Isolation og kultur af gnaver mikroglia at fremme en dynamisk forgrenet morfologi i serumfrit Medium

Summary

Bestræbelser på at forstå microglial funktion i detaljer har været hæmmet af manglen på microglial kultur modeller, at sammenfatte egenskaberne af modne i vivo mikroglia. Denne protokol beskriver en isolation og kultur tilgang har til formål at fastholde robuste overlevelse af stærkt forgrenet modne rotte mikroglia defineret-medium betingelser.

Abstract

Mikroglia udgør 5-10% af alle centrale nervesystem (CNS) celler og i stigende grad henlede opmærksomheden på grund af deres bidrag under udvikling, homøostase, og sygdom. Selvom makrofager er blevet studeret i detaljer i årtier, specialiserede funktioner i mikroglia, væv-resident makrofager i CNS, forblevet stort set mystiske, delvis på grund af begrænsninger i evnen til at sammenfatte modne microglial egenskaber i kultur. Her viser vi en enkel procedure for hurtig isolering af ren mikroglia fra modne gnaver hjernen. Vi beskriver også serumfrit dyrkningsbetingelser, der understøtter høje niveauer af microglial rentabilitet over tid. Mikroglia kulturperler disse defineret-medium betingelser udviser omfattende forgrenet processer og dynamiske overvågning adfærd. Vi illustrere nogle effekter af serum eksponering på kulturperler mikroglia og drøfte, hvordan disse serumfrit kulturer sammenlignet med både serum-eksponerede kulturer samt mikroglia in vivo.

Introduction

Som makrofager af CNS parenkym, mikroglia interagere med en bred vifte af neuronal kredsløb og glial signaling netværk. De spiller en vital rolle i udvikling og homøostase i hjernen gennem synaptic beskæring, apoptotiske celle clearance og forbigående interaktioner med neuronal processer^1,2. Mikroglia er tidlige respondere til Neurologiske skader, udvide deres lange, tynde processer til læsion websteder til at koordinere inflammatoriske respons og begrænse blødning^3,4. Ændringer i microglial morfologi og funktion er allestedsnærværende i både akutte og kroniske CNS skader, og mikroglia udstille ændret morfologi, lokalisering og udtryk af inflammatoriske mediatorer i en bred vifte af sygdom stater¹. Menneskets genetiske undersøgelser tyder på, at mutationer, der ændrer risiko for neurodegenerative sygdomme er ofte hovedsagelig eller udelukkende udtrykt af mikroglia i intakt CNS, peger på en afgørende rolle for mikroglia i sygdom patogenese eller progression⁵ . I betragtning af deres fremtrædende plads i skader og sygdom, er fremme forståelsen af microglial biologi en høj prioritet for at udvikle nye behandlingsformer.

Mange kritiske forskud til forståelsen af microglial biologi er opstået ved at ekstrapolere teknikker og mekanismer opdaget i undersøgelser af andre makrofag populationer herunder kultur metoder, gene expression profiler og definitioner af funktionelle / morfologiske stater. Selvom generaliseret makrofag funktioner spiller ofte på overraskende måder inden for CNS landskab, mikroglia er selv højt specialiserede, udstiller en forgrenet morfologi og en enestående gen expression signatur, der adskiller dem fra andre væv makrofager⁶. Mikroglia har en afstamning, der adskiller sig fra de fleste andre væv makrofager; de kolonisere CNS under en tidlig embryonale bølge af primitiv bloddannelsen og selv forny hele liv, uafhængigt af bidrag fra endelige bloddannelsen⁷. Fuldt modne gen expression underskrift voksen mikroglia opnås ikke indtil den anden postnatal uge⁸. Miljømæssige signaler fra det omkringliggende væv spiller en stor rolle i dikterer væv-specifikke makrofag funktioner⁶, som i CNS omfatter begrænset eksponering for blodbårne faktorer ydet af blod - hjerne barrieren⁹.

En hindring for fuldt ud at forstå microglial bidrag til CNS homøostase og sygdom er vanskeligheden ved recapitulating de specialiserede egenskaber af modne mikroglia set i vivo med oprensede celler in vitro-. Mange metoder er blevet udviklet for at isolere og kultur intakt mikroglia, men de fleste tilgange stole på serum til at støtte celle overlevelse. Vi har vist, at tilsætning af serum, der er en iboende variable reagens, der indeholder en bred vifte af bioaktive molekyler, er særligt problematisk, når arbejdet med mikroglia fordi det fremmer en amoeboid morfologi, øget spredning, og øget fagocytose⁹ ses ofte i vivo når mikroglia udsættes for blod båret faktorer efter afbrydelse af blod - hjerne barrieren. Af disse målinger, serum-eksponerede celler ligner mikroglia skade eller sygdom stater, men sådanne ændringer er reduceret Hvornår mikroglia er kulturperler i definerede vækstmedium, der indeholder CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol og selenite.

Denne protokol giver detaljer dyrkning juvenile rotte mikroglia under serumfrit betingelser relateret til nyligt offentliggjorte arbejde⁹. Denne protokol er blevet strømlinet for rotter fra postnatal dag 21-30 (P21 - P30), men kan tilpasses til at isolere mikroglia fra rotter og mus i enhver alder, selv om udbyttet og overordnede rentabilitet vil variere afhængigt af arterne af og alder af dyr. Maksimal udbytter og optimal rentabilitet opnås ved brug af lidt umodne mikroglia (~ P9), udbytter og levedygtighed gradvis smallere til en noget lavere niveauer hos voksne dyr. Mikroglia kan også isoleres fra mus, men vi har fundet, at rotte celler viser betydeligt højere udbytter, levedygtighed og kompleksiteten af forgrenet morfologier, sammenlignet med musen celler i serumfrit kulturer. Dyr på større end P50 er ikke blevet evalueret med denne protokol. Denne immunopanning isolation procedure er blevet optimeret, at minimere ændringer i microglial transcriptional profiler under isolation og maksimere downstream levedygtighed af celler. Ved hjælp af disse teknikker og medier formuleringer, kan høj-levedygtighed primære kulturer opretholdes i ugevis. Mikroglia kulturperler disse betingelser udviser en stærkt forgrenet morfologi med hurtig udvidelse og sammentrækning af processer og lave relativt priser af spredning. Vi fremhæve betydningen af serum-eksponering på disse egenskaber, og diskutere styrker og svagheder ved denne metode i forhold til andre metoder.

Protocol

Alle procedurer, der involverer gnavere i overensstemmelse med retningslinjerne for Stanford University, som er i overholder med nationale og statslige love og politikker. Alle dyr procedurer blev godkendt af Stanford University's Administrative Panel for Laboratory Animal Care.

Bemærk: Alle løsning og buffer kompositioner leveres i Tabel af materialer.

1. Forbered en petriskål for CD11b Immunopanning (dag 0)

Bemærk: Forberede hver 1-2 juvenile rat brains 1 immunopanning parabol.

1. Tilsættes 25 mL 50 mM Tris pH 9.5 løsning til en 15-cm petriskål.
2. Tilføje ged anti-mus IgG (H + L-kæder) til parabol til en endelig koncentration på 6 µg/mL. Swirl plade til jævnt.
3. Inkuber parabol i 1-3 timer ved 37 ° C.
4. Skyl retter tre gange med DPBS +⁺ (fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med Ca^{2 +} og Mg^{2 +}), derefter erstatte med en opløsning af panorering buffer indeholdende 1 µg/mL OX42 antistof. Forlade retter natten over ved stuetemperatur på en flad overflade.

2. Vævscentre samling (dag 1)

Bemærk: Denne protokol bør tage ~ 3-4 h.

1. Før starten, sikre alle løsninger er steril og kold på is. Chill alle instrumenter på is og sterilisere med ethanol før anvendelsen.
2. Følgende passende lovgivningsmæssige procedurer, ofre en juvenil laboratorium rotte ved CO2-kvælning.
   Bemærk: Alternativt yngre dyr kan ofres med en dødelig dosis ketamin/xylazin (100-200 µL af 24 mg/mL ketamin, 2,4 mg/mL xylazin). Ketamin/xylazin skal anvendes, hvis dyrene er mindre end 14 dage gammel. Hvis du bruger flere dyr, uddrag af væv fra et dyr, og Anbring det i pre kølet DPBS⁺⁺ på is, før du fortsætter til efterfølgende dyr.
3. Knib en hindpaw og sikre fuldstændig passivitet fra dyr, før du fortsætter.
4. Transcardially perfuse dyret med 10-30 mL iskold perfusion buffer ved hjælp af en 27½-G nål, indtil bufferen kører klar.
   Bemærk: Lydstyrken af Perfusion buffer vil variere afhængigt af størrelse/alder af dyret.
5. Umiddelbart efter perfusion fjerne hovedet af dyret. Kommer fra rygmarven skære den occipital kondyl på hver side med dissektion saks, være omhyggelig med ikke at beskadige hjernen. Efter opskæring hver side omhyggeligt, skæres op én side langs den parietale og frontal knoglen mod den nasale knogler. Med pincet forsigtigt trække sig tilbage i toppen af kraniet, hurtigt fjerne hjernen (eller CNS strukturer af interesse) og placere i pre kølet DPBS⁺⁺ på is.
6. Gentag for alle tilbageværende dyr.
   Bemærk: Alle procedure trin skal udføres i en laminar flow hood under ordentlig sterile forhold.

3. mekanisk Dissociation (dag 1)

1. Efter alle hjerner har været indsamlet, hugge en hjerne i 1 mm³ stykker i en petriskål på isen med en kold skalpel klinge, og overføre til en iskold dounce homogeniseringsapparat med 5-7 mL iskold douncing buffer. Adskille en hjerne på et tidspunkt.
2. Adskille væv med 10-20 blid og ufuldstændige strøg med en løstsiddende dounce homogeniseringsapparat. Passe på ikke at direkte knuse væv i bunden af homogeniseringsapparat, men i stedet impel væv gennem rummet mellem siderne af stemplet og homogeniseringsapparat.
3. Fjern forsigtigt stempel for at forhindre indførelsen af luftbobler. Tillad dårligt dissocierede væv klumper at bilægge til bunden af homogeniseringsapparat, og overføre supernatanten til en ny kølet 50 mL konisk slange.
4. Erstatte den fjernede volumen med friske douncing buffer, og Gentag trin 3.2 og 3.3 i alt 3-4 runder, eller indtil alle væv har været adskilt. Gentag proceduren for hver hjerne.

4. myelin fjernelse (dag 1)

Bemærk: Myelin fjernelse bruges til isolering af mikroglia fra dyr, der er ældre end P12.

1. Måle volumen af cellesuspension i 50 mL konisk røret ved hjælp af en 25 mL pipette, derefter tilføje iskold douncing buffer for at justere det samlede volumen til 33,5 mL.
2. Tilsættes 10 mL af myelin adskillelse buffer (MSB) til cellesuspension og bland grundigt ved at vende røret flere gange. Dette vil resultere i en 23% endelige koncentration af MSB i et volumen på 43,5 mL.
3. Der centrifugeres celler i 15 min. 500 x g ved 4 ° C med langsom bremsning.
   Bemærk: Centrifugen skal tage ca 1,5-2 min. at aftage. Dette vil generere en øverste lag af myelin og døde celle debris, en lidt skumle supernatanten og en mindre pellet, der er beriget til levende celler.
4. Fjern det øverste lag af myelin/snavs og supernatanten med en pipette. Vær forsigtig ved at fjerne det øverste lag at sikre så meget af det er fjernet som muligt.
5. Resuspenderes celle i 12 mL panorering buffer. Forsigtigt hakkede cellesuspension til at opløse alle klumper af celler, der stadig måtte forekomme.

5. Immunopanning (dag 1)

1. Passere cellesuspension gennem en 70 µm celle si at fjerne store snavs eller celle klumper.
2. Skyl OX42-belagt panorering fadet tre gange med DPBS⁺⁺. Tillad ikke pladen til helt tørre mellem vasker.
3. Hæld den sidste DPBS⁺⁺ vask og anvende den filtrerede cellesuspension til panorering fadet. Forsigtigt swirl plade for at distribuere cellerne og derefter inkuberes plade på en flad overflade ved stuetemperatur i 20 min. til at tillade celler til at overholde. Udruge ikke længere end 20 min eller celler vil blive meget vanskeligt at inddrive fra fadet.
4. Skyl panorering fadet med DPBS⁺⁺ 10 gange for at fjerne ikke-tilhænger celler. Mikroglia vil være solidt fastgjort til pladen, så swirl pladen med hvert skyl at sikre fjernelse af andre celler, ikke-tilhænger.
5. Hæld den sidste DPBS⁺⁺ vask og erstatte med 15 mL DPBS⁺⁺ og 200 μl trypsin (1,25% stamopløsning).
6. Inkuber parabol for ≤10 minutter ved 37 ° C med 10% CO₂ til trypsinize.
   Bemærk: Må ikke fortsætte længere end 10 min eller mikroglia vil blive vanskeligt at fjerne.
7. Efter 10 min af trypsinization, vil mikroglia stadig være fast til pladen. Hæld trypsin/DPBS⁺⁺ og forsigtigt vaske 2 x med DPBS⁺⁺ til at fjerne trypsin, erstatte med 12 mL iskold mikroglia vækstmediet (MGM).
8. Sted panorering parabol på isen for 2 min til at svække celle/substrat interaktion, og sørg for skålen er flad at forhindre områder af panorering fad fra udtørring.
9. Pippeteres der kraftigt med en 10-mL pipette og afpipetteres controller på høj hastighed til at tilbagesøge den panorering parabol celler. Tegne en 16 x 16 gitter med strømmen af væske fra pipette til at forsøge at fjerne alle celler.
10. Se celler under mikroskop ved 20 X forstørrelse sørge for celler har løsrevet fra pladen. Mark steder oven på parabol hvor celler er stadig fast, og Gentag pipettering i disse områder.
11. Indsamle cellesuspension og alikvot 3-4 mL af supernatanten pr. 15 mL konisk tube. Spin i 15 min. 500 x g ved 4 ° C med langsom bremsning.
    Bemærk: Spinning mikroglia gennem en lille volumen giver mulighed for maksimal nyttiggørelse af celler.
12. Opsug supernatanten, forlader 0,5 mL af MGM med celle pellet.
13. Resuspend hver pellet i resterende MGM, og pool celler fra alle rør.
14. Tælle celler med hemocytometer.
15. Plade celler som beskrevet i trin 6 - 7 afhængigt af programmet.
16. Kultur celler ved 37 ° C med 10% CO₂.
    Bemærk: Celler kan være kultur for op til 3-4 uger med regelmæssige medieændringer eller en uge med ingen medieændringer.

6. spot belægning vævskultur plader/Coverslips (dag 1)

1. Plade 15 µL af kollagen IV belægning direkte i midten af en 24-godt anioniske/kationiske belagt vævskultur plade (Se Tabel af materialer for detaljer), og der inkuberes i 15 min. ved 37 ° C med 10% CO₂.
2. Efter tælle celler med hemocytometer fortyndet celler til 2,3 x 10⁵/mL i MGM. Opsug kollagen IV spot og straks plade 15 µL af cellesuspension til dette sted; Dette vil give 3,5 x 10³ celler/spot. Inkuber i 5-10 minutter ved 37 ° C med 10% CO₂ til at tillade celler til at overholde, tilsættes 500 µL af CO_{2 -}ekvilibreres TGF-β2/IL-34/kolesterol indeholdende vækstmediet (TIC) forsigtigt til brønden.
3. Hvis plating på coverslips, første frakke sterilt glas coverslips med 10 µg/mL trick-D-lysin (PDL) i H₂O for 1 h i RT, vask 3 gange med H₂O og lad tørre i en hætte i UV-lys. Når coverslips er tør, fortsætte med spot plating på coverslips som beskrevet i trin 6.2.

7. plating for RNA/Protein Isolation

1. På dag 1, frakke hele området af en 24-godt anioniske/kationiske belagt vævskultur plade med kollagen IV belægning og inkuberes i 10 min. - 1 time ved 37 ° C med 10% CO₂, derefter fjerne og straks plade 3-5 x 10⁴ celler/brønd i CO₂ ekvilibreres TIC medier.
2. På dag 2, udføre en 50% media ændring for hver godt dagen efter tilberedning. Døde celler har tendens til at klynge midt i brønden, så tag media derfra.
3. Udføre en 50% media Skift hver 2-3 dage for at opretholde kulturerne. Hvis media ændringer indfører en uønsket variabel for kulturer, kan celler overleve i ca 1 uge uden medieændringer, i modsætning til over 3 uger med regelmæssig vedligeholdelse.

Representative Results

Denne protokol beskriver en metode til kultur høj renhed forgrenet mikroglia fra unge rotter. Lignende resultater kan opnås ved hjælp af umodne, perinatal og voksne dyr, som drøftet nedenfor. Da cellen isolering omfatter ofte subtile nuancer og mange muligheder for celler til at dø, brugte vi kvalitetskontrol checkpoints til at hjælpe med at bestemme succes på forskellige trin. Vi overvågede typisk celle suspensioner ved hjælp af en hemocytometer på flere trin i isolation protokol (figur 1A). Vellykket isolering bør give 2,5-5 x 10⁵ celler/unge dyr. Dyr fra P7 - P15 Vis udbytter tættere til 5 x 10⁵ celler og dyr, der henviser til celler, der er isoleret fra dyr, der er ældre end P30 viser udbyttet tættere til 2,5 x 10⁵ celler og dyr. Ud over overvågning cellen total tæller hele protokol, det er vigtigt at bestemme den overordnede sundhed for isolerede celler, hvilket kan være vanskeligt, fordi mikroglia isoleret på denne måde har en rundet eller bipolar morfologi i løbet af de første dage i kultur . Her har vi medtaget fase billeder af P25 mikroglia i kultur i de første 6 dage efter isolation i TIC og TIC som indeholder 10% føtalt kalveserum (FCS) (figur 1B).

Figur 1: evaluering af celle sundhed under isolation protokol og over 6 dage af kultur. (A) fase-kontrast billeder illustrerer kvalitetskontrol checkpoints på de udpegede trin af proceduren celle isolation. Cellulære suspensioner var afbildet ved at blande 9 µL af den cellulære suspension med 1 µL af 0,4% trypan blå før pålæsning på en hemocytometer. Andre billeder viser den panorering parabol, selv, og alle billederne er vist som et enkelt felt på 20 X forstørrelse. Skalalinjen, 200 µm. MGM, mikroglia vækstmediet. (B) tidsforløb microglial morfologiske ændringer og spredning over 6 dage af kultur i serumfrit TIC vækst medium eller TIC plus 10% føtalt kalveserum (FCS). CD11b-immunopanned celler blev spot belagt på kollagen-belagt anionaktive/kationiske belagt vævskultur plade (Se Tabel af materialer for detaljer), og det samme felt var afbildet af fasekontrast hver 24 h. skala bar, 100 µm. TIC, TGF-β2/IL-34 / Kolesterol indeholdende vækstmediet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Rutinemæssigt evaluering af sundhed og levedygtighed af isolerede celler er vigtigt for reproducerbarhed og succes af eksperimenter. Her viser vi mikroglia isoleret fra en P21 dyr kulturperler i MGM, TIC eller TIC suppleret med 10% FCS efter 7 dage i vitro (DIV) med en levedygtighed assay. Hvis isolation var vellykket, Vis kulturer mellem 80-90% levedygtighed i TIC efter 7 DIV. celler dyrkes i overværelse af serum til sidst klatre til nær 100% levedygtighed af denne foranstaltning, men dette er kunstigt oppustet både ved hurtig spredning af serum-eksponerede celler og hurtige fagocytose af døde celler inden for disse kulturer (figur 2A). Ud over robust overlevelse vise TIC kulturperler celler også en forgrenet morfologi i forhold til FCS behandlede celler (figur 2B, C).

Figur 2: overlevelse af mikroglia i MGM, TIC eller TIC + FCS over syv dage i kultur. (A) celler blev isoleret fra P21 rotter og kulturperler i mikroglia vækstmediet (MGM), TGF-β2/IL-34/kolesterol indeholdende vækstmediet (TIC), eller TIC + 10% føtalt kalveserum (FCS). På hvert tidspunkt, blev næringssubstrat suppleret med calcein AM (1,33 µM endelig) og ethidium homodimer (2,5 µM endelige) for 15 min at mærke levende celler og døde celler henholdsvis. Celler blev talt i hvert felt ved hjælp af en automatiseret ImageJ script. (B og C) efter 7 DIV, med ingen medieændringer celler dyrkes i TIC (B) eller TIC suppleret med 10% FCS (C) blev farvet for at mærke levende og døde celler som ovenfor. Repræsentative billeder blev taget ved hjælp af en 10 X (venstre) eller 40 X (højre) mål. Skalalinjen, 40 µm. fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM). Dette tal blev ændret fra Bohlen et al. ⁹ og anvendes med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at vise vellykket isolation og kultur af yderst rene mikroglia, vi isoleret mikroglia fra P21 rotter og kulturperler disse celler i TIC eller TIC suppleret med 10% FCS for 8 dage. Celler blev derefter fast og farves med microglial markører (Iba-1 og CD11b) og spredning markør (Ki67, figur 3A). I tilføjelse til farvning til celle markører, RNA-seq på frisk isolerede celler kan giver en kraftfuld og følsomme værktøj til evaluering af RNA-profil af cellerne, og kan hjælpe med at informere den begyndende renhed af kulturer. CD11b immunopanning typisk resulterer i en lille procentdel af CD11b⁺ neutrofiler/monocyt fremførsel ud over CD11b⁺ mikroglia (figur 3B). Disse celler vil dø i TIC efter et par dage, men kan komplicere analyser af tidligere tidspunkter.

Figur 3: renhed af dyrkede celler som vurderet af Immunhistokemi og RNA-FF. (A) mikroglia blev isoleret fra P21 rats, belagt på PDL/kollagen belagt glas coverslips og kulturperler i TGF-β2/IL-34/kolesterol indeholdende vækstmediet (TIC) i 8 dage. Celler var fast med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 10 min ved stuetemperatur og immun-farves med Iba-1 (1: 500), CD11b (1:1500), og Ki67 (1: 500). Kort, fast celler blev blokeret med 0,1% vaskemiddel (Se metoder tabel for detaljer) og 10% normal æsel serum (NGS) i 1 time ved stuetemperatur. Celler blev derefter inkuberes med primære antistoffer i 0,1% vaskemiddel med 1% NGS natten over ved 4 ° C. Celler blev vasket tre gange i 5 min i PBS. Celler blev derefter inkuberes med sekundære antistoffer alle 1: 500 i 0,1% vaskemiddel med 1% NGS i 1 time ved stuetemperatur. Celler var igen vaskes tre gange med PBS og monteret med DAPI-holdige montering medium. Repræsentative billeder blev taget på 40 X forstørrelse. Skala bar, 50 µm. (B) udtryk for repræsentative celletype specifikke udskrifter af frisk isoleret og dyrkede celler. Mikroglia var isoleret fra P21 rotter og mængden direkte fra immunopanning parabol for RNA isolering og RNA-FF. markører for andre store CNS celletyper (astrocytter, neuroner, oligodendrocytes og endotelceller) Vis minimal forurening af CD11b-immunopanned celler. Neutrofile markører er fundet i frisk isolerede celler (sort), men er tabt i serumfrit kulturer (grå). Dyrkede celler udtrykker høje niveauer af fælles makrofag markører, men markører definere specialiserede microglial signatur er hurtigt downregulated af dyrkede celler. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM). Data er ændret fra Bohlen et al. ⁹ og anvendes med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Farvning for levedygtighed og celle markører giver mulighed for bestemmelse af overlevelse og renhed af cellerne, men giver begrænsede oplysninger om dynamikken i kulturen. Her har vi givet en time-lapse film af P21 rotte mikroglia efter 14 DIV i TIC. Efter to uger, serumfrit kulturer vise dynamiske overvågning adfærd, med hurtig proces udvidelser og forbehold i hele fadet (Se film 1). Derudover har vi tidligere fundet at serum eksponering forvandler disse hvilende tilstand egenskaber af mikroglia, resulterer i varig morfologiske og fagocyterende ændringer. Vi har inkluderet en film af mikroglia kulturperler i 5 dage i TIC, derefter udsat for 10% FCS (Se film 2).

Movie 1: defineret-medium mikroglia kulturer Vis forgrenet morfologi med dynamiske processer. Mikroglia blev isoleret fra en P21 rotte, spot belagt på kollagen-belagt anionaktive/kationiske belagt væv kultur plader, og kulturperler i 14 dage i TIC. På 14 DIV, blev billeder indsamlet hver 3 min. Filmen spiller på 6 rammer/s, og tidsstemplet i nederste højre hjørne angiver varigheden af billedbehandling i h:min. film er gengivet fra Bohlen et al. ⁹ og anvendes med tilladelse. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Movie 2: Serum eksponering udløser en hurtige morfologiske forandringer i defineret-medium microglial kulturer. Mikroglia blev isoleret fra en P21 rotte, spot belagt på kollagen-belagt anionaktive/kationiske belagt væv kultur plader, og kulturperler i 5 dage i TIC. På 5 DIV, billeder blev indsamlet hver 5 min. Baseline motilitet/morfologi blev indspillet, derefter i 2:55 (2 timer, 55 min), en 50% media ændring blev udført for at tilføje FCS til en endelig koncentration på 10%. Celler var afbildet for en ekstra 7 h. Filmen spiller på 6 rammer/s, og tidsstemplet i nederste højre hjørne angiver varigheden af billedbehandling i h:min. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Discussion

Fordi mikroglia tjene som sentinel immunceller af CNS, er de meget lydhøre over for miljømæssige ændringer; derfor for stor omhu at minimere inflammatoriske reaktioner i cellerne under deres isolation og kultur⁸. Dette opnås i denne protokol gennem hastighed og temperatur. At holde cellerne på is eller ved 4 ° C, når det er muligt i høj grad reducerer aktivering, så alle centrifugering trin finde sted ved 4 ° C, dyrene er perfunderet med iskold perfusion buffer, og protokollen er blevet strømlinet for at minimere tiden mellem væv udvinding og dyrkning af celler. Hvis vurderingen af gen expression mønstre af frisk isolerede celler, høste cellelysater direkte fra CD11b immunopanning parabol forud for trypsinization at holde isolering-inducerede ændringer på et minimum. Det skal bemærkes, at selv omhyggeligt isoleret mikroglia udføre en inflammatorisk reaktion straks efter at blive placeret i varme temperaturer, formentlig på grund af anerkendelse af skader-associerede signaler uløseligt forbundet med proceduren, isolation. Hvis protokollen blev udført med succes, forventes 2,5-5 x 10⁵ celler/juvenile rotte.

Celle isolation protokol leveret her er meget specifikt til at isolere CD11b + celler fra perfused CNS⁹. Selv om denne celle befolkning består overvejende af mikroglia, indeholder det også lave niveauer af andre myeloide befolkninger som perivascular makrofager, meningeal makrofager, plexus chorioideus makrofager, monocytter og neutrofile¹⁰. Choroid-associerede myeloide celler kan elimineres hovedsageligt af anerkendelse og fjernelse af plexus chorioideus før væv dissociation. Meninges kan også fjernes til en vis grad, men fuldstændig fjernelse af alle meningeal væv er ikke praktisk inden for de tidsrammer, indskyde nemlig hurtige isolation beskrevet her. Derfor, for at begrænse variation på grund af ufuldstændig fjernelse af meninges, vi ikke fjerner meninges. For at minimere antallet af cirkulerende monocytter/neutrofiler i det isolerede materiale, det er også vigtigt at have en ren perfusion, og vi typisk kassér væv, der er dårligt perfunderet. Selv med fremragende perfusion er clearance af blod ikke absolut, som vil fremgå af tilstedeværelsen af et lille antal erytrocytter i celle pellets i hele rensning. Således, små niveauer af monocytter og neutrofile er co renset og bidrage en særskilt signatur i transkriptom profiler af frisk isolerede celler. Men cirkulerende celler hurtigt dø i serumfrit TIC medier og repræsenterer ikke persistente forurenende stoffer, selv om de kan fortsætte med at overleve og formere sig i serum, der indeholder kulturer.

Et andet vigtigt punkt for at opnå en sund og levedygtig kultur er at tage sig under de mekaniske dissociation trin. Mens douncing dræber mange neuroner, glia og andre overleve CNS celler, mikroglia denne dissociation relativt uskadt (selvom mikroglia kan også blive dræbt af over-douncing). Hvis det gøres korrekt, denne protokol resulterer i celle udbytter sammenlignelige med dem, der opnås ved hjælp af proteolytiske dissociation, hvorimod potentielt forstyrrende variabler fra væv inflammatoriske svar ved forhøjede temperaturer undgås. Ved at udføre runder i træk ufuldstændige af mekanisk væv dissociation, kan enkelt celler høstes fra suspensionen samtidig minimere mængden af mekanisk stress på den overordnede kultur.

Immunopanning protokollen beskrevet her er en pålidelig og reproducerbar måde at isolere mikroglia, men der findes andre sammenlignelige metoder. Vi har fået lignende resultater ved hjælp af magnetiske isolation med magnetisk aktiveret celle sortering myelin udtynding og CD11b udvalg. Vi har her fokuseret på immunopanning metoden, fordi det har givet de højeste kvalitet kulturer til dato, kræver mindre specialiseret udstyr og ikke kræver indførelsen af jernoxid-konjugerede antistoffer til celler umiddelbart før kultur. En anden fremgangsmåde bruges normalt til microglial isolation er flowcytometri, som har en stor fordel i forhold til den nuværende tilgang, idet protokoller findes for rensning af Bonafide mikroglia fra andre CD11b + myeloide forurenende stoffer ved hjælp af overflade antistoffer mod signatur markører som TEMEM119⁸. Selvom fluorescens-aktiveret celle sortering resulterer i en meget ren celle population, det også medfører yderligere understreger til cellerne og kan resultere i lavere rentabilitet kulturer eller reduceret udbytte. Samlet set fokuserer vi på antistof-baserede metoder over etiket-fri tæthed centrifugering og shake-off forberedelser til at maksimere reproducerbarhed og renhed af cellen befolkningen.

Mens denne protokol er optimeret til kulturen af juvenile rotte mikroglia, kan det bruges til kultur mikroglia fra forskellige aldre; cellen Total udbytter er maksimal fra 1 - 2 uger gamle rotter, efter toppen af microglial udvidelse har passeret og før strukturelle rearrangementer, der interfererer med inddrivelse af celler fra ældre væv. Mikroglia kan også isoleret og kulturperler fra mus og humant væv ved at erstatte CD11b antistof med en passende monoklonale antistoffer specifikke for mus eller menneskelige epitoper. Mens både mus og menneskelige mikroglia overleve på disse betingelser, kultur, viser de morfologiske forskelle i forhold til rotte celler. Musen celler bevarer en forgrenet morfologi men har mindre uddybe processer, mens menneskelige celler har en næsten ensartet amoeboid morfologi når isoleret og kulturperler efter denne procedure.

Isolerede mikroglia kan være forgyldt på forskellige måder afhængigt af assays kræves. For optimale resultater (som illustreret i live/døde assays og morfologiske film vist her), blev 3,5 x 10³ celler "spot" belagte i midten af godt af en 24-godt anioniske/kationiske belagt vævskultur plade efter en 10-min belægning af kollagen IV som beskrevet i ovennævnte protokol. Alternativt, for eksperimenter der kræver store mængder af celler, såsom RNA isolering, 3-5 x 10⁴ celler kan være forgyldt pr. brønd af en 24-godt plade efter 10 min til 1 time af kollagen IV belægning. Celler forgyldt ved højere tætheder viste lidt lavere rentabilitet og mindre komplekse morfologi i forhold til celler, der blev spot behandles, muligvis på grund af virkningen af inflammatoriske signaler udskilles i svar til isolation. For Immunhistokemi eller imaging kræver glas coverslips, cellerne udviser den bedste overlevelse og morfologi når coverslips var første belagt med PDL derefter belagt med kollagen IV som beskrevet ovenfor. For assays kræver et stort antal betingelser, er cellernes levedygtighed også høj i 96-brønd eller 384-godt kollagen-belagte plader. Under alle forhold, cellerne starter runde eller bipolar, begynde at erhverve processer omkring dag 3-4, og tage 5-10 dage til at udstille den maksimalt forgrenet morfologi illustreret i figur 1 og film 1.

Mens denne protokol resulterer i en kultur, der udstiller dynamisk overvågning adfærd og morfologi ligner hvilende mikroglia i vivo, disse celler ikke fuldt ud bevarer den specialiserede gen udtryk signatur af mikroglia i vivo. Mange af de vedvarende gen observerede ændringer i kulturperler celler afspejler ændringer ses typisk i den embryonale eller betændte CNS⁹. Som sådan, denne protokol repræsenterer et skridt frem i forståelsen af vilkår mikroglia kræve for at overleve i kultur og serum-fremkaldte ændringer, men yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå extrinsic signalerne leveres af CNS, Finjuster microglial egenskaber og gen udtryk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.