Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

تكيف تهجين التقاط البروتينات المرتبطة بلونين للبروتينات في خلايا الثدييات

doi: 10.3791/57140 Published: June 1, 2018

Summary

هذا أسلوب تحديد البروتينات رواية يتفاعل الحمض النووي في المكاني مستهدفة محددة، تعتمد على التقاط تسلسل على حدة من الكروماتين كروسلينكيد للتحاليل اللاحقة البروتين. لا معرفة مسبقة عن إمكانية ربط البروتينات، ولا خلية إدخال تعديلات مطلوبة. وضعت في البداية للخميرة، التكنولوجيا قد تم تكييفها لخلايا الثدييات.

Abstract

التقاط التهجين من البروتينات المرتبطة بلونين للتكنولوجيا البروتيوميات (هيككاب) وضعت في البداية للكشف عن تفاعلات البروتين الحمض النووي رواية في الخميرة. وهو يسمح تحليل للمنطقة المستهدفة من الفائدة دون الحاجة إلى معرفة مسبقة حول البروتينات المحتمل منضمة إلى المنطقة المستهدفة. هذا، من الناحية النظرية، يسمح هيككاب استخدامها لتحليل أي منطقة الجينوم بالفائدة، ويوفر المرونة الكافية للعمل في نظم خلية مختلفة. ليس المقصود من هذا الأسلوب لدراسة مواقع الربط لعوامل النسخ المعروفة، مهمة أكثر ملاءمة "الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن" (شريحة) وأساليب مثل الرقائق. قوة هيككاب تكمن في قدرتها على استكشاف مناطق الحمض النووي التي يوجد محدودة أو أي علم عن البروتينات منضمة إليها. قد يكون أيضا وسيلة مريحة لتجنب التحيز (موجودة في أساليب مثل رقاقة) عرضته تخصيب الكروماتين على أساس البروتين باستخدام الأجسام المضادة. يحتمل أن تكون، هيككاب يمكن أن تكون أداة قوية للكشف عن تفاعلات الحمض النووي-البروتين رواية حقاً. وحتى الآن، التكنولوجيا الغالب طبق لخلايا الخميرة أو تسلسل تكرار نسخة عالية في خلايا الثدييات. ولكي تصبح أداة قوية ونحن نتصور، حاجة هيككاب النهج الأمثل لكفاءة التقاط المكاني نسخة واحدة في خلايا الثدييات. نقدم هنا، لدينا تكييف الخميرة الأولية هيككاب القبض على بروتوكول لخطوط الخلايا البشرية، وتبين أن مناطق الكروماتين نسخة واحدة يمكن أن تكون معزولة كفاءة مع هذا البروتوكول المعدل.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

خلال العقد الماضي، قد شهدت تحسن كبير في تسلسل التكنولوجيات، والسماح لدراسة طائفة واسعة من مورثات في عدد كبير من العينات، ومع قرار مذهل. وقد قدم الكونسورتيوم موسوعة عناصر الحمض النووي (ترميز)، جهدا مؤسسية متعددة على نطاق واسع تتصدره المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشري من "المعاهد الوطنية للصحة"، ثاقبة عوامل النسخ كيف الفردية وربط البروتينات التنظيمية الأخرى والتفاعل مع الجينوم. وتتميز الجهد الأولى تفاعلات الحمض النووي-البروتين محددة، كما يقيمها الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (شريحة) ل البروتينات الحمض النووي ملزم المعروفة ما يزيد على 1001. أساليب بديلة مثل الدناز footprinting2 وفورمالدهايد ساعد عزل العناصر التنظيمية (فير)3 كما استخدمت لتحديد مناطق محددة من الجينوم تتفاعل مع البروتينات، ولكن مع الحد من الواضح أن لا تحدد هذه النهج التجريبي البروتينات المتفاعلة. وعلى الرغم من الجهود المكثفة على مدى السنوات الماضية، برز لا تكنولوجيا تسمح كفاءة توصيف شامل لتفاعلات البروتين-الحمض النووي في الكروماتين، وتحديد وتقدير حجم البروتينات المرتبطة الكروماتين.

ولتلبية هذه الحاجة، طورنا نهجاً جديداً ونحن وصفته بالبروتينات Hybridization Capture of Chromatin-Associated للبروتينات (هيككاب). وضعت في البداية في الخميرة4،5،6، النهج الذي يعزل كروسلينكيد مناطق الكروماتين الفائدة (مع البروتينات منضم) باستخدام التقاط التهجين الخاصة بالتسلسل. بعد عزل مجمعات البروتين-الحمض النووي، يمكن استخدام نهج مثل الطيف الكتلي لوصف مجموعة البروتينات منضمة إلى تسلسل الفائدة. وهكذا، يمكن اعتبار هيككاب كما نهج غير منحاز للكشف عن تفاعلات الحمض النووي-البروتين الرواية، بمعنى أنها لا تعتمد على الأجسام المضادة، وأدري تماما عن البروتينات التي يمكن العثور عليها. وهناك نهج أخرى قادرة على الكشف عن رواية البروتينات يتفاعل الحمض النووي7، ولكن أشد الاعتماد على أساليب مثل رقاقة8،9،10،11،بلازميد الملاحق12، 13،14، أو المناطق ب إعداد نسخة عالية15. وفي المقابل، هيككاب يمكن تطبيقها على مناطق متعددة ونسخة واحدة، وأنها لا تتطلب أي معلومات مسبقة عن البروتينات في المنطقة. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن بعض الطرق المذكورة أعلاه قد معدلة ميزات قيمة، لا سيما تجنب الحاجة للبروتين الحمض النووي crosslinking ردود فعل، ميزة فريدة من نوعها من هيككاب أنه يمكن تطبيقها على مناطق نسخة واحدة في الخلايا، ودون أي علم مسبق حول بروتينات ملزمة المفترضة، أو الأجسام المضادة المتاحة.

عند هذه النقطة، وطبق أساسا لتحليل مختلف مناطق الجينوم في الخميرة4،،من56هيككاب، واستخدمت مؤخرا لتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين في ألفا-الساتل الحمض النووي، وهي منطقة تكرار في المجين البشري16. كجزء من عملنا المستمر، ونحن قد تكيفت النهج التقاط التهجين الذي وضعت في البداية لخميرة الكروماتين تكون قابلة للتطبيق لتحليل الخلايا البشرية، والحاضرة هنا بروتوكول تعديل يسمح لالتقاط الانتقائي لهدف واحد-نسخة المناطق في الجينوم البشري بكفاءات مماثلة إلى أن الدراسات الأولية في الخميرة. يسمح هذا البروتوكول الجديد الأمثل الآن تكييف واستخدام التكنولوجيا لاستجواب تفاعلات البروتين-الحمض النووي عبر المجين البشري، واستخدام الطيف الكتلي أو غير ذلك من النهج التحليلي.

من المهم أن نؤكد على أن الأسلوب هيككاب هو المقصود لتحليل مناطق مستهدفة محددة، وليست مناسبة لإجراء تحاليل على نطاق الجينوم. التكنولوجيا مفيد بشكل خاص عند التعامل مع المناطق التي توجد معلومات قليلة جداً حول البروتينات المتفاعلة، أو عندما هو المطلوب إجراء تحليل متعمق أكثر شمولاً للبروتينات المتفاعلة في موضع جينوم محددة. هيككاب يهدف إلى الكشف عن الحمض النووي ملزم البروتينات ولكن لا تميز بدقة مواقع ربط بروتين معين في الحمض النووي. المنهجية في تنفيذه بشكله الحالي، لا توفر معلومات حول تسلسل الحمض النووي ملزم أو زخارف للبروتينات الفردية. ولذلك، فإنه لطيف يكمل التكنولوجيات الموجودة مثل عدم التدخل، وقد تسمح بتحديد البروتينات ملزمة جديدة في مناطق المجين حددها تحليلاً أولياً فير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. التقاط اليغنوكليوتيد التصميم

  1. تصميم لوحة النوكليوتيد لاستخدامها أثناء التقاط التهجين ق/المنطقة المستهدفة.
    1. تهدف إلى تصميم النوكليوتيد 4 – 8 في المنطقة المستهدفة، ولكن كحد أدنى، وتصميم واحد على الأقل اليغنوكليوتيد استهداف كل نهاية من المنطقة المستهدفة.
    2. إذا كان الهدف تسلسل طويل (> 500 زوج قاعدي)، تصميم النوكليوتيد كانتشار بقدر الإمكان لضمان فعالية إثراء الكروماتين عبر المنطقة المستهدفة بأكملها.
      ملاحظة: لقد لاحظنا يلتقط الأمثل مع النوكليوتيد 4 – 8. على الرغم من أن هذه العملية يمكن أن يعمل جيدا مع النوكليوتيد أكثر، فإنه ليس من غير المألوف لمراقبة انخفاض غلة الإثراء عندما تستخدم النوكليوتيد كثيرة جداً.
  2. تصميم النوكليوتيد مع درجات حرارة ذوبان مشابهة، والتأكد من أن أنها لا تشكل دبابيس الشعر قوي لا أن يكون التفاعلات القوية (مع مراعاة أن هيبريديزيشنز سوف تجري في 42 ᵒC).
    ملاحظة: إذا كان يتم اختيارها شطف توهولد (4.12.3)، تسلسل قاعدة 8 خارجية إضافية يجب أن يضاف إلى اليغنوكليوتيد وسيتطلب النوكليوتيد مكملة 'الإفراج' وقت شطف17. يمكن استخدام العديد من أدوات البرمجيات التجارية تحديد وتحليل النوكليوتيد. 25 أسعار الصرف السوقية قد أسفرت عن نتائج جيدة، لكن تبعاً لحجم الجينوم وتسلسل، يمكن أن تحتوي النوكليوتيد القبض في مكان ما بين 20 – 80 قواعد. نموذجياً، النوكليوتيد التقاط لها درجة حرارة ذوبان ما يقرب من 62 ᵒC، ولكن التي يمكن أن تتغير تبعاً للطول. درجة حرارة ذوبان متسقة و/أو طول اليغنوكليوتيد طوال هذا المزيج التقاط يمكن أن يساعد في تجنب التحيز غير المرغوب فيها في تخصيب اليورانيوم.
  3. تصميم النوكليوتيد التقاط مع مجموعة بيوتين (يفضل أن تكون مفصولة بفاصل من التقاط تسلسل) في النهاية 3 '.

2-خلية ثقافة

  1. تنمو خلايا ليمفوبلاستويد البشرية (مثل GM12878 هو موضح هنا) أو خطوط الخلايا الأخرى في وسائل الإعلام RPMI 1640 تستكمل مع 1% البنسلين-ستربتوميسين ومم 2 لتر-الجلوتامين 5% مصل بقرى الجنين (FBS)، 37 ᵒC و 5% أول أكسيد الكربون2.
    1. البذور الأولى المجمدة مختبرين (2 – 5 × 105 خلايا) في قارورة T-25 مع 6 مل الإعلام RPMI 1640 أعدت في 2.1.
    2. رصد كثافة الخلايا وقدرتها على البقاء.
      1. ممثل الكوة الخلايا ووصمة عار لهم مع صبغة مناسبة مثل تريبان الأزرق.
      2. قياس كثافة الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية.
    3. قبل أن تصل الخلية إلى كثافة 1 × 106 خلايا/مل، تدور الخلايا لأسفل في 100 غ س لمدة 5 دقائق ونقل الخلايا إلى قارورة T-75 مع 25 مل الإعلام RPMI 1640 أعدت في 2.1. تنمو الخلايا حتى تقترب كثافة الخلية 1 × 106 خلايا/مل.
    4. نقل الخلايا إلى قارورة T-150 في مل 38 من الوسائط RPMI 1640 (2.1) وزراعة الخلايا مدة يومين إضافية.
      ملاحظة: تكبير الخلايا ليمفوبلاستويد في التعليق. توصي المبادئ التوجيهية العامة لزراعة الخلايا ليمفوبلاستويد كثافة الخلية أن تبقى بين 0.2 – 1 × 106 خلايا/مل. بسبب كمية كبيرة من المواد المطلوبة في هذه التكنولوجيا، مكتوبة على هذا البروتوكول عمدا زراعة الخلايا لكثافة خلية بعد ما يستخدم عادة. يمكن تنقيح بروتوكولات نمو الخلية وتكييفها من قبل القارئ تبعاً لأنواع الخلايا المراد استخدامه.
    5. وتصب في التعليق 850 سم2 اسطوانة زجاجة تحتوي على 500 مل من وسائل الإعلام تدور الخلايا أسفل في 100 غ س لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند الخلايا في 10 مل الإعلام RPMI 1640 (2.1). احتضان الخلايا تحت نفس الظروف قبل ولكن البدء في هذه المرحلة باستخدام التناوب المستمر (~0.5 لفة في الدقيقة).
    6. رصد نمو الخلايا وتغيير وسائل الإعلام عند الحاجة (عادة كل 3 – 4 أيام). واسمحوا الخلايا تنمو بكثافة أقرب ما يكون إلى 2 × 106 خلايا/مل (1 × 109 خلايا في المجموع).
    7. حالما يتم التوصل إلى عدد الخلايا المطلوب، حصاد الخلايا بالغزل الخلايا لأسفل في ز 100 x لمدة 5 دقائق وريسوسبيند الخلايا في 36 مل الإعلام RPMI 1640 (2.1). نقل تعليق خلية في أنبوب 50 مل مخروطية. تأخذ مختبرين الصغيرة لعد الخلايا واستخراج الحمض النووي.
  2. التشعب بإضافة 1 مل من 37% فورمالدهيد للوصول إلى نهائي تركيز 1%.
    تنبيه: فورمالدهايد هو مادة مسرطنة وينبغي التعامل معها في غطاء دخان.
    1. احتضان الخلايا بالتناوب (~ 30 – 60 لفة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. إخماد رد فعل التشعب بإضافة 2 مل الحل جليكاين 2.5 متر، لتركيز نهائي من 125 مم.
    3. احتضان الخلايا بالتناوب (~ 30 – 60 لفة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق في الرايت بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في ز 100 x لمدة 5 دقائق وتغسل الخلايا مرتين مع الجليد الباردة 1 x برنامج تلفزيوني.
  3. الاستمرار في الخطوة التالية أو ريسوسبيند بيليه في 5 مل من "المخزن المؤقت لتحلل الخلية" (5 ملم حبيس، 85 ملم بوكل، 0.5% إيجيبال، مثبطات البروتياز (PI)) الأداة الإضافية-تجميد والتعليق قطره قطره في نيتروجين سائل. تخزين العينات في ᵒC-80.
    ملاحظة: إعداد > 25 مل من "المخزن المؤقت لتحلل الخلية" دون إيجيبال وبي وإضافة تلك الطازجة الكواشف عندما جاهزة للاستخدام. تجنب تخزين طويل الأجل من "المخزن المؤقت لتحلل الخلية" مرة واحدة تم إضافة إيجيبال وبي. تخزين "المخزن المؤقت لتحلل الخلية" في 4 ᵒC لمدة تصل إلى 3 أشهر. إيجيبال منظفات النطاق، غير يشوه. يمكن استخدام NP-40 يحتمل أن تكون كبديل إيجيبال ولكن نحن لم تستخدم في هذا السياق كما لا ينصح NP-40 عندما يتم تحليل عينات في نهاية المطاف من الطيف الكتلي تميز البروتينات ربط الحمض النووي.

3-تحلل والقص

  1. إعداد > 15 مل من "المخزن المؤقت لتحلل أنوية" (10 مم يدتا، 50 مم تريس pH 8.0، 1% الحزب الديمقراطي الصربي, PI).
    ملاحظة: إضافة PI الطازجة، فقط للمبالغ التي يمكن استخدامها. تجنب تخزين طويل الأجل من "المخزن المؤقت لتحلل أنوية" حالما تم إضافة PI. يمكن تخزين المخزن المؤقت لتحلل أنوية في RT لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. ريسوسبيند بيليه في 20 مل من "المخزن المؤقت لتحلل الخلية" (التي تحتوي على إيجيبال و PI). الكريات ذوبان الجليد على الجليد ومزيج جيد مرة مذاب. واسمحوا عينات الجلوس 10 دقيقة إضافية على الجليد. الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام x في ᵒC 4 لمدة 5 دقائق.
  3. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 6 مل من "المخزن المؤقت لتحلل أنوية" مع PI (يمكن زيادة حجم إذا كانت لا تشكل الخلايا تعليق).
  4. في التحضير سونيكيشن، تقسيم العينة بالتساوي في ~ 6-8 [ميكروفوج] أنابيب (600 إلى 1,000 ميليلتر لكل أنبوبة).
    1. وضع العينات في الثلج أو رف باردة والعينة باستخدام سونيكاتور مع ميكروتيب sonicate. استخدام السعة 65% مع 5 × 20 s ثابتة رشقات نارية، مما يسمح بتعليق يبرد على الأقل 40 ثانية بين النبضات.
      ملاحظة: في حالة زيادة حجم > 10 مل كل عينة، كوب تبريد الخلية يمكن استخدامها بدلاً من ذلك. رشقات نارية أكثر وأطول سيكون مطلوباً بعد ذلك. سونيكاتورس تختلف إلى حد كبير. الظروف قد تكون الأمثل من قبل القارئ. يمكن استخدام بدائل sonication أخرى كذلك.
  5. الطرد المركزي الخلايا في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ᵒC ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وتجاهل الكريات.
  6. ويقدر إجمالي الاسترداد باستخدام أسلوب فلوروميتريك.
  7. الاستمرار في الخطوة التالية أو الأداة الإضافية-تجميد وتخزين العينة في ᵒC-80.
  8. اختياري: تأخذ كروسلينكس الكوة، وعكس بحضانة ذلك بين عشية وضحاها في ᵒC 67 في 0.3 M كلوريد الصوديوم. تنظيف الحمض النووي وتشغيله في بيواناليزير لتحديد أطوال جزء. ينبغي أن يكون الجزء الأكبر الشظايا بين 500 و 000 1 شركة بريتيش بتروليوم.
    ملاحظة: وهو موافق للتوقف عند هذه النقطة، وتخزين العينات في ᵒC-80.

4-التهجين الالتقاط

  1. إعداد 500 مل 2 × التهجين (هيب) المخزن المؤقت (200 ملم مس، كلوريد الصوديوم م 2، 40 مم يدتا، 0.02% توين-20) و 500 مل من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي" (200 ملم كلوريد الصوديوم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.2 ٪، 50 مم تريس pH 8). تخزين هيب ومخازن المياه والصرف الصحي في 4 ᵒC ودرجة حرارة الغرفة، على التوالي، لمدة تصل إلى 3 أشهر. استخدام نصف من المخزن المؤقت x Hyb 2 إعداد 1 × التهجين المخزن المؤقت. أيضا تخزينها في 4 ᵒC لمدة تصل إلى 3 أشهر.
    ملاحظة: سوف يكون الحجم الإجمالي للقبض على التهجين مرتين حجم العينة الناتجة في الخطوة السابقة (كما هو موصوف حتى الآن، حجم العينة سيكون حوالي 6 مل وهكذا سيكون حجم إجمالي التهجين مل 12).
  2. جانبا الخرز يساوي 5% حجم الالتقاط التهجين الإجمالية (600 ميليلتر في هذه الحالة). المسبق مغناطيس ملائمة ومناسبة للعمل مع الخرز في الخطوات التالية.
  3. أغسل حبات ثلاث مرات مع 1 x هيب المخزن المؤقت باستخدام حجم حبات مرتين (1200 ميليلتر). ريسوسبيند الخرز في ميليلتر 1,200 2 x هيب المخزن المؤقت. وضع الأنابيب على المغناطيس حتى الحل مسح وإزالة المخزن المؤقت.
  4. إجراء المقاصة قبل ردود الفعل في 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب بحد أقصى يبلغ 700 ميليلتر من العينة في أنبوب. إضافة ما يكفي الخرز (5%) و 2 × هيب المخزن المؤقت تمييع هيب المخزن المؤقت إلى 1 × (10 أنابيب مع 600 ميليلتر من عينة وميليلتر 120 من حبات غسلها حراكه في 2 × العازلة هيب ميليلتر 480 2 x هيب المخزن المؤقت). احتضان لهم لمدة 10 دقائق في ᵒC 31 مع نهاية على نهاية التناوب (~ 30 – 60 لفة في الدقيقة).
  5. ضع الأنابيب في مغناطيس حتى الخرز هي المعطل تداولها ونقل العينات إلى أنابيب جديدة. تجاهل الخرز.
    ملاحظة: من هذه النقطة إلى الأمام، ينصح أنابيب ملزمة منخفضة.
  6. ريسوسبيند النوكليوتيد القبض على إيجاد حل عملي من 10 pmol/ميليلتر وإضافة 4 ميليلتر لهذا الحل لكل أنبوبة.
    ملاحظة: مناطق مختلفة يمكن أن تعمل كمراقبة لبعضها البعض، ولكن من المستحسن أن تدرج اليغنوكليوتيد التقاط مع تسلسل، سارعت بمثابة عنصر تحكم سلبية حقيقية.
  7. احتضان هذه الأنابيب لمدة 40 دقيقة في ᵒC 42 مع نهاية على نهاية التناوب (~ 30 – 60 لفة في الدقيقة).
  8. أثناء الاحتضان، جانبا الخرز اللازمة (0.3 ميليلتر/بمول لالتقاط اليغنوكليوتيد). أغسل الخرز ثلاث مرات كما هو موضح في الخطوة 4، 3، ولكن ريسوسبيند الخلايا في 1 x هيب المخزن المؤقت.
  9. إضافة الخرز غسلها للعينة، واحتضان هذه العينات لمدة 30 دقيقة في الرايت مع نهاية على نهاية التناوب (~ 30 – 60 لفة في الدقيقة). ضع الأنابيب في المغناطيس وإزالة المادة طافية مرة واحدة قد تم تثبيت الخرز.
  10. الغسيل الخرز
    1. إضافة 1.2 مل من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي"، واحتضان العينة لمدة 5 دقائق مع نهاية على نهاية التناوب (~ 30 – 60 لفة في الدقيقة) في مكان الرايت أنابيب على المغناطيس والانتظار بضع دقائق حتى حل مسح. قم بإزالة المخزن المؤقت ثم كرر هذه الخطوة.
    2. إضافة 1.2 مل من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي"، واحتضان ذلك ح 1 مع نهاية على نهاية التناوب (~ 30-60 لفة في الدقيقة) في الرايت وضع الأنابيب في المغناطيس والانتظار بضع دقائق حتى حل من تلقاء نفسه. إزالة المخزن المؤقت ثم كرر هذه الخطوة تقليل وقت الحضانة إلى 30 دقيقة في المرة الثانية.
    3. إضافة 200 ميليلتر من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي"، واحتضان عليه لمدة 15 دقيقة مع نهاية على نهاية التناوب (~ 30 – 60 لفة في الدقيقة) في 31 ᵒC. ضع الأنابيب في المغناطيس والانتظار بضع دقائق حتى حل من تلقاء نفسه. إزالة المخزن المؤقت.
    4. إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني واحتضان عليه لمدة 5 دقائق مع نهاية على نهاية التناوب (~ 30 – 60 لفة في الدقيقة) في الرايت وضع الأنابيب في المغناطيس والانتظار بضع دقائق حتى حل من تلقاء نفسه. قم بإزالة المخزن المؤقت ثم كرر هذه الخطوة.
  11. شطف بسيط
    1. إضافة 40 ميليلتر من الماء الصف الجزيئية الخرز واحتضان ذلك في 94 ᵒC لمدة 5 دقائق.
    2. ضع الأنابيب في المغناطيس والانتظار بضع دقائق حتى مسح الحل.
    3. نقل المادة طافية في أنبوب جديد. تجاهل الخرز.
    4. الشروع في تحليل البروتين أو تخزين العينة في ᵒC-80.
      ملاحظة: هذا النوع من شطف يعمل جيدا لتحليلها في وقت لاحق قبكر وبعض القياسات البروتيوميات، ولكن في حالات أخرى هما النهج البديلة المبينة أدناه العائد "نظافة" الواتيس.
  12. شطف الدناز.
    1. إضافة 40 ميكروليتر 1 × "الدناز المخزن المؤقت" و 2 يو من الدناز لكل أنبوبة.
    2. احتضان هذه الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 37 ᵒC.
    3. ضع الأنابيب في مغناطيس والانتظار بضع دقائق حتى مسح الحل.
    4. إزالة عينات الوتيد من الخرز ووضع العينات في أنبوب منخفض-ملزمة جديدة.
    5. احتضان الأنبوب في ᵒC 94 دقيقة 7 لإلغاء تنشيط الإنزيم والمضي قدما إلى تحليل البروتين.
      ملاحظة: يمكن استخدام تركيزات أقل من الدناز إذا لوحظ تدخل مع تحليلات للبروتين. لن يمكن حساب الفاسدون الالتقاط من قبكر إذا كان يستخدم هذا الأسلوب شطف نظراً لمعاملة الدناز يدمر تماما المواد الحمض النووي في العينة.
    6. الانتقال إلى تحليل البروتين، أو تخزين العينة في ᵒC-80.
  13. توهولد شطف17.
    ملاحظة: هذا الأسلوب لا ينصح لأطول النوكليوتيد (> قواعد 40). يتطلب هذا الأسلوب النوكليوتيد الالتقاط لاحتواء أسس 8 إضافية التي لا تتداخل مع تسلسل الجينوم والنوكليوتيد الإصدار مكملة لتحل محل الهدف من النوكليوتيد الالتقاط.
    1. نانوموليس 2 مخفف للإفراج عن النوكليوتيد في ميليلتر 40 من المخزن المؤقت للتعاون بين بلدان الجنوب.
    2. تبني عليه لمدة 20 دقيقة في الرايت
    3. ضع الأنابيب في مغناطيس والانتظار بضع دقائق حتى مسح الحل.
    4. إزالة الحل من الخرز.
    5. الانتقال إلى تحليل البروتين، أو تخزين العينة في ᵒC-80.

5-تقييم "التقاط تسفر عن" طريق قبكر مع الإشعال "المنطقة مصلحة التقاط الهدف"

  1. استخدام البرمجيات المناسبة أو على شبكة الإنترنت أداة لتصميم أجهزة الإشعال والمسابير للمنطقة المستهدفة.
    ملاحظة: في هذه التجربة، استهدفت منطقة المروج DUSP3 و DUSP5 . وفيما يلي أجهزة الإشعال والمجسات المستخدمة. DUSP3: التمهيدي 1-دايمنشن TTT AGG عقاري CCT جات CC، التمهيدي 2-وظفته صرفة غيغاطن TGC CG ضريبة تحويل العملة، والمسمى الاتحاد الماليزي المسبار-ATG TCC CCC وافق به جا TGA وظفته CGT؛ DUSP5: 1-TGA جا AGC CCT جات دايمنشن TC، التمهيدي 2-دول مجلس التعاون الخليجي عقاري أغا الجميح للسيارات CCC AAA AG، المسمى الاتحاد الماليزي مسبار TGC توري العلامة AGC AGC كاج ATG AGG TT التمهيدي.
  2. تأخذ قاسمة النذرة (لا يزيد عن 10 ميليلتر)، وتمييع 01:10 مع الصف الجزيئية H2o.
  3. استخراج الحمض النووي لأحد مختبرين في خطوة 2.1.7 واستخدام أن العينة من الحمض النووي لجعل منحنى قياسي بالقيام بخمسة المسلسل 01:10 تخفيف في الجزيئية الصف ح2o.
  4. إعداد مزيج رئيسي قبكر (مجموعة واسعة من البدائل التجارية)، وإضافة أجهزة الإشعال والمسابير والاستغناء عن المبلغ المناسب (15 ميليلتر إذا كان يعمل كرد فعل 20 ميليلتر) في كل بئر.
  5. إضافة 5 ميليلتر أما: أ) تضعف عينة، ب) المنحنى المعياري أو ج) الجزيئية الصف ح2س (لتكون بمثابة عدم التحكم قالب) لكل بئر.
  6. ختم اللوحة والطرد المركزي أنه في ز 100 x لمدة 1 دقيقة.
  7. تشغيل في نظام قبكر مع المعلمات التالية: 5 دقيقة في 95 ᵒC تليها دورات 40 من 95 ᵒC ل 20 ق، ᵒC 59 20 s و ᵒC 72 25 s.
  8. استخدام المنحنى المعياري لغلة المؤخرات والتقاط سارعت إلى تقييم التقاط خصوصية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نظراً للحاجة لكميات المدخلات من الكروماتين هيككاب أن تنجح، وتزرع الخلايا إلى مستويات عالية نسبيا من كونفلوينسي. تريبان تلطيخ الأزرق يستخدم للتأكد من أن معدلات الوفاة خلية معتدلة (< 10%). في نسخة واحدة التجارب، الكروماتين المحتوى قبل التهجين القبض يجب أن يكون في نطاق فيمتومولار، التي عادة ما يتطلب على الأقل 109 خلايا كابتداء من المواد. قبل تجارب واسعة النطاق، من المستحسن اختبار الأداء اليغنوكليوتيد الالتقاط في مجموعات صغيرة. يلتقط التهجين باستخدام معايرة النوكليوتيد مبينة في الشكل 1. يتم زيادة عدد النوكليوتيد التقاط تدريجيا بينما التركيز الكلي لا تزال مستمرة. هذه التجربة تبين بوضوح الجوانب الرئيسية الثلاثة. أولاً، أنه يساعد على تحديد، لأن منطقة معينة، النوكليوتيد كم مطلوبة للوصول إلى الكفاءة التهجين الأمثل (والقصوى). ثانيا، فإنه يكشف عن ما إذا كان هناك أي تفاعلات ضارة واضحة بين مجموعة معينة من النوكليوتيد. وأخيراً، فإنه يظهر ما إذا كان هناك أي النوكليوتيد مع خصوصية الفقيرة التي تحمل كميات كبيرة من الخلفية (وفي هذه الحالة تقاس بتحليل qPCR مع الإشعال استهداف المناطق الأخرى في الجينوم).

سوف تظهر غلة التهجين التقاط متواضعة نظراً لطبيعة العينة الكروماتين cross-linked. نسبة كبيرة من الشظايا في الكروماتين كروسلينكيد لن تكون قابلة للالتقاط التهجين. وتبين تجارب التهجين المسلسل هذا (الشكل 2). إذا تم بنجاح تشغيل الالتقاط التهجين، سيؤدي إلى تجربة التقاط لاحقة من نفس مادة الكروماتين باستخدام مجموعة مختلفة من التقاط النوكليوتيد في غلة (أقل قليلاً) قابلة للمقارنة من عند استخدام لونين جديدة (~ 11% انخفاض في متوسط). ولكن إذا كانت تستهدف نفس المنطقة مرة أخرى مع نفس المجموعة من النوكليوتيد في تجربة التقاط ثانية باستخدام العينات المتبقية بعد القبض على أول تجربة الكروماتين، العائد ستنخفض حوالي 90 في المائة، مما يؤكد أن معظم وقد تم القبض على المواد التهجين قابلة. إذا لم يلاحظ انخفاضا في التقاط بعد يلتقط اللاحقة مع نفس المجموعة من النوكليوتيد، أنه يشير إلى وجود مشكلة تقنية في الخطوة التقاط التهجين.

ولاحظنا في نظم بسيطة مثل الخميرة، إثراء الكفاءة التقاط تقترب من 4%5، مما أدى إلى تحديد البروتينات 9 الأثران في مناطق 2 عندما كان نمت الخميرة تحت ظروف مختلفة. في الخلايا البشرية ومع ذلك، بعد جينوم ~ 250 مرات أكبر من الخميرة، غلة التهجين عادة ما تكون أقل من 1% (الشكل 3). وكما يبين الشكل 3 ، قد تسفر عن تجربة واحدة مبالغ غير كافية لتحليل البروتينات. وفي هذه الحالة، سيكون عدة عينات تم التقاطها تجميع من أجل إجراء تحليل الطيف الكتلي لاحقة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام تركيزات أقل من الكروماتين المنطقة المستهدفة تم التقاطها لنهج التحليل مستهدفة مثل النشاف الغربية والرد المحدد الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي رصد فحوصات.

Figure 1
رقم 1: تمثيل ارسم مربع التقاط اليغنوكليوتيد المعايرة. عدد متزايد من التقاط النوكليوتيد تم اختبارها وتحليلها بواسطة qPCR. خلفية تشير إلى فحوصات qPCR استهداف المناطق الأخرى في الجينوم. يتم عرض القيم كحظيرة التغيير من التهجين القبض استخدام اليغنوكليوتيد واحد. شعرات تمثل قيم الحد الأدنى والحد الأقصى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التمثيل ارسم مربع يلتقط المسلسل. إظهار يلتقط متسلسلة التهجين مع نفس المجموعة من النوكليوتيد (A_A) يلتقط انخفاضا قويا في إثراء التهجين متسلسلة بالمقارنة مع استخدام مجموعة مختلفة من النوكليوتيد (A_B) (p = 3.88 e-5). تخصيب يقاس قبكر ويتم عرض القيم بالنسبة يلتقط باستخدام لونين جديدة. شعرات تمثل قيم الحد الأدنى والحد الأقصى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التقاط التهجين باستخدام الخلايا البشرية- التقاط التهجين من المناطق الموجودة في الكروموسومات المختلفة. كل المنطقة بمثابة عنصر تحكم سلبية للآخر. بالإضافة إلى ذلك، يتم التقاط تهجين استخدام التسلسل (Scr) سارعت كعنصر تحكم سلبية حقيقية. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد هيككاب الطريقة الموضحة هنا العديد من الميزات الفريدة التي تجعل من نهج قوية للكشف عن التفاعلات بين الحمض النووي وإلا سيظل بعيد المنال. طبيعة العملية يعطي هيككاب المرونة اللازمة للعمل في مختلف الكائنات الحية ومناطق من الجينوم. وطريقة، ومع ذلك، يحتوي على العديد من القيود التي سينظر فيها.

هيككاب هو أسلوب الذي يتجنب أي تعديلات الخلية حيث أنه يحتمل أن يمكن أن تطبق في الخلايا الأولية، ونظم الثقافة الخلية، أو عينات الأنسجة حتى. بسبب ذلك، ومع ذلك، يتطلب عينات لتكون كروسلينكيد، مما يقلل من حساسية في تحليل البروتين ويتطلب بالتالي كميات المدخلات. هناك ناشئة النهج التي تعتمد على كريسبر وبيوتينيليشن المحيطة بالبروتينات التي يمكن أن تعمل بدون كروسلينكينج ردود فعل12،13،،من1418. يمكن أن تكون هذه النهج قوية جداً إذا الملاحق بلازميد لا تمثل عائقا، ولكن يمكن استخدامها فقط في خلية ثقافة النظم. نهوج أخرى مؤهلة جيدا لتحديد البروتين عامة الجمعيات استناداً إلى دولة الكروماتين أو وجود عوامل النسخ خاصة، ولكن لا يقصد بها دراسة المكاني الفردية9،10،19 .

النهج هيككاب الذي يعرض نهج بديل مع انطباق واسع النطاق، ولكن من المرجح أن التطبيقات في نظم خلية مختلفة أو الكائنات الحية سوف تتطلب التحسين. الخطوة الأمثل الأكثر حسما في النهج الذي ينطوي على تصميم واختيار النوكليوتيد الالتقاط. يجب أن تظهر سلسلة من اختبارات صغيرة الحجم إذا النوكليوتيد المصممة مناسبة وفعالية يتم التقاط التسلسل في المنطقة. وهناك العديد من العوامل التي يجب اعتبارها عند تصميم واختبار النوكليوتيد الالتقاط، مثل طول اليغنوكليوتيد، درجة التحديد إلى المنطقة المستهدفة، والتفاعلات بين مجموعة النوكليوتيد لاستخدامها. ويمكن اختبار كل هذه التفاعلات سهولة باستخدام مقايسة qPCR محددة للمنطقة المستهدفة. إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام سير عمل رقاقة-Seq-مثل تسلسل الحمض النووي الشظايا الناجمة عن ذلك وأؤكد أن خصوصية الإثراء مرضية عبر كامل الجينوم5.

أخيرا، الشروط cross-linking أيضا بالغة الأهمية في الإجراء هيككاب، وقد لاحظنا اختلافات ملحوظة بين مختلف النظم والحصول على أفضل النتائج في الخلايا البشرية بالعابرة للربط مع 1% فورمالدهايد، بينما في الخميرة، العابرة للربط مع 3% فورمالدهايد أسفرت عن مزيد من النتائج استنساخه. فمن الممكن أن العابرة للربط أكثر كثافة مع فورمالدهايد 3% في الخلايا البشرية بهيكل أكثر تعقيداً من الكروماتين لا توفر إمكانية كافية لالتقاط التهجين النوكليوتيد. وأيضا تصور أن وجود جدار الخلية في الخميرة يعوق الوصول والفورمالديهايد في الخلايا، زيادة مقدار فورمالدهايد اللازمة لمستويات crosslinking ناجحة في الكروماتين.

أداء رقاقة ونهج التقاط أخرى تستهدف الكروماتين كروسلينكيد البشرية، وقد لاحظنا أن سوى حوالي 1 في المائة المستهدف الحمض النووي يمكن التقاط الواقع. لمعظم النهج المستندة إلى الحمض النووي والتحاليل، هذا ليس عاملاً مقيداً. ومع ذلك، خلافا لرقاقة، حيث تستند قراءات النهائي على الحمض النووي أمبليفيابل، هيككاب يعتمد على المحتوى البروتيني لقراءات النهائي. مطلوبة بسبب هذا القيد الجوهرية، كميات كبيرة من المواد المدخلة (الخلايا المستزرعة في التجارب المعروضة هنا): تقييد هذا ينبغي النظر بعناية قبل استكشاف هذه المنهجية، خاصة عند تطبيقه على مناطق نسخة واحدة. ليست كافة أنظمة سوف تكون قادرة على إنتاج عدد الخلايا المطلوبة، أو التكلفة من تزايد إعداد الخلايا المطلوبة قد تكون باهظة. المبالغ الإدخال أن هيككاب يتطلب (~ 109 خلايا) مقارنة بالأساليب الأخرى التي تعتمد على المواد كروسلينكيد مع إدخال مبالغ تتراوح ما بين 108 و11 10 خلايا9،،من1115. التعديلات المقبلة للتكنولوجيا هيككاب سيتم استكشاف نهج مصطنع زيادة إعداد نسخة من المناطق المستهدفة، لجعل هذا الأسلوب المطبق على نطاق أوسع. في الوقت نفسه، سوف نعمل على مواصلة زيادة الكفاءة العامة للعملية التي جنبا إلى جنب مع التقدم المستمر في الطيف الكتلي وينبغي تقليل كميات المدخلات اللازمة وجعل هذه التكنولوجيا ممكنة في نظم أكثر.

بيوتينيليشن على أساس نهج استخدام كريسبر، مثل انتشيب18 وغيرها13،14، قد أظهرت أن تكون فعالة جداً بالقضاء على الحاجة إلى المواد كروسلينكيد وزيادة الغلات ويقلل بإدخال المتطلبات. بيد أن معالجة وضع الخلايا في هذه الأساليب لا تسمح هذه التقنيات ليتم تطبيقها على عينات الأنسجة، واتجاه الذي بدأنا السعي مع هيككاب، والتي تنتج نتائج واعدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

هناك لا تضارب في الكشف.

Acknowledgments

ودعم هذا العمل P50HG004952 منح المعاهد الوطنية للصحة و R01GM109099 إلى mo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7, (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89, (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107, (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13, (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46, (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12, (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20, (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2, (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439, (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170, (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16, (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15, (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8, (4), 870-882 (2009).
تكيف تهجين التقاط البروتينات المرتبطة بلونين للبروتينات في خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter