Drosophila में न्यूरॉनी वृक्ष Arborization जटिलता का मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
यह प्रोटोकॉल Drosophilaमें न्यूरॉन वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) के मात्रात्मक विश्लेषण पर केंद्रित है, जिसका इस्तेमाल वृक्ष morphogenesis के अध्ययन के लिए किया जा सकता है ।
Abstract
Dendrites एक ंयूरॉन के शाखाई अनुमानों हैं, और वृक्ष आकृति विज्ञान तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान synaptic संगठन को दर्शाता है । Drosophila लार्वा न्यूरॉन वृक्ष arborization (डीए) तंत्रिका तंत्र के विकास में तंत्रिका morphogenesis और जीन समारोह के dendrites अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल है. डीए न्यूरॉन्स की चार कक्षाएं हैं । चतुर्थ श्रेणी के एक शाखाकरण पैटर्न है कि लार्वा शरीर की दीवार के लगभग पूरे क्षेत्र को कवर के साथ सबसे जटिल है । हम पहले के प्रभाव की विशेषता है मुंह बंद करने के Drosophila ortholog पर SOX5 की कक्षा चतुर्थ न्यूरॉनी वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) का उपयोग कर चार पैरामीटर: dendrites की लंबाई, dendrite कवरेज की सतह क्षेत्र, शाखाओं की कुल संख्या, और शाखाकरण संरचना । इस प्रोटोकॉल NDAC मात्रात्मक विश्लेषण के कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है, लार्वा विच्छेदन, फोकल माइक्रोस्कोपी से मिलकर, और छवि विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रक्रियाओं । इसके अलावा दा ंयूरॉन विकास और उसके अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि और न्यूरॉन्स की समझ में सुधार होगा कार्य और स्नायविक और neurodevelopmental विकारों के बुनियादी कारणों के बारे में सुराग प्रदान करते हैं ।
Introduction
Dendrites, जो एक ंयूरॉन के शाखाई अनुमानों रहे हैं, क्षेत्र है कि ंयूरॉन संवेदी और अंय ंयूरॉंस से synaptic जानकारी शामिल कवर1,2। Dendrites synapse गठन के एक महत्वपूर्ण घटक है और synaptic आदानों को एकीकृत करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, साथ ही साथ एक ंयूरॉन में विद्युत उत्तेजना का प्रचार । वृक्ष arborization (da) एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा न्यूरॉन्स नए वृक्ष पेड़ और शाखाओं के रूप में नए synapses बनाने के लिए फार्म. इस तरह के शाखा घनत्व और समूहीकरण पैटर्न के रूप में दा, के विकास और आकृति विज्ञान, बहु कदम जैविक प्रक्रियाओं से परिणाम और उच्च ंयूरॉन समारोह के लिए संबंधित हैं । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य Drosophila में न्यूरॉन dendritric arborization जटिलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि प्रदान करना है .
dendrites की जटिलता synaptic प्रकार, कनेक्टिविटी, और भागीदार ंयूरॉंस से आदानों निर्धारित करता है । पैटर्न शाखाकरण और dendrites के घनत्व संकेत है कि वृक्ष क्षेत्र3,4पर एकाग्र प्रसंस्करण में शामिल हैं । Dendrites विकास में समायोजन के लिए लचीलापन है । उदाहरण के लिए, synaptic संकेतन विकासात्मक चरण के दौरान और परिपक्व तंत्रिका प्रणाली5में somatosensory ंयूरॉन में dendrite संगठन पर एक प्रभाव है । न्यूरॉन कनेक्टिविटी की स्थापना morphogenesis और dendrites की परिपक्वता पर निर्भर करता है । dendrites की कुरूपता बिगड़ा ंयूरॉन समारोह के साथ जुड़ा हुआ है । अध्ययनों से पता चला है कि दा न्यूरॉन morphogenesis की विषमता कई neurodegenerative रोगों के etiologies में योगदान दे सकती है, जिनमें अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington की बीमारी (एचडी), और लो Gehrig की बीमारी/ पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS)६,७,८. Synaptic परिवर्तन विज्ञापन के प्रारंभिक चरण में दिखाई देते हैं, संगीत समारोह में गिरावट और हानि के साथ ंयूरॉन7,8। हालांकि, इन neurodegenerative रोगों में रोगजनन के लिए कैसे dendrite विकृति योगदान के विशिष्ट मायावी रहता है ।
dendrites के विकास के जीन है कि नियामकों के एक जटिल नेटवर्क में सांकेतिक शब्दों में बदलना,9प्रोटीन के Wnt परिवार के रूप में,10, प्रतिलेखन कारकों, और सेल सतह रिसेप्टर्स11,12 पर लाइगैंडों द्वारा विनियमित है . Drosophila दा न्यूरॉन्स चार वर्गों (वर्ग मैं, द्वितीय III, iv) से मिलकर बनता है, जो कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स सबसे जटिल बंटी पैटर्न है और बेहतर समझ के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में नियोजित किया गया है13morphogenesis, 14. प्रारंभिक morphogenesis के दौरान, कम से कम और/या RNAi मुंह बंद करने वर्ग चतुर्थ दा न्यूरॉन्स में जीन का परिणाम शाखाओं में बंटी पैटर्न में परिवर्तन और dendrite13छंटाई. यह ंयूरॉन वृक्ष arborization के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक विधि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
हम पहले से पता चला है कि मुंह बंद करने के Drosophila ortholog के SOX5, Sox102F, कम से कम dendrites के नेतृत्व में डा न्यूरॉन्स और कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स में कमी जटिलता15. यहां, हम Drosophilaमें ंयूरॉन वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) के लिए मात्रात्मक विश्लेषण की प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल, पिछले वर्णित पद्धति से अनुकूलित, एक संक्षिप्त विधि प्रदान करता है परख के विकास के लिए संवेदी ंयूरॉंस । यह मजबूत छवि लेबलिंग और तीसरी instar लार्वा शरीर की दीवार16,17,18,19में दा ंयूरॉन दिखाता है । वीवो मेंNDAC और विकासात्मक मतभेदों की जांच की चाहत रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए यह एक बहुमूल्य प्रोटोकॉल है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Dendrites कि अंदर आना एपिडर्मिस न्यूरॉन्स के इनपुट क्षेत्रों रहे हैं, और उनके morphologies कैसे जानकारी प्राप्त की है और व्यक्तिगत ंयूरॉंस द्वारा संसाधित है निर्धारित करते हैं । विकास dendrite आकृति विज्ञान dendrite संगठन के…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इमेजिंग तकनीकी सहायता के लिए विलियम ए इयम् शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम चिकित्सा अल्जाइमर कोष द्वारा समर्थित किया गया था [to r. e. t], राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01AG014713 और R01MH60009 को आर. ई. टी.; R03AR063271 और R15EB019704 को अल], और राष्ट्रीय विज्ञान फाउण्डेशन [NSF1455613 to अल] ।
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
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