% hög fetthalt chow i slutet av vecka 3. (iv) 100% fettrik chow i slutet av vecka 4.
    3. Ge djuren i MetS gruppen vatten med 5% sackaros i början och öka sackaroshalten till 15% i slutet av 4: e veckan.
    4. Registrera det dagliga intaget av chow och sackaros lösning att beräkna kaloriintaget enligt värdena som anges i 1.1.1. och 1.1.2.
  3. Inducera MetS (28 veckor)
    1. Foder varje djur i kontrollgruppen 120 g kontroll chow och vatten ad libitum dagligen.
    2. Mata djuren i gruppen MetS 250 g hög fetthalt chow och 15% sackaros i vatten. Ersätta chow dagligen och sackaros lösningen var tredje dag.
    3. Väga de återstående chow och vatten dagligen för att beräkna dagliga intaget.

2. morfologisk bedömning

  1. Mäta djurens kroppsvikt på veckobasis.
  2. Mäta höjd, längd, buken konturoch tibial längdoch beräkna BMI före administrering av den experimentella dieten och vecka 14 och 28 i sövda djur.
    1. Cannulate höger öra marginell ven med en steril engångs kateter (18-22 G) och injicera propofol (8 mgkg-1) följt av 1,5 mL 0,9% NaCl-lösning. I den sövda kaninen, utföra de mätningar som anges i efterföljande steg.
    2. Mått höjd och längd. Använda mätinstrument tejp, mäta och registrera avståndet från näsan till hälen i sidled decubitus position (längd). I samma position, ta avstånd från acromion i axeln till spetsen av tass (höjd).
    3. Beräkna Body mass index (BMI)20 som kroppsvikt (kg) · [kropp längd (m) × höjd (m)] -1.
    4. Placera måttbandet försiktigt runt buken konturen och ta en mätning med djuret i ryggläge.
    5. Mäta tibial längd från den nedre delen av knäleden till införandet av hälsenan.

3. fasta Glycemia och intravenös glukostoleranstest (IVGTT)

Obs: Det är lämpligt att starta förfaranden samma tid på dagen (dvs, 2-3 PM).

  1. Förbereda en glukos stamlösning (60%) med 60 g glukos i 100 mL 0,9% NaCl-lösning.
  2. Snabbt placera djuret för 7 h (ta bort mat och underhålla vatten), sedan medvetet kaninen i en fasthållning i liggande position. Förbered blodsockermätare (infoga en ny remsa i mätaren) och ta första provet från vänster öra marginell venen med en lansett för att få en droppe blod. Tryck sedan på blod droppa med test strip och mäta glukos i blodet med hjälp av glukos mätaren för att bestämma fasta glycemia.
  3. Cannulate höger öra marginell ven med en disponibel kateter (18-22 G) och injicera en bolusdos av en 60-procentig glukoslösning (0,6 g·kg-1).
    Obs: För att förbereda bolus, tillsätt 1 mL/kg av glukos beståndet.
  4. Ta blodprov med hjälp av lancet (en droppe blod) på 15, 30, 60, 90, 120 och 180 min efter glukos injektion och analysera dem med blodsockermätare som i 3.2.
  5. Ta bort disponibla katetern och nyp platsen för katetrar med en kompress. När blodet har koagulerat, ta bort gasväv och kontrollera status för djuret.

4. blodtryck

  1. Förbereda förvärvsystemet inklusive en tryckgivare, en 10 mL spruta med 0,9% NaCl, en tre-vägs Avstängningskranen, en förstärkare och en PC/laptop med programvaran förvärvet (för blodtryck inspelning).
  2. Ställa in utrustningen. Först placera trevägs Avstängningskranen och sprutan i tryckgivaren, mellan givaren och katetern, och Anslut tryckgivaren till förstärkaren. Sedan ansluta förstärkaren till din PC/laptop.
  3. Kalibrering tryck-givaren enligt tillverkarens rekommendationer.
  4. Placera den medvetna djuren i en kanin fasthållning i liggande position. Värma upp örat innan kanylering, lokalt och applicera sedan lokalbedövning (2,5% lidocaine/prilocaine) i örat runt platsen för insättning. Knacka försiktigt på området där vaskulär paketet går att enkelt identifiera artären. Sedan infoga en steril kateter (18-22 G) i den vänstra öra centrala artären. Lossa begränsningarna och tillåter djuret att hålla tyst i 30 min.
  5. Spela in blodtryck kontinuerligt i 20 min direkt från den arteriell kateter, utsläppande tryckgivaren placerad bredvid djuret på hjärtat nivå (samplingsfrekvens: 1 KHz, se figur 5B).
    Obs: Att hålla blodtrycket (BP) inspelning gratis från blod koagulation störningar (BP signal förlorar amplitud eller försvinner), NaCl (0,9%) injektion bör göras. Använder tre-vägs Avstängningskranen, nära kretsen som går från givaren till katetern, öppna den kretsen som går från sprutan till katetern och injicera 1-2 mL. Detta tar bort blodproppar som bildas i katetern. Sedan, öppna kretsen mellan givaren och katetern och fortsätta inspelningen när signalen har återvunnits.
  6. När inspelningen är klar, ta bort katetern och nyp med en kompress i platsen för katetrar att stoppa blodförlusten. När blodet har koagulerat, ta bort gasväv och kontrollera status för djuret.

5. plasma mätningar

Obs: Det är lämpligt att starta förfaranden samma tid på dagen (dvs, 2-3 PM).

  1. Snabbt djuret för 7 h (ta bort mat och underhålla vatten), sedan placera den medvetna djuren i en fasthållning i liggande position och infoga en steril 21 G nål i vänster öra marginell venen. När blodet börjar droppa, kasta första droppen och samla in blodprover i EDTA-rör upp till den nivå som anges i röret. Lagra proverna på is.
  2. Centrifugera blodprov på 1.500 x g, 15 min, 4 ° C. Efter centrifugering, sug plasma med pipett och förbereda alikvoter av 250 µL.
  3. Analysera de färska proverna omedelbart. Grundläggande parametrar är följande: triglycerider, totalkolesterol, HDL och LDL kolesterol.
    Obs: Prover inte färska analyseras bör lagras omedelbart i-80 ° C frys. Om är du intresserad av att analysera blodglukos från plasmaprover, bör blodglukos test använda rören med fluor oxalat i stället för EDTA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MetS representerar ett kluster av metabola och kardiovaskulära avvikelser vars studie kan underlättas med hjälp av experimentmodeller. Faktiskt, för att klarlägga mekanismerna bakom de patologiska remodeling produceras av MetS, valet av en experimentell modell som på lämpligt sätt liknar människans villkor och lämpar sig för forskning är av avgörande betydelse. Här presenterar vi metoderna för att framkalla MetS i kanin med en kost rik på mättat fett och sackaros, och en detaljerad karakterisering för dess utvärdering. Användning av kost istället för en genetiskt modifierade djur modell är av stor betydelse eftersom kost påverkar hela kroppen ämnesomsättning19, således som liknar noga vad som händer i människans MetS. Vi använde en fakulteten (blandade modellen) ANOVA med två faktorer, en upprepade mätningar eller ”inom” faktor (tid: pre, vecka 14 och vecka 28, beroende av analysen) och en ”mellan” faktor (grupp: kontroll och MetS) för statistisk analys. Betydelse accepterades när p < 0,05.

Hög fetthalt, hög-sackaros kosten tolereras väl av djuren. En acklimatisering period på 4 veckor är nödvändigt för korrekt övergången från den tidigare utfodring regimen till hög fetthalt, hög-sackaros diet. Djur i kontrollgruppen matas 120 g chow, som har visat sig vara lämpligt för underhåll av vuxen kanin8. Kaniner i gruppen MetS ökade successivt i vikt fram till slutet av det experimentellt protokollet (tabell 2). Djur bör få 50-100 g per vecka. Det är viktigt att kaniner hålls individuellt i burar med tillräckligt utrymme, ljus och miljö anrikning (figur 2 c), och en daglig kontroll av djuren utförs. Också på en daglig basis, måste chow och dryck intag övervakas och registreras, för att uppnå viktökning och upptäcka eventuella hälsoproblem, eftersom kaniner är lätt stressad och svaret kan vara att stoppa näring konsumtion. Dessutom, eftersom fettrik pellets tenderar att vara mycket instabil och förlora konsistensen väldigt lätt, förvandlas till pulver som kaniner inte äter, är det av avgörande betydelse för mycket noggrant förbereda de dagliga portioner av chow (figur 2A). I figur 3A, kan vi observera beteendet hos energiintag och dess variationer, allt från 250 till 815 kCal i gruppen MetS. I figur 3Bavbildas relativa bidrag av de olika energikällorna (chow och dryck). Det finns kritiska perioder i vecka 14 och 28, eftersom stress produceras av experimentella rutiner, kaniner kan minska chow och vatten intag. Dagliga kvantifiering möjliggör snabb identifiering av detta problem, som kan undvikas genom att införa kontroll chow (80% hög fetthalt 20% kontroll) och minskande sackaros lösningen från 15% till 10%, eller ens 5%, under 2-3 dagar tills djuren återhämta sina normala intag värden. Djur framkallade också central fetma som visas av ökat vikt, buken omkrets och BMI (tabell 2), som är nära besläktad med de riskfaktorer som definierar MetS3.

Figure 2
Figur 2: Diet administration. I panel A, styra chow (överst) och fettrik chow (nedan) skildras, visar skillnaderna mellan två på grund av det extra fettet. För att undvika att pulvret som gör hög fetthalt pellets mindre tilltalande, är det nödvändigt att använda en sil till separata fettrik pellet pulver (Panel A, botten). I panelen B, vi kan observera de material som behövs för att göra dricka lösningen (vänster), och hur det är lämpligt att göra en stamlösning att distribuera i vattenmunstycket. Slutligen, välfärd för djuren är mycket viktigt, och de får inhysas individuellt i burar (C) med tillräckligt med utrymme och ljus och, om möjligt, miljömässiga anrikning (dvs, plattformar, leksaker, etc.). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: energiintag. Utvecklingen av intaget under 28 veckor av försöksperioden är avbildad i panel A för kontroll och MetS. Det relativa intaget (i procent) av kCal från fettrik chow och dricka lösningen av MetS djur visas i panelen B. kontroll (n = 5), MetS (n = 6). Felstaplar: SD. ändrad från Arias-Mutis et al. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Inför kost Vecka 14 Vecka 28
Kontroll MetS Kontroll MetS Kontroll MetS
Vikt (Kg) 4.35(0.15) 4.43(0.14) 4.49(0.12) 5.42(0.17) 4.51(0.13) 5.75(0.6)
Längd (cm) 52.4(1.6) 53.6(1.7) 52.5(0.8) 54.4(1.7) 53.7(0.7) 54.6(0.8)
Höjd (cm) 25.9(0.7) 25.5(1.1) 25.9(2.2) 26.1(5.3) 26.0(1.0) 26.1(1.5)
Abdom. omkretsen (cm) 39.8(1.7) 40.5(1.4) 38.5(1.5) 47.5(2.2) 38.1(1.0) 49.7(3.5)
Tibial längd (cm) 16.4(0.8) 16.3(0.7) 16.7(0.3) 16.7(0.4) 17.4(0.4) 16.8(0.6)
BMI (Kg/m2) 32.8(1.9) 32.9(2.6) 32.8(1.2) 36.8(1.9) 32.6(2.1) 39.3(6.0)

Tabell 2: morfologiska kännetecken. Vi hittade skillnader när man jämför kontroll vs. MetS vid vecka 14 och 28 i vikt (huvudsakliga effekt p = 0,003, η2 = 0,6; parvisa jämförelser vid vecka 14 p < 0,001 och vecka 28 p < 0.001), buk omkrets (huvudsakliga effekt p < 0,001, η2 = 0,9 pairwise jämförelser vid vecka 14 p < 0,001 och vecka 28 p < 0.001), och BMI (huvudsakliga effekt p = 0,016, η2 = 0,5; parvisa jämförelser vid vecka 14 p < 0,001 och vecka 28 p < 0,001). Kontroll (n = 5) och MetS (n = 6). Värdena uttrycks som menar (SD). Modifierad från Arias-Mutis et al. 19.

Angående fastande blodglukos spelar svaret på IVGTT en nyckelroll i karakterisering av glukos homeostas21. Vi Observera lindrig hyperglykemi vid vecka 14, som når en platå och upprätthåller liknande värden på vecka 28 (figur 4A). Arean under kurvan (AUC) ökar också i gruppen MetS (figur 4B). Trots att begränsningsvärden att identifiera typ II diabetes hos kaniner baserat på fastande blodglukos har ännu inte erkända19med detta experimentellt protokoll, kaniner läggs upp till 28 veckor av hög fetthalt, utvecklat hög-sackaros utfodring pre-diabetes med nedsatt fasteglukos och glukosintolerans.

Figure 4
Figur 4: blod glukos förordningen. Resultaten av IVGTT i kontroll och MetS djur vid vecka 14 och 28 visas i panelen A. Kvantifiering av arean under kurvan (AUC) från 0 till 180 min skildras i panelen B med en låda och morrhår tomt. Denna parameter ökade MetS djur veckor 14 och 28 jämfört med kontroller (huvudsakliga effekt p = 0,001, η2 = 0,5; parvisa jämförelser vid vecka 14 p = 0,001 och vecka 28 p = 0,002). Kontroll (n = 5), MetS (n = 6). Modifierad från Arias-Mutis et al. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Hypertoni är ett nära och direkt relaterad till graden av fetma. Kaniner utfodras en hög fetthalt, hög-sackaros diet under 28 veckor visade en ökning i systoliskt, diastoliskt, och genomsnittlig redan vid vecka 14 och denna ökning i blodtrycket upprätthålls på vecka 28 (figur 5 c – E). Med tanke på det nära sambandet mellan blodtryck och BMI22, är det av stor betydelse så att djuren få vikt successivt för att erhålla en betydande ökning av blodtrycket.

Figure 5
Figur 5: ändringar i blodtryck. Panel A skildrar katetern insatt i auricular artären. Att notera är eftersom ven och auricular artären kör genom bettet av örat mycket noga, det av avgörande betydelse att skilja dem. Innan kanylering är det lämpligt att värma upp örat och, efter topikal anestesi, att knacka försiktigt området där vaskulär paketet körs. Artären har en tjockare kärlväggen och en ljusare färg än venen, och blod pulser kan observeras. Panel B visar den experimentella setup med tryckgivaren, som är ansluten till en förstärkare och registrerar kontinuerligt signalen (BP inspelning). Paneler C och D Visa rutan och morrhår tomter av systoliskt och diastoliskt blodtryck vid vecka 14 och 28 i både experimentella grupper. Genomsnittliga arteriella trycket (karta) presenteras i panelen E. Vi hittade skillnader när man jämför kontroll vs. MetS vid vecka 14 och 28 i systoliskt (huvudsakliga effekt p = 0,003, η2 = 0,4; parvisa jämförelser vid vecka 14 p = 0,029 och vecka 28 p = 0,013), diastoliskt (huvudsakliga effekt p = 0,027, η2 = 0,3; parvisa jämförelser vid vecka 14 p = 0,036 och vecka 28 p = 0,001) och karta (huvudsakliga effekt p = 0,006, η2 = 0,4; parvisa jämförelser vid vecka 14 p = 0,027 och vecka 28 p = 0,001). Kontroll (n = 5), MetS (n = 6). Modifierad från Arias-Mutis et al. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Slutligen, för att bedöma utvecklingen av MetS, en utvärdering av förändringar i plasma biokemiska markörer behövs. Vi observerade en förändring i lipidprofilen så tidigt som vecka 14 i denna kroniska modell, och denna förändring var stabil fram till vecka 28, utan ytterligare ökningar av skillnaderna. Ändringar i plasma lipidprofilen kännetecknas av en ökning av triglycerider och LDL, en minskning av HDL, och inga förändringar i totalkolesterol i MetS djur jämfört med kontroller vid båda bedömningstidpunkterna (vecka 14 och 28) (tabell 3).

Vecka 14 Vecka 28
Kontroll MetS Kontroll MetS
Totalkolesterol (mg·dL-1) 20.4(2.3) 24.0(9.1) 27.4(15.7) 21.2(4.4)
HDL (mg·dL-1) 9.1(4.2) 4.3(1.7) 11.2(4.2) 5.1(2.9)
LDL (mg·dL-1) 3.8(1.1) 8.7(4.5) 4.0(1.2) 13.8(9.3)
Triglycerider (mg·dL-1) 71.2(58.8) 118.0(40.7) 30.2(11.4) 76.8(28.2)

Tabell 3: bedömning av plasma biokemi. Vi hittade skillnader när man jämför kontroll vs. MetS vid vecka 14 och 28 i HDL (huvudsakliga effekt p = 0,008, η2 = 0,3; parvisa jämförelser vid vecka 14 p = 0,006 och vecka 28 p = 0.037), LDL (huvudsakliga effekt p = 0,040, η2 = 0,2; parvisa jämförelser vid vecka 14 p = 0,02 8 och vecka 28 p = 0,034), och triglycerider (huvudsakliga effekt p = 0,002, η2 = 0,4; parvisa jämförelser vid vecka 14 p = 0,004 och vecka 28 p = 0,001). Kontroll (n = 5) och MetS (n = 6). Värdena uttrycks som menar (SD). Modifierad från Arias-Mutis et al. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Inrättandet av en lämplig experimentell modell kan ge en mer konsekvent och tillförlitlig metod för att studera utvecklingen av MetS, och det är också nödvändigt att förstå de grundläggande mekanismerna som ligger bakom organ och system remodeling. Här beskriver vi de metoder som används för att utveckla en relevant experimentell modell av kost-inducerad MetS och hur man skall bedöma de viktigaste komponenterna i detta kluster av metabola och kardiovaskulära abnormiteter som kännetecknar denna modell: central fetma, hypertoni, glukosintolerans och dyslipidemi med lågt HDL och högt LDL en ökning av TG nivåer.

En stor styrka av modellen är förmågan att studera villkoret som föregår den kliniska manifestationen av patologin. Faktiskt avseende metabola förändringar, i 28 veckor djur utveckla inte typ II diabetes och var i ett tillstånd av prediabetes (figur 4). På samma sätt plasma biokemiska markörer visade en tydlig förändring i lipidprofilen med en ökning av LDL och TG, en minskning av HDL, men inga ändringar i totalkolesterol (tabell 3), som är en viktig faktor i utvecklingen av åderförkalkning. Även om vi kan notera en ökning av systoliskt, diastoliskt, och karta på vecka 28 (figur 5), kan detta anses vara mild hypertoni. Sammantaget effekterna i de metabola och kardiovaskulära markörerna är blygsamma, men denna modell kan aktivera forskningen av staten innan den manifesterade (och i de flesta fall irreversibla) patologi, vilket möjliggör identifiering av prekliniska och kliniska markörer som kan tillåta att upptäcka patienter i riskzonen.

Dessutom till skillnad från andra MetS djurmodeller (mus, råtta och hund), kan spontan eller transgena kaniner modeller utveckla alla delar av MetS. Intressant nog har det rapporterats att kombinationen av de olika komponenterna i MetS kan förstärka kardiovaskulär risk. Faktiskt förvärras den patologiska remodeling produceras av hypertoni när MetS-komponenter visas23. Denna experimentella modell möjliggör studier av bakomliggande mekanismer, och effekten av de olika komponenterna i kombination. Dessutom med tanke på att kosten påverkar hela kroppen ämnesomsättning, har användning av ett kost-inducerad modell viktig betydelse, nära efterlikna vad som händer i människans MetS19.

Sist men inte minst viktigt styrkan, är balansen mellan relevans och påverkan på translationell forskning och den ekonomiska kostnaden. På ena sidan finner vi svin modeller, mycket likt människor, men mycket dyrt i form av tid, resurser och ekonomiska kostnader. På andra sidan har vi gnagare modeller, som är lätt att genomföra med mycket låg kostnad, men har en lägre generalisering makt. Kanin modellen representerar mittpunkten, eftersom det är tillräckligt flexibelt för många olika typer av studier samtidigt undvika några av nackdelarna med stora djurmodeller, och visar liknande hemodynamiska och neurohumoral förändringar som observerats i mänskliga MetS8, 10,19.

Följande begränsningar av metoderna bör övervägas. Med avseende på central fetma och kroppen fettfördelning, skulle användningen av magnetisk resonanstomografi vara den gyllene standarden, om sådan finns, annars kvantifiering av visceralt fett i slutet av de 28 veckorna. Andra icke-invasiva metoder för longitudinella studier, skulle såsom röntgen datortomografi, vara mer adekvata24. Vi mätte buk omkrets och BMI istället (tabell 2), som har också använts i flera studier på kaniner som ett mått på central fetma25,11,26. Tibial längdmätning kan också vara mer exakt med ekografi eller ett ben radiografi. För att fastställa om orsaken till glukosintolerans i denna kroniska modell är insulinresistens eller minskad insulinproduktion, insulinresistens bör bestämmas med hjälp av ett insulin tolerans test eller fastställer fastande insulinnivåer.

Slutligen, för att förbättra modellen, flera åtgärder kan vidtas. Vi hade förmodligen kunnat erhålla en snabbare ökning av glykemi med kombinationen av korta perioder av alloxan injektion och hög fett, hög sackaros diet, men sedan fenotypen kunde inte hänföras endast till kosten. Ålder kunde spelar också en viktig roll, eftersom vi arbetat med unga vuxna kaniner (4,5 månader gammal när djur kom i de animaliska faciliteterna, 12,5-13 månader gamla i slutet av det experimentella protokollet) och MetS ofta uppstår vid äldre ålder27. Tyvärr, äldre kaniner inte var kommersiellt tillgängliga. Det skulle vara intressant att testa denna modell i äldre djur och observera om fenotypen förvärras.

De metoder som presenteras här för utvecklingen av denna experimentella modell av MetS i laboratoriet kaniner bör ge ett värdefullt verktyg för studier som syftar till att belysa de grundläggande mekanismerna bakom den patologiska remodeling produceras av MetS i de olika organ och system, och få förståelse för denna komplexa patologi. Slutligen, eftersom NZW kaniner är stillasittande djur, denna kost-inducerad modell kan vara användbart att studera hur de olika komponenterna i patologi utvecklas på ett liknande sätt än uppstår i människors MetS, och möjliggör nya perspektiv för att förstå den patofysiologiska mekanismer som är involverade i förloppet av sjukdomen, identifiering av prekliniska och kliniska markörer för att identifiera riskpatienter eller även testning av nya terapeutiska metoder för behandling av denna komplexa patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av Generalitat Valenciana (GV2015-062), Universitat de València (UV-INV-PRECOMP14-206372) till MZ, Generalitat Valenciana (PROMETEOII/2014/037) och Instituto de Salud Carlos III-FEDER medel (CIBERCV CB16/11/0486) till FJC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veterinary scale SOEHNLE 7858 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Shovel for aluminum feed COPELE 10308 Shovel for aluminum feed
http://copele.com/es/herramientas/48-pala-para-pienso-de-aluminio.html
Balance PCE Ibérica PCE-TB 15 Balance
http://www.pce-iberica.es/medidor-detalles-tecnicos/balanzas/balanza-compacta-pce-bdm.htm
Strainer (20 cm diam.) ZWILLING 39643-020-0 Strainer
https://es.zwilling-shop.com/Menaje-del-hogar/Menaje-de-cocina/Menaje-especial/Accesorios/Colador-20-cm-ZWILLING-39643-020-0.html
Bowl ZWILLING 40850-751-0 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Funnel BT Ingenieros not available Funnel
http://www.bt-ingenieros.com/fluidos-y-combustibles/961-juego-de-4-embudos-de-plastico.html?gclid=EAIaIQobChMIuInui_y-1QIVASjTCh28Zwf-EAQYBSABEgK7xPD_BwE
Introcan Certo 22G blue B Braun 4251318 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Propofol Lipuro 10 mg/ml vial 20 ml B Braun 3544761VET General intravenous anesthetic
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/propofol-lipuro-1-
FisioVet serum solution 500ml B Braun 472779 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Film Vet 1,25cm x 5m B Braun OCT13501 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Askina Film Vet 2,50cm x 5m B Braun OCT13502 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Injekt siringe 10ml luer B Braun 4606108V Injection-aspiration syringe of two single-use bodies
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/injekt-
Seca 201 seca seca 201 Ergonomic tape for measuring perimeters
https://www.seca.com/es_es/productos/todos-los-productos/detalles-del-producto/seca201.html#referred
Sterican 21Gx1" - 0,8x25mm verde B Braun 4657543 Single Use Hypodermic Needle
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/agujas-hipodermicas-sterican-
CONTOURNEXT-Meter BAYER 84413470 Blood glucose analysis system
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-meter-2
CONTOUR NEXT test strips BAYER 83624788 Blood glucose test strips
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-test-strips-100-ct-package
MICROLET NEXT LANCING DEVICE BAYER 6702 Lancing device
http://www.contournextstore.com/en/new-microlet-next-lancing-device
MICROLET 2 Colored Lancets BAYER 81264857 Ultra-thin sterile lancet for capillary puncture
http://www.contournextstore.com/en/microlet2-colored-lancets-100s
Injekt 20ml luer siringe B Braun 4606205V Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Mullkompressen 7,5x7,5cm - sterile B Braun 9031219N Sterile gauze packets in envelopes
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-mullkompressen-esteril
Emla lidocaine/prilocaine AstraZeneca not available Local anesthetics
https://www.astrazeneca.es/areas-terapeuticas/neurociencias.html
Introcan Certo 18G short B Braun 4251342 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Introcan Certo 20G B Braun 4251326 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Blood Pressure Transducers-MA1 72-4497 Harvard Apparatus 724497 Transducer for monitoring blood pressure
http://www.harvardapparatus.com/physiology/physiological-measurements/transducers/pressure-transducers/research-grade-pressure-transducers.html
PowerLab 2/26 AD Instruments ML826 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/powerlab
LabChart ver. 6 AD Instruments not available Acquisition software
https://www.adinstruments.com/products/labchart
Animal Bio Amp AD Instruments FE136 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/bio-amps#product-FE136
K2EDTA 7.2mg BD 367861 Blood collection tubes
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=367861
Centrifuge SciQuip 2-16KL Centrifuge
http://www.sigma-centrifuges.co.uk/store/products/refrigerated-sigma-2-16k-centrifuge/
Eppendorf Reference 2, 100 – 1000 μL Eppendorf 4920000083 Pipette
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Pipeteo-44563/Pipetas-44564/Eppendorf-Reference2-PF-42806.html
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30121023 Tubes
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Puntas-tubos-y-placas-44512/Tubos-44515/Eppendorf-Safe-Lock-Tubes-PF-8863.html
NZW rabbits (16-18 weeks old) Granja San Bernardo not available New Zealand White rabbits
http://www.granjasanbernardo.com/en/welcome/
Sucrose  Sigma S0389-5KG Sucrose for drinking solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=es&region=ES
Rabbit maintenance control diet Ssniff V2333-000 Control diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit high-fat diet Ssniff S9052-E020 High-fat diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit rack and drinker Sodispan not available Rack for rabbits
https://www.sodispan.com/jaulas-y-racks/racks-conejo-y-cobaya/
Rabbit restrainer Zoonlab 3045601 http://www.zoonlab.de/en/index.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornier, M. A., Dabelea, D., Hernandez, T. L., Lindstrom, R. C., Steig, A. J., Stob, N. R., et al. The metabolic syndrome. Endocr rev. 29 (7), 777-822 (2008).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P., Shaw, J., Grundy, S. M. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements.html (2006).
  3. Alberti, K. G., Eckel, R. H., Grundy, S. M., Zimmet, P. Z., Cleeman, J. I., Donato, K. A., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
  4. Grundy, S. M. Pre-diabetes, metabolic syndrome, and cardiovascular risk. JACC. 59 (7), 635-643 (2012).
  5. Verkest, K. R. Is the metabolic syndrome a useful clinical concept in dogs? A review of the evidence. Vet J. 199 (1), 24-30 (2014).
  6. Zhang, X., Lerman, L. O. Investigating the Metabolic Syndrome: Contributions of Swine Models. Toxicol Pathol. 44 (3), 358-366 (2016).
  7. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutr Metab (Lond). 13, 65 (2016).
  8. Carroll, J. F., Dwyer, T. M., Grady, A. W., Reinhart, G. A., Montani, J. P., Cockrell, K., et al. Hypertension, cardiac hypertrophy, and neurohumoral activity in a new animal model of obesity. Am J Physiol. 271 (1 Pt 2), H373-H378 (1996).
  9. Grooth, G. J., Klerkx, A. H., Stroes, E. S., Stalenhoef, A. F., Kastelein, J. J., Kuivenhoven, J. A. A review of CETP and its relation to atherosclerosis. J Lipid Res. 45 (11), 1967-1974 (2004).
  10. Zarzoso, M., Mironov, S., Guerrero-Serna, G., Willis, B. C., Pandit, S. V. Ventricular remodelling in rabbits with sustained high-fat diet. Acta Physiol (Oxf). 211 (1), 36-47 (2014).
  11. Filippi, S., Vignozzi, L., Morelli, A., Chavalmane, A. K., Sarchielli, E., Fibbi, B., Saad, F., Sandner, P., Ruggiano, P., Vannelli, G. B., Mannucci, E., Maggi, M. Testosterone partially ameliorates metabolic profile and erectile responsiveness to PDE5 inhibitors in an animal model of male metabolic syndrome. J Sex Med. 6 (12), 3274-3288 (2009).
  12. Waqar, A. B., Koike, T., Yu, Y., Inoue, T., Aoki, T., Liu, E., et al. High-fat diet without excess calories induces metabolic disorders and enhances atherosclerosis in rabbits. Atherosclerosis. 213 (1), 148-155 (2010).
  13. Fan, J., Watanabe, T. Cholesterol-fed and transgenic rabbit models for the study of atherosclerosis. J Atheroscler Thromb. 7 (1), 26-32 (2000).
  14. Yin, W., Yuan, Z., Wang, Z., Yang, B., Yang, Y. A diet high in saturated fat and sucrose alters glucoregulation and induces aortic fatty streaks in New Zealand White rabbits. Int J Exp Diabetes Res. 3 (3), 179-184 (2002).
  15. Zhao, S., Chu, Y., Zhang, C., Lin, Y., Xu, K., Yang, P., et al. Diet-induced central obesity and insulin resistance in rabbits. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl). 92 (1), 105-111 (2008).
  16. Helfenstein, T., Fonseca, F. A., Ihara, S. S., Bottos, J. M., Moreira, F. T., Pott, H. Jr, et al. Impaired glucose tolerance plus hyperlipidaemia induced by diet promotes retina microaneurysms in New Zealand rabbits. Int J Exp Pathol. 92 (1), 40-49 (2011).
  17. Ning, B., Wang, X., Yu, Y., Waqar, A. B., Yu, Q., Koike, T., et al. High-fructose and high-fat diet-induced insulin resistance enhances atherosclerosis in Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits. Nutr Metab (Lond). 12, 30 (2015).
  18. Liu, Y., Li, B., Li, M., Yu, Y., Wang, Z., Chen, S. Improvement of cardiac dysfunction by bilateral surgical renal denervation in animals with diabetes induced by high fructose and high fat diet. Diabetes Res Clin Pract. 115, 140-149 (2016).
  19. Arias-Mutis, O. J., Marrachelli, V. G., Ruiz-Saurí, A., Alberola, A., Morales, J. M., Such-Miquel, L., Monleon, D., Chorro, F. J., Such, L., Zarzoso, M. Development and characterization of an experimental model of diet-induced metabolic syndrome in rabbit. PLoS One. 12 (5), e0178315 (2017).
  20. Nelson, R. W., Himsel, C. A., Feldman, E. C., Bottoms, G. D. Glucose tolerance and insulin response in normal-weight and obese cats. Am J Vet Res. 51 (9), 1357-1362 (1990).
  21. Staup, M., Aoyagi, G., Bayless, T., Wang, Y., Chng, K. Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test. J Vis Exp. (117), e52895 (2016).
  22. Hall, J. E., do Carmo, J. M., da Silva, A. A., Wang, Z., Hall, M. E. Obesity-induced hypertension: interaction of neurohumoral and renal mechanisms. Circ Res. 116 (6), 991-1006 (2015).
  23. Linz, D., Hohl, M., Mahfoud, F., Reil, J. C., Linz, W., Hübschle, T., Juretschke, H. P., Neumann-Häflin, C., Rütten, H., Böhm, M. Cardiac remodeling and myocardial dysfunction in obese spontaneously hypertensive rats. J Transl Med. 10 (10), 187 (2012).
  24. Sasser, T. A., Chapman, S. E., Li, S., Hudson, C., Orton, S. P., Diener, J. M., Gammon, S. T., Correcher, C., Leevy, W. M. Segmentation and measurement of fat volumes in murine obesity models using X-ray computed tomography. J Vis Exp. (62), e3680 (2012).
  25. Kawai, T., Ito, T., Ohwada, K., Mera, Y., Matsushita, M., Tomoike, H. Hereditary postprandial hypertriglyceridemic rabbit exhibits insulin resistance and central obesity: a novel model of metabolic syndrome. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (12), 2752-2757 (2006).
  26. Shiomi, M., Kobayashi, T., Kuniyoshi, N., Yamada, S., Ito, T. Myocardial infarction-prone Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits with mesenteric fat accumulation are a novel animal model for metabolic syndrome. Pathobiology. 79 (6), 329-338 (2012).
  27. Hildrum, B., Mykletun, A., Hole, T., Midthjell, K., Dahl, A. A. Age-specific prevalence of the metabolic syndrome defined by the International Diabetes Federation and the National Cholesterol Education Program: The Norwegian HUNT 2 study. BMC Public Health. 7, 220 (2007).

Tags

Medicin fråga 134 metabola syndromet djurmodeller kanin hjärt-kärlsjukdom blodtryck glukostolerans
En experimentell modell av kost-inducerad metabola syndromet i kanin: metodologiska överväganden, utveckling och bedömning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arias-Mutis, Ó. J., Genovés,… More

Arias-Mutis, Ó. J., Genovés, P., Calvo, C. J., Díaz, A., Parra, G., Such-Miquel, L., Such, L., Alberola, A., Chorro, F. J., Zarzoso, M. An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment. J. Vis. Exp. (134), e57117, doi:10.3791/57117 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter