Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Tilpasning av hybridisering erobringen av Chromatin-assosiert proteiner for Proteomikk til pattedyrceller

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57140
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1,2
1Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, 2Department of Internal Medicine-Molecular Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 3Department of Chemistry, University of Wisconsin

Summary

Dette er en metode for å identifisere romanen DNA-samspill proteiner på bestemt mål loci, stole på sekvens-spesifikke erobringen av krysskoblet chromatin for påfølgende proteomic analyser. Det kreves ingen forhåndskunnskaper om potensielle bindende proteiner, eller cellen modifikasjoner. Opprinnelig utviklet for gjær, har teknologien nå blitt tilpasset for pattedyrceller.

Abstract

Hybridisering erobringen av chromatin-assosiert proteiner for Proteomikk (HyCCAPP) teknologien ble opprinnelig utviklet for å avdekke romanen DNA-protein interaksjoner i gjær. Den lar analyse av et mål område rundt uten forutgående kunnskap om sannsynlig proteiner bundet målregion. Dette, i teorien, kan HyCCAPP brukes til å analysere alle genomic område av interesse, og det gir tilstrekkelig fleksibilitet til å arbeide i ulike celle systemer. Denne metoden er ikke ment å studere bindende områder av kjente transkripsjonsfaktorer, en oppgave bedre egnet for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) og ChIP-lignende metoder. HyCCAPP styrke ligger i dens evne til å utforske DNA regioner som det er begrenset eller ingen kunnskap om proteiner knyttet til seg. Det kan også være en praktisk metode for å unngå skjevheter (finnes i ChIP-lignende metoder) introdusert av protein-basert chromatin berikelse bruker antistoffer. Muligens kan HyCCAPP være et kraftig verktøy for å avdekke virkelig romanen DNA-protein interaksjoner. Hittil er teknologien hovedsakelig brukt til gjærceller eller høy kopi gjenta sekvenser i pattedyrceller. For å bli den kraftige verktøyet vi ser, må HyCCAPP tilnærminger være optimalisert for å effektivt ta enkelt-kopi loci i pattedyrceller. Her presenterer vi tilpasningen av første gjær HyCCAPP fange protokollen humane cellelinjer, og viser at enkelt-kopi chromatin regioner kan være effektivt isolert med denne endret protokollen.

Introduction

I løpet av siste tiår har det sett en dramatisk forbedring i sekvensering teknologi, slik at studiet av en rekke genomer i stort antall av prøvene, og med forbløffende oppløsning. Encyclopedia av DNA elementer (kode) konsortiet, omfattende multi institusjonelle innsats spissen av National Human Genome Research Institute av National Institutes of Health, har gitt innsikt i hvordan enkelte transkripsjonsfaktorer og andre regulerende proteiner bindes til og samhandle med genomet. Den første innsatsen preget spesifikke DNA-protein interaksjoner, som vurdert av Chromatin immunoprecipitation (ChIP) for over 100 kjent DNA-bindende proteiner1. Alternative metoder som DNase footprinting2 og formaldehyd assistert isolering av regulatoriske elementer (FAIRE)3 har også blitt brukt til å finne bestemte regioner i genomet samspill med proteiner, men med tydelig begrensning som disse eksperimentelle tilnærminger finner ikke samspill proteiner. Til tross for omfattende innsats de siste årene, har ingen teknologi framstått som effektivt lar omfattende karakterisering av protein-DNA interaksjoner i chromatin, og identifikasjon og måling av chromatin-assosiert proteiner.

For å møte utviklet vi en ny tilnærming som vi betegnes som Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteiner for Proteomikk (HyCCAPP). Opprinnelig utviklet i gjær4,isolerer5,6, tilnærming krysskoblet chromatin regioner av interesse (med bundet proteiner) bruker sekvens-spesifikke hybridisering capture. Etter isolering av protein-DNA komplekser, kan tilnærminger som massespektrometri brukes å karakterisere settet med proteiner bundet til rekkefølgen av interesse. HyCCAPP kan dermed betraktes som en ikke-partisk tilnærming å avdekke romanen DNA-protein interaksjoner, i den forstand at den ikke stole på antistoffer og det er helt agnostiker om proteiner som kan bli funnet. Det er andre tilnærminger i stand til å avdekke romanen DNA-samspill proteiner7, men mest stole på ChIP-lignende metoder8,9,10, plasmider innsettinger11,12, 13,14eller regioner med høy kopi nummer15. I motsetning HyCCAPP kan brukes på multi - og enkelt-kopi regioner, og det krever ikke tidligere informasjon om proteinene i regionen. I tillegg, mens noen av metodene nevnt ovenfor har verdifull funksjoner, spesielt unngå behovet for DNA-protein crosslinking reaksjoner, unike med HyCCAPP er at den kan brukes til enkelt-kopi områder i uendret celler, og uten forutgående kunnskap om antatte bindende proteiner eller tilgjengelig antistoffer.

Foreløpig HyCCAPP er hovedsakelig brukt til analyse av ulike genomisk regioner i gjær4,5,6, og nylig ble brukt til å analysere protein-DNA interaksjoner i alpha-satellitt DNA, en gjenta region i det menneskelige genom16. Som en del av vår pågående arbeid, har vi tilpasset hybridisering fange tilnærming opprinnelig utviklet for gjær chromatin gjelder for analyse av menneskelige celler, og presenterer her en endret protokoll som tillater selektiv erobringen av enkelt-kopi mål regionene i det menneskelige genomet med effektivitet ligner på våre første studier i gjær. Denne nye optimalisert protokollen tillater nå tilpasning og utnyttelse av teknologi for å avhøre protein-DNA interaksjoner over det menneskelige genomet, massespektrometri eller andre analytiske metoder.

Det er viktig å understreke at metoden HyCCAPP er ment for analyse av bestemt målrettingsregioner og ennå ikke er egnet for genomet hele analyser. Teknologien er spesielt nyttig når du arbeider med områder som det er lite informasjon om samspill proteiner, eller når en mer omfattende dyptgående analyse av samspill proteiner på et bestemt genomet locus er ønsket. HyCCAPP er ment å avdekke DNA-bindende proteiner men ikke beskrive nøyaktig bestemt protein bindende områder i genomisk DNA. I gjennomføringen gjeldende gir metodikken ikke informasjon om DNA bindende sekvenser eller motiver for individuelle proteiner. Derfor det pent utfyller eksisterende teknologier som FAIRE, og kan identifikasjon av romanen bindende proteiner i genomisk områder identifisert av en innledende FAIRE analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fange Oligonucleotide Design

  1. Designe et panel av oligonucleotides under hybridisering erobringen av målet området/s.
    1. Mål å utforme 4 – 8 oligonucleotides per mål-regionen, men som et minimum, design minst én oligonucleotide målretting hver ende av målregion.
    2. Hvis målet sekvensen er lang (> 500 base parene), utforme oligonucleotides som spredt som mulig for å sikre effektiv anriking av chromatin over hele målregion.
      Merk: Vi har observert optimal fanger med 4 – 8 oligonucleotides. Selv om denne prosessen kan fungere bra med mer oligonucleotides, er det ikke uvanlig å se en nedgang i berikelse gir når for mange oligonucleotides brukes.
  2. Utforme oligonucleotides med lignende smeltingen temperaturer og sørge for at de ikke danne sterk hårnåler eller har sterk samhandlinger (ta hensyn til at hybridizations vil bli utført på 42 ᵒC).
    Merk: Hvis en toehold elueringsrør velges (4.12.3), en ekstra ekstern 8 base sekvens må legges til i oligonucleotide og krever komplementære 'release' oligonucleotides ved elueringsrør17. Flere kommersiell programvareverktøy kan brukes til å velge og analysere oligonucleotides. 25 mers har vist gode resultater, men avhengig av genomet størrelsen og sekvens, fangst oligonucleotides kan inneholde et sted mellom 20 – 80 baser. Vanligvis fangst oligonucleotides har en Smeltetemperaturen nær 62 ᵒC, men som kan endres avhengig av sin lengde. Konsekvent smeltingen temperaturer og/eller oligonucleotide lengde gjennom fange mix å unngå uønskede skjevheter i berikelse.
  3. Design fange oligonucleotides med en biotin moiety (fortrinnsvis atskilt med et mellomrom fra fangst sekvensen) på 3 slutten.

2. celle kultur

  1. Vokse menneskelige lymphoblastoid celler (for eksempel GM12878 vises her) eller andre linjer i RPMI 1640 medier med 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin og 5% fosterets bovin serum (FBS), 37 ᵒC og 5% CO2.
    1. Ætt første frosset dele (2-5 x 105 celler) i en T-25 bolle med 6 mL RPMI 1640 media i 2.1.
    2. Overvåke celle tetthet og levedyktighet.
      1. Ta en representant aliquot av celler og stain dem med en passende farge som trypan blå.
      2. Måle celle tettheten ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
    3. Før cellen når tettheten av 1 x 106 celler/mL, Nedspinning cellene 100 x g i 5 min og overføre cellene til en T-75 kolbe med 25 mL RPMI 1640 media i 2.1. Vokse cellene til cellen tetthet tilnærminger 1 x 106 celler/mL.
    4. Overføre cellene til en T-150 kolbe i 38 mL RPMI 1640 medier (2.1) og vokse cellene for to dager.
      Merk: Lymphoblastoid cellene vokse i suspensjon. Generelle retningslinjer for voksende lymphoblastoid celler anbefaler celle tettheter holdes mellom 0,2 – 1 x 106 celler/mL. På grunn av den store mengden materiale som kreves i denne teknologien, skrives nåværende protokollen hensikt å vokse cellene til en celle tetthet utover hva er vanlig. Celle vekst protokoller kan bli revidert og tilpasset av leseren avhengig av de cellen som skal brukes.
    5. Nedspinning cellene 100 x g i 5 min, resuspend cellene i 10 mL RPMI 1640 medier (2.1) og hell suspensjon i en 850 cm2 Berg flaske inneholder 500 mL av media. Inkuber cellene under samme vilkår som før, men på dette tidspunktet begynner å bruke konstant rotasjon (~0.5 rpm).
    6. Overvåke cellevekst og endre media ved behov (vanligvis hver 3-4 dager). La cellene vokse til en tetthet så nær som mulig til 2 x 106 celler/mL (1 x 109 celler totalt).
    7. Når den ønskede celletall er nådd, høste celler ved å spinne cellene ned 100 x g i 5 min og resuspend cellene i 36 mL RPMI 1640 media (2.1). Overføre celle suspensjon slik konisk 50 mL. Ta små dele celle teller og DNA utvinning.
  2. Krysskobling ved å legge til 1 mL av 37% formaldehyd å nå en siste konsentrasjon av 1%.
    FORSIKTIG: Formaldehyd er et karsinogen og skal håndteres i avtrekksvifte.
    1. Inkuber cellene med rotasjon (~ 30-60 rpm) i 10 min ved romtemperatur (RT).
    2. Slukke krysskobling reaksjonen ved å legge til 2 mL av en 2.5 M glysin løsning, for en siste konsentrasjon av 125 mM.
    3. Inkuber cellene med rotasjon (~ 30-60 rpm) i 5 min på RT. pellets cellene av sentrifugering 100 x g i 5 min og vaske cellene to ganger med isen kalde 1 x PBS.
  3. Fortsette til neste trinn eller resuspend pellet i 5 mL av cellen lyseringsbuffer (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, proteasehemmere (PI)) og snapin-fryse suspensjon dråpe for dråpe i flytende nitrogen. Lagre eksemplene på-80 ᵒC.
    Merk: Forberede > 25 mL av cellen lyseringsbuffer uten Igepal og PI og legge disse reagensene frisk når klar til bruk. Unngå langvarig lagring av cellen lyseringsbuffer når Igepal og PI er lagt. Lagre celle lyseringsbuffer på 4 ᵒC for inntil 3 måneder. Igepal er et ikke-ionisert, ikke-denaturing vaskemiddel. NP-40 kan potensielt brukes som et alternativ til Igepal, men vi har ikke brukt det i denne sammenheng som NP-40 ikke anbefales når prøver analyseres til slutt av massespektrometri å karakterisere DNA bindende proteiner.

3. lysis og skråstilling

  1. Forberede > 15 mL kjerner lyseringsbuffer (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.0, 1% SDS, PI).
    Merk: Legge til PI frisk, bare til beløpene som skal brukes. Unngå langvarig lagring av kjerner lyseringsbuffer når PI er lagt. Kjerner lyseringsbuffer kan lagres på RT for opptil 1 måned.
  2. Resuspend pellet i 20 mL celle lyseringsbuffer (som inneholder Igepal og PI). La pellets tine på is og bland godt når tint. La prøver sitte for en ekstra 10 minutter på is. Sentrifuge cellene på 400 x g på 4 ᵒC i 5 minutter.
  3. Forkaste nedbryting og resuspend cellene i 6 mL av kjerner lyseringsbuffer med PI (volum kan øke Hvis celler ikke utgjør en suspensjon).
  4. I forberedelsene til sonication, dele prøven i ~ 6-8 microfuge rør (600 til 1000 µL for hver rør).
    1. Plasser prøvene på is eller en kald rack og sonicate prøven med et sonicator med en microtip. Bruker 65% amplituden med 5 x 20 s konstant sprekker, slik at suspensjon å kjøle seg ned i minst 40 s mellom pulser.
      Merk: Hvis volumet øker > 10 mL per prøve, et glass kjøling cellen kan brukes i stedet. Flere og lengre serieopptak ville være nødvendig da. Sonicators varierer sterkt. Forhold må kanskje være optimalisert av leseren. Andre sonication alternativer kan brukes også.
  5. Sentrifuge cellene på 12.000 x g i 10 min på 4 ᵒC, overføre nedbryting til en ny tube og forkaste pellets.
  6. Beregn total utvinning med en fluorometric metode.
  7. Fortsette til neste trinn eller snapin-fryse og lagre utvalget på-80 ᵒC.
  8. Valgfritt: Ta en aliquot, reverse krysskoblinger ved rugende den natten på 67 ᵒC i 0,3 M NaCl. Rengjør DNA og løpe den inne Bioanalyzer å bestemme fragment lengder. Mesteparten av fragmenter bør være mellom 500 og 1000 bp.
    Merk: Det er OK å stoppe på dette punktet og lagre prøver på-80 ᵒC.

4. hybridisering fange

  1. Forberede 500 mL 2 x hybridisering (Hyb) Buffer (200 mM MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0.02% Tween-20) og 500 mL av vaskebuffer (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Lagre Hyb og vaskebuffere på 4 ᵒC og romtemperatur, henholdsvis for inntil 3 måneder. Bruke halvparten av 2 x Hyb bufferen skal forberede en 1 x hybridisering Buffer. Også lagre det på 4 ᵒC for inntil 3 måneder.
    Merk: Det totale volumet av hybridisering fange blir to ganger volumet av resulterende eksemplet i forrige trinn (som beskrevet så langt, eksempler volumet vil være rundt 6 mL og dermed totalt hybridisering volumet vil være 12 mL).
  2. Sette av perler lik 5% av totale hybridisering fange (600 µL i dette tilfellet). En riktig og passende magnet er nødvendig å arbeide med perler i fremgangsmåten.
  3. Vask perlene tre ganger med 1 x Hyb Buffer bruker to ganger perler volumet (1200 µL). Resuspend perler i 1200 µL av 2 x Hyb Buffer. Plasser rørene på magneten til løsningen fjerner og fjerner bufferen.
  4. Utføre før clearing reaksjoner i 1,5 mL microfuge rør med maksimum 700 µL av vareprøve per rør. Legg nok perler (5%) og 2 x Hyb Buffer å fortynne Hyb buffer til 1 x (10 rør med 600 µL av prøven, 120 µL av vasket perler resuspended i 2 x Hyb Buffer og 480 µL av 2 x Hyb Buffer). Inkuber dem i 10 min på 31 ᵒC slutt over slutten rotasjon (~ 30-60 rpm).
  5. Plasser rør på en magnet til perler er immobilized og overføre prøvene til nye rør. Kaste perler.
    Merk: Fra dette punktet fremover, lav-bindende rør anbefales.
  6. Resuspend fange oligonucleotides til en fungerende løsning av 10 pmol/µL og legge 4 µL av denne løsningen til hver rør.
    Merk: Regioner kan fungere som kontroll for hverandre, men det anbefales å inkludere en fange oligonucleotide med sekvensen scrambled å tjene som en sann negativ kontroll.
  7. Inkuber rør for 40 min på 42 ᵒC slutt over slutten rotasjon (~ 30-60 rpm).
  8. Under incubation, satt perlene nødvendig (0,3 µL/pmol av fange oligonucleotide). Vask perlene tre ganger som beskrevet i trinn 4.3, men resuspend cellene i 1 x Hyb Buffer.
  9. Legg vasket perler til prøven og ruge prøvene i 30 min på RT slutt over slutten rotasjon (~ 30-60 rpm). Plassere rør på magneten og fjerne nedbryting når perlene har vært immobilisert.
  10. Vask perler
    1. Legge til 1,2 mL vaskebuffer og ruge utvalget for 5 min ende over slutten rotasjon (~ 30-60 rpm) på rett sted rør på magnet og vent et par minutter til løsningen fjerner. Gjenta dette trinnet fjerner bufferen.
    2. Legge til 1,2 mL vaskebuffer og ruge det 1t slutt over slutten rotasjon (~ 30-60 rpm) på rett sted rørene på magneten og vente et par minutter til løsningen fjerner. Gjenta dette trinnet inkubasjon å redusere tiden 30 min andre gang fjerne bufferen.
    3. Legge til 200 µL av vaskebuffer og ruge det i 15 min ende over slutten rotasjon (~ 30-60 rpm) på 31 ᵒC. Plassere rør på magneten og vente et par minutter til løsningen fjerner. Fjerne bufferen.
    4. Legge til 200 µL av PBS og ruge det etter 5 min ende over slutten rotasjon (~ 30-60 rpm) på rett sted rørene på magneten og vente et par minutter til løsningen fjerner. Gjenta dette trinnet fjerner bufferen.
  11. Enkel elueringsrør
    1. Legge til 40 µL molekylær klasse vann perler og ruge det på 94 ᵒC i 5 minutter.
    2. Plassere rør på magneten og vent et par minutter før løsningen fjerner.
    3. Overføre nedbryting inn i et nytt rør. Kaste perler.
    4. Fortsette til proteomic analyse eller lagre utvalget på-80 ᵒC.
      Merk: Denne typen elueringsrør fungerer godt for senere qPCR analyse og noen Proteomikk mål, men i andre tilfeller to alternative tilnærminger beskrevet nedenfor avkastning "renset" eluates.
  12. DNase tilsettes.
    1. Legge til 40 µL av 1 x DNase Buffer og 2 U DNase i hver retning.
    2. Inkuber rør i 15 min på 37 ᵒC.
    3. Plassere rør på en magnet og vent et par minutter til løsningen fjerner.
    4. Fjerne eluted prøvene fra perler og plasser prøvene i en ny lav-bindende tube.
    5. Inkuber røret på 94 ᵒC i 7 min å deaktivere enzymet og videre til proteomic analyser.
      Merk: Lavere DNase konsentrasjoner kan brukes hvis innblanding proteomic analyser er observert. Det vil ikke være mulig å beregne fange enrichments av qPCR Hvis denne elueringsrør metoden brukes siden DNase behandling fullstendig ødelegger DNA materialet i utvalget.
    6. Fortsette til proteomic analyse eller lagre utvalget på-80 ᵒC.
  13. Toehold elueringsrør17.
    Merk: Denne metoden anbefales ikke for lengre oligonucleotides (> 40 baser). Denne metoden krever for fangst oligonucleotides inneholder en ekstra 8 baser som ikke overlapper med genomisk sekvensen og komplementære utgivelsen oligonucleotides for å fortrenge målet fra fangst oligonucleotides.
    1. Fortynne 2 nanomoles av release oligonucleotides i 40 µL SSC bufferen.
    2. Inkuber det etter 20 min på RT.
    3. Plassere rør på en magnet og vent et par minutter før løsningen fjerner.
    4. Fjerne løsningen fra perler.
    5. Fortsette til proteomic analyse eller lagre utvalget på-80 ᵒC.

5. evaluering av fange utbytte av qPCR med primere for målet fange område av interesse

  1. Bruk et passende programvare eller online verktøy for å utforme primere og sonder for målregion.
    Merk: I dette eksperimentet, regionen arrangøren av DUSP3 og DUSP5 var rettet. Den grunning og sonder brukes er følgende. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, primer 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM-merket probe - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, primer 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM-merket probe TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Ta en aliquot av eluate (ikke mer enn 10 µL) og fortynne 1:10 med molekylær klasse H2O.
  3. DNA av en av de dele tatt i trinn 2.1.7 og bruker den DNA-prøven for å gjøre en standardkurve gjør fem føljetong 1:10 fortynninger i molekylær klasse H2O.
  4. Forberede en qPCR master blanding (bredt spekter av kommersielle alternativer), legge til grunning og prober og dispensere riktige beløpet (15 µL hvis kjører en 20 µL reaksjon) i hver brønn.
  5. Legge til 5 µL av enten: a) utvannet utvalg, b) standardkurve eller c) molekylær klasse H2O (å tjenestegjøre som ingen mal) i hver brønn.
  6. Seal platen og sentrifuge det 100 x g for 1 min.
  7. I et qPCR system med følgende parametere: 5 min på 95 ᵒC etterfulgt av 40 sykluser av 95 ᵒC for 20 s, 59 ᵒC for 20 s og 72 ᵒC for 25 s.
  8. Bruk standardkurven til esler gir og eggerøre fange å vurdere fange spesifisitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grunn av behovet for store input mengder chromatin for HyCCAPP å lykkes, dyrkes celler til relativt høye nivåer av confluency. Trypan blå flekker brukes til å bekrefte at celle død priser er moderate (< 10%). Enkeltutgave eksperimenter, chromatin innhold før hybridisering fange må være i området femtomolar som vanligvis krever minst 109 celler som starter materiale. Før fullskala forsøk anbefales det å teste fange oligonucleotide ytelse i mindre porsjoner. Hybridisering fanger bruker en titrering av oligonucleotides er vist i figur 1. Fange oligonucleotides er gradvis økt mens den totale konsentrasjonen forblir konstant. Dette eksperimentet viser tydelig tre nøkkelaspekter. Først hjelper det for å finne, for dette spesielle området, hvor mange oligonucleotides er nødvendig for å nå optimal (og maksimalt) hybridisering effektivitet. For det andre, det avslører hvis det er noen åpenbare skadelig interaksjoner mellom et bestemt sett av oligonucleotides. Til slutt, det viser om det er noen oligonucleotides med dårlig spesifisitet som har betydelige mengder bakgrunn (i dette tilfellet målt av qPCR analyse med primere målretting andre regioner i genomet).

Fange hybridisering avkastningen vises beskjeden grunn krysskoblet av chromatin prøven. En stor andel av fragmenter i krysskoblet chromatin vil ikke være mottakelig for hybridisering fangst. Seriell hybridisering eksperimentene viser dette (figur 2). Hvis hybridisering fangst er kjørt, resulterer en påfølgende fange eksperiment av samme chromatin materiale med en annen fange oligonucleotides i sammenlignbare (noe lavere) avkastning enn ved bruk av ferske chromatin (~ 11% lavere på gjennomsnitt). Men hvis samme region er målrettet på nytt med de samme oligonucleotides i et andre fange eksperiment med chromatin prøve igjen etter ta eksperimentere, avkastningen vil redusere ca 90%, bekrefter at de fleste av de hybridisering-medgjørlig materiale har blitt fanget. Hvis slik reduksjon i fange ikke er observert etter påfølgende fanger med de samme oligonucleotides, indikerer et teknisk problem i hybridisering fange trinn.

I enkle systemer som gjær, har vi observert fange effektivitet nærmer 4%5, som førte til identifisering av 9 proteiner ulikt beriket i 2 områder når gjær ble dyrket under ulike forhold. I menneskeceller er har et genom ~ 250 ganger større enn gjær, hybridisering avkastning imidlertid vanligvis under 1% (Figur 3). Som Figur 3 viser, kanskje et enkelt eksperiment gir utilstrekkelig mengder for Proteomikk analyser. I så fall må flere fanget prøver være samlet for å utføre en påfølgende massespektrometri analyse. Alternativt, lave konsentrasjoner av fanget målet regionen chromatin kan brukes for målrettet analyse tilnærminger som vestlige blotting og masse massespektrometri-baserte valgte reaksjon overvåking analyser.

Figure 1
Figur 1: boksen plott representasjon av fange oligonucleotide titrering. Økende antall fangst oligonucleotides ble testet og analysert av qPCR. Bakgrunn refererer til qPCR analyser målretting andre regioner i genomet. Verdier presenteres som fold endring fra hybridisering ta med en enkelt oligonucleotide. Værhår representerer de laveste og høyeste verdiene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: boksen plott representasjon av føljetong fanger. Sekvensiell hybridisering fanger med samme sett med oligonucleotides (A_A) viser en sterk nedgang i berikelse sammenlignet med sekvensiell hybridisering fanger med annen oligonucleotides (A_B) (p = 3,88 e-5). Berikelse måles ved qPCR og vises i forhold til fanger med ferske chromatin. Værhår representerer de laveste og høyeste verdiene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: hybridisering ta med menneskeceller. Hybridisering erobringen av områdene ligger i ulike kromosomer. Hvert område fungerer som en negativ kontroll for den andre. I tillegg utføres en hybridisering fange med krypterte (Scr) rekkefølgen som en sann negativ kontroll. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HyCCAPP metoden beskrevet her har mange unike funksjoner som gjør det en effektiv tilnærming til å avdekke DNA-interaksjoner som ellers ville være unnvikende. Innholdet i prosessen gir HyCCAPP fleksibilitet til å arbeide i ulike organismer og regioner i genomet. Det er en metode, men som har flere begrensninger vurderes.

HyCCAPP er en metode som unngår celle endringer slik at det kan potensielt brukes i primære cellene, cellen kultur systemer eller selv vevsprøver. Derfor imidlertid krever det prøver å være krysskoblet, som reduserer sensitivitet i proteomic analyse, og derfor krever mye input. Det er nye tilnærminger som CRISPR og biotinylation av omkringliggende proteiner som kan fungere uten crosslinking, reaksjoner,12,,13,,14,,18. Disse metodene kan være svært kraftig hvis plasmider innsettinger representerer ikke en begrensning, men kan bare brukes i celle kultur systemer. Andre tilnærminger er godt egnet til å identifisere generell protein foreninger basert på en chromatin tilstand eller tilstedeværelse av en bestemt transkripsjonsfaktorer, men er ikke ment å studere personlige loci9,10,19 .

HyCCAPP tilnærming viser en alternativ tilnærming med bred anvendelse, men det er sannsynlig at programmer i ulike celle systemer eller organismer krever optimalisering. Det viktigste trinnet for optimalisering tilnærmingen omfatter design og utvalg av fange oligonucleotides. En rekke småskala tester skal vise hvis designet oligonucleotides er riktige og sekvensen i regionen fanges effektivt. Det er flere faktorer som bør vurderes når utforme og teste fange oligonucleotides, som oligonucleotide lengde, grad av spesifisitet målregion og interaksjon mellom hvilke oligonucleotides som skal brukes. Alle disse interaksjonene kan lett bli testet ved hjelp av en qPCR analysen bestemt målregion. Eventuelt en ChIP-Seq som arbeidsflyten kan brukes til sekvens resulterende DNA fragmenter og sikre at spesifisitet av anriking er tilfredsstillende over hele genomet5.

Endelig cross-linking forholdene er også svært viktig i HyCCAPP prosedyren, og vi har observert merkbar forskjeller mellom ulike systemer, å oppnå de beste resultatene i menneskeceller ved cross-linking med 1% formaldehyd, mens i gjær, Cross-Linking med 3% formaldehyd gitt mer reproduserbar resultater. Det er mulig at mer intense cross-linking med 3% formaldehyd i menneskelige celler med en mer kompleks chromatin ikke gir tilstrekkelig tilgjengelighet for hybridisering fange oligonucleotides. Det er også tenkelig at tilstedeværelsen av en cellevegg i gjær hindrer formaldehyd tilgang til cellene, økende mengden av formaldehyd nødvendig for vellykket crosslinking nivåer i chromatin.

Utfører ChIP og andre fange tilnærminger målretting krysskoblet menneskelige chromatin, har vi observert at bare ca 1% av målet DNA kan faktisk være fanget. For de fleste DNA-baserte tilnærminger og analyser er dette ikke en begrensende faktor. Men i motsetning til ChIP, der den endelige avlesning er basert på amplifiable DNA, bruker HyCCAPP proteininnhold for den endelige avlesning. Grunn denne egenverdi begrensningen store mengder input materiale (kultivert celler i eksperimentene presenteres her) kreves: angi betingelser for dette bør nøye vurderes før du utforsker denne metodikken, spesielt når det gjaldt å enkelt-kopi regioner. Ikke alle systemer vil kunne produsere antall celler nødvendig, eller kostnaden for voksende nødvendig celle tall kan være uoverkommelige. Angi beløpene som HyCCAPP krever (~ 109 celler) kan sammenlignes med andre metoder som bruker krysskoblet materiale med input beløpene varierer mellom 108 og 1011 celler9,11,15. Modifikasjoner av HyCCAPP teknologi vil utforske tilnærminger for å kunstig øke kopi antall mål regionene, gjøre denne metoden mer bredt aktuelt. På samme tid, vil vi arbeide for å fortsette å øke den generelle effektiviteten av prosessen som sammen med sammenhengende utvikling i massespektrometri bør redusere input beløpene trengte og gjøre denne teknologien gjennomførbart på flere systemer.

Biotinylation baserte tilnærminger med CRISPR, som enCHiP18 og andre har13,14, vist for å være svært effektive eliminerer behovet av krysskoblet materiale, økende avkastning og redusere inndata krav. Omfattende behandling av celler i disse metodene tillater imidlertid ikke disse teknikkene på vevsprøver, en retning som vi har begynt å arbeide med HyCCAPP, og som gir lovende resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det er ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd P50HG004952 og R01GM109099 til Mo

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).

Tags

Genetikk problemet 136 HyCCAPP Proteomikk DNA-protein interaksjoner chromatin massespektrometri NFκB DUSP3 DUSP5
Tilpasning av hybridisering erobringen av Chromatin-assosiert proteiner for Proteomikk til pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K.,… More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter