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Genetics

Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

doi: 10.3791/57140 Published: June 1, 2018

Summary

Se trata de un método para identificar nuevas proteínas DNA-que obran recíprocamente en lugares geométricos específicos, basándose en la captura de la secuencia específica de cromatina reticular para análisis proteómicos posteriormente. No se requiere ningún conocimiento previo sobre posibles proteínas, ni modificaciones de la célula. Inicialmente desarrollado para la levadura, la tecnología ahora se ha adaptado para células de mamífero.

Abstract

La captura de la hibridación de las proteínas asociadas a cromatina para tecnología de la proteómica (HyCCAPP) fue inicialmente desarrollada para descubrir nuevas interacciones ADN-proteína en levaduras. Permite el análisis de una región de objetivo de interés sin necesidad de conocimientos previos sobre las proteínas probablemente vinculado a la región de destino. Esto, en teoría, permite HyCCAPP a utilizarse para analizar cualquier región genómica de interés, y proporciona suficiente flexibilidad para trabajar en sistemas de células diferentes. Este método no es para el estudio de sitios de Unión conocido de factores de transcripción, una tarea más adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y viruta-como métodos. La fuerza de HyCCAPP reside en su capacidad de explorar regiones de ADN que es limitado o ningún conocimiento sobre las proteínas limitado a él. También puede ser un método conveniente para evitar sesgos (presente en la viruta-como métodos) introducidos por el enriquecimiento de la base de proteínas de la cromatina mediante anticuerpos. Potencialmente, HyCCAPP puede ser una poderosa herramienta para descubrir interacciones DNA proteína verdaderamente novedosas. Hasta la fecha, la tecnología ha sido aplicada principalmente a las células de levadura o a secuencias de la repetición copia alta en células de mamíferos. Para convertirse en la herramienta que tenemos la visión, enfoques HyCCAPP deban ser optimizada para capturar eficientemente loci de la solo-copia en células de mamíferos. Presentamos la adaptación de la levadura inicial HyCCAPP captura de protocolo a líneas celulares humanas y muestran que las regiones de la cromatina de la solo-copia pueden ser eficientemente aisladas con este protocolo modificado.

Introduction

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Durante la última década, ha visto una mejora dramática en tecnologías de secuenciación, permitiendo el estudio de una amplia gama de los genomas en gran número de muestras y con una resolución asombrosa. El consorcio de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE), un esfuerzo multi-institucional a gran escala dirigido por el nacional Instituto de investigación de genoma humano de los institutos nacionales de salud, ha proporcionado ideas sobre cómo los factores de transcripción y se unen a otras proteínas reguladoras e interactúan con el genoma. El esfuerzo inicial caracteriza interacciones DNA proteína, según lo determinado por la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para más de 100 conocidos de proteínas DNA-que atan1. Métodos alternativos como el DNase footprinting2 formaldehído asistida aislamiento de elementos reguladores (FAIRE)3 también han sido utilizados para localizar regiones específicas del genoma interactuando con proteínas, pero con la limitación obvia de que Estas aproximaciones experimentales no identifican las proteínas obran recíprocamente. A pesar de los grandes esfuerzos en los últimos años, no ha emergido ninguna tecnología que permite eficazmente la caracterización completa de las interacciones proteína-ADN en cromatina y la identificación y cuantificación de proteínas asociadas a cromatina.

Para abordar esta necesidad, hemos desarrollado un nuevo enfoque que hemos denominadas como Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteínas de Proteómica (HyCCAPP). Desarrollado inicialmente en levadura4,5,6, lo aísla reticulado cromatina las regiones de interés (con proteínas dependientes) mediante captura hibridación específica de secuencia. Después de aislamiento de los complejos de proteína ADN, métodos como la espectrometría de masas pueden utilizarse para caracterizar el conjunto de proteínas a la secuencia de interés. Así, HyCCAPP puede considerarse como un enfoque imparcial para descubrir la novela interacciones DNA proteína, en el sentido de que no se basa en anticuerpos y es totalmente agnóstico sobre las proteínas que se pueden encontrar. Hay otros enfoques capaces de descubrir la novela interacción con DNA proteínas7, pero dependen más de viruta-como métodos8,9,10, plásmido inserciones11,12, 13,14, o regiones con alta copia número15. En cambio, HyCCAPP puede ser aplicado a las regiones múltiples y solo copia y no requiere ninguna información previa acerca de las proteínas en la región. Además, mientras que algunos de los métodos mencionados arriba han características valiosas, en particular evitando la necesidad para reacciones de entrecruzamiento de ADN-proteína, la característica única de HyCCAPP es que puede aplicarse a regiones solo copia sin modificar las células y sin ninguna conocimiento previo acerca de supuestas proteínas o anticuerpos disponibles.

En este punto, predominante se ha aplicado al análisis de varias regiones genómicas en levadura4,5,6HyCCAPP y recientemente se utilizó para analizar las interacciones proteína-ADN en ADN satélite alfa, una región de repetición en el genoma humano16. Como parte de nuestra labor, hemos adaptado el enfoque de captura hibridación inicialmente desarrollado para que la cromatina de la levadura ser aplicable al análisis de las células humanas y aquí presentamos un protocolo modificado que permite la captura selectiva de destino de la solo-copia regiones en el genoma humano con eficiencias similares a nuestros estudios iniciales en la levadura. Este nuevo protocolo optimizado permite la adaptación y utilización de la tecnología para interrogar las interacciones proteína-DNA en el genoma humano, mediante espectrometría de masas u otros enfoques analíticos.

Es importante destacar que el método HyCCAPP está diseñado para el análisis de regiones de objetivo específico y no es conveniente para el análisis del genoma. La tecnología es especialmente útil cuando se trata de regiones para las cuales hay escasa información sobre las proteínas obran recíprocamente, o cuando se desea un análisis profundo más amplio de proteínas obran recíprocamente en un locus específico del genoma. HyCCAPP pretende descubrir proteínas DNA-que atan pero no caracterizar con precisión los sitios de unión de proteínas específicas en la DNA genomic. En su implementación actual, la metodología no proporciona información sobre las secuencias de DNA que atan o motivos para proteínas individuales. Por lo tanto, muy bien complementa las tecnologías existentes como la feria y puede permitir la identificación de nuevas proteínas en regiones genómicas identificado por un análisis inicial de la feria.

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Protocol

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1. captura de diseño de oligonucleótidos

  1. Diseño de un panel de oligonucleótidos que se utilizará durante la captura de la hibridación de la región de destino/s.
    1. Objetivo es diseñar oligonucleótidos de 4 – 8 por región de destino, pero como mínimo, diseño de oligonucleótidos por lo menos uno a cada extremo de la región de destino.
    2. Si la secuencia de destino es larga (> 500 pares de bases), diseño de los oligonucleótidos como propagación hacia fuera como sea posible para asegurar el enriquecimiento efectivo de la cromatina en toda la región de destino todo.
      Nota: Hemos observado una captura óptima con oligonucleótidos de 4 – 8. Aunque este proceso puede trabajar bien con oligonucleótidos más, no es infrecuente observar una disminución en los rendimientos de enriquecimiento cuando se utilizan muchos oligonucleótidos.
  2. Diseño de oligonucleótidos con temperatura de fusión similar y asegúrese de que no formar horquillas fuertes ni tienen fuertes interacciones (tomando en cuenta que las hibridaciones se llevará a cabo en 42 ᵒC).
    Nota: Si la elución de un punto de apoyo es elegida (4.12.3), una secuencia base 8 externo adicional debe agregarse a los oligonucleótidos y requerirá oligonucleótidos complementarios 'release' a la hora de la elución17. Varias herramientas de software comercial se pueden utilizar para seleccionar y analizar los oligonucleótidos. 25 mers han demostrado buenos resultados, pero dependiendo del tamaño del genoma y la secuencia, captura de oligonucleótidos pueden contener en algún lugar entre 20 – 80 bases. Por lo general, captura de oligonucleótidos tienen una temperatura de fusión cerca de 62 ᵒC, pero que puede cambiar dependiendo de su longitud. Temperatura de fusión constante o longitud del oligonucleótido a lo largo de la mezcla de captura puede ayudar a evitar sesgos no deseados en enriquecimiento.
  3. Diseño de los oligonucleótidos de captura con una molécula de biotina (preferentemente separado por un separador de la secuencia de captura) en el extremo 3'.

2. cultivo celular

  1. Crecen las células linfoblastoides humanas (por ejemplo GM12878 se muestra aquí) u otras líneas celulares en Medio RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, penicilina-estreptomicina de 1% y 5% de suero bovino fetal (FBS), ᵒC 37 y 5% CO2.
    1. Inicial de semillas congeladas en alícuotas (2 – 5 x 105 células) en un matraz T-25 con 6 mL de Medio RPMI 1640 en 2.1.
    2. Controle la densidad celular y viabilidad.
      1. Tomar a un representante alícuotas de células y tinción con un colorante apropiado como trypan blue.
      2. Medir la densidad de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
    3. Antes de que la célula llega a densidad de 1 x 106 células/mL, las células de la vuelta abajo a 100 x g por 5 min y transferir las células a un matraz T-75 con 25 mL de Medio RPMI 1640 en 2.1. Crecen las células hasta que la densidad celular acerca a 1 x 106 células/mL.
    4. Transferir las células a un matraz T-150 en 38 mL de Medio RPMI 1640 (2.1) y aumentan las células de dos días adicionales.
      Nota: Las células linfoblastoides crecen en suspensión. Lineamientos generales para el cultivo de células linfoblastoides recomiendan densidades de células a mantenerse entre 0.2 – 1 x 106 células/mL. Debido a la gran cantidad de material requerido en esta tecnología, el presente Protocolo es escrito deliberadamente para crecer las células a una densidad de células más allá de lo que comúnmente se utiliza. Protocolos de crecimiento de la célula pueden ser revisados y adaptados por el lector según los tipos de células para ser utilizado.
    5. Las células de la vuelta abajo a 100 x g por 5 min, resuspender las células en 10 mL de Medio RPMI 1640 (2.1) y vierta la suspensión en una botella de rodillo de2 850 cm que contenga 500 mL de medios de comunicación. Incubar las células en las mismas condiciones que antes pero en este momento empiezas a usar rotación constante (~0.5 rpm).
    6. Controlar el crecimiento celular y cambiar los medios de comunicación cuando sea necesario (normalmente cada 3-4 días). Que las células crecen hasta una densidad tan cerca como sea posible a 2 x 106 células/mL (1 x 109 células en total).
    7. Al llega a la cuenta de célula deseada, cosechar las células haciendo girar las células abajo a 100 x g durante 5 min y resuspender las células en 36 mL de Medio RPMI 1640 (2.1). Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 50 mL. Tomar pequeñas partes alícuotas para el conteo de células y la extracción de ADN.
  2. Reticulación mediante la adición de 1 mL de formaldehído al 37% para llegar a una concentración final de 1%.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es un carcinógeno y debe manejarse en una campana de humos.
    1. Incubar las células con rotación (~ 30-60 rpm) durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
    2. Calmar la reacción de reticulación por añadir 2 mL de una solución de glicina de 2,5 M, para una concentración final de 125 mM.
    3. Incubar las células con rotación (~ 30-60 rpm) por 5 min a TA. sedimenten las células por centrifugación a 100 x g durante 5 min y se lavan las células dos veces con PBS 1 x frío de hielo.
  3. Continuar siguiente paso o Resuspender el precipitado en 5 mL de tampón de lisis celular (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, inhibidores de la proteasa (PI)) y rápido-congele la suspensión gota a gota en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras a-80 ᵒC.
    Nota: Preparar > 25 mL de tampón de lisis celular sin Igepal y PI y agregar los reactivos recién cuando esté listo para usar. Evite el almacenamiento a largo plazo de tampón de lisis de la célula una vez que se han añadido Igepal y PI. Tienda celular tampón de lisis a 4 ᵒC hasta 3 meses. Igepal es un detergente no iónico, no desnaturalizantes. NP-40 puede utilizarse potencialmente como una alternativa a Igepal pero no hemos utilizado lo en este contexto como NP-40 no se recomienda cuando las muestras se analizan finalmente por espectrometría de masas para caracterizar las proteínas de unión del ADN.

3. lisis y corte

  1. Preparar > 15 mL de tampón de lisis de núcleos (10 mM EDTA, 50 mM de Tris pH 8.0, 1% SDS, PI).
    Nota: Agregar PI fresco, sólo a las cantidades a utilizar. Evite el almacenamiento a largo plazo de tampón de lisis de núcleos una vez que se ha añadido la PI. Tampón de lisis de núcleos puede almacenarse a temperatura ambiente hasta por 1 mes.
  2. Resuspender el precipitado en 20 mL de tampón de lisis celular (contiene Igepal y PI). Permita que los pellets descongelar el hielo y mezclar bien descongelado. Deje las muestras por un adicional 10 min en hielo. Centrifugar las células a 400 x g a 4 ᵒC durante 5 minutos.
  3. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 6 mL de tampón de lisis de núcleos con PI (volumen puede incrementarse si las células no forman una suspensión).
  4. En preparación para la sonicación, dividir la muestra uniformemente en el ~ 6-8 tubos de microcentrífuga (600 a 1.000 μl para cada tubo).
    1. Coloque las muestras en hielo o en un rack frío y someter a ultrasonidos la muestra utilizando un sonicador con una micropunta. Uso de amplitud de 65% con explosiones constante de 5 x 20 s, permitiendo que la suspensión se enfríe durante por lo menos 40 s entre pulsos.
      Nota: Si aumenta de volumen > 10 mL por muestra, un cristal de la célula de enfriamiento puede utilizarse en su lugar. Más y más ráfagas serían necesarios entonces. Sonicators son muy diferentes. Las condiciones que tenga que ser optimizado por el lector. Otras alternativas de la sonicación se pueden utilizar también.
  5. Centrifugar las células a 12.000 x g durante 10 min a 4 ᵒC, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche los pellets.
  6. Estiman recuperación total utilizando el método fluorométrico.
  7. Continuar al siguiente paso o complemento-congelar y almacenar la muestra a-80 ᵒC.
  8. Opcional: Tomar una alícuota, retroceso reticulaciones por incubación durante la noche en el 67 ᵒC en 0,3 M de NaCl. Limpiar ADN y ejecutarlo en el equipo Bioanalyzer para determinar longitudes de fragmento. La mayor parte de los fragmentos debe ser entre 500 y 1.000 PB.
    Nota: Está bien parada en este punto y almacenar las muestras a-80 ᵒC.

4. hibridación captura

  1. Preparar 500 mL de tampón de hibridación (Hyb) 2 (200 mM MES, 2 M de NaCl, 40 mM EDTA 0,02% Tween-20) y 500 mL de tampón de lavado (200 mM NaCl, 0.2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Almacene el Hyb y tampones de lavado 4 ᵒC y temperatura ambiente, respectivamente, por hasta 3 meses. Utilizar la mitad de los 2 buffer de x Hyb para preparar un 1 x de tampón de hibridación. También guarde a 4 ᵒC hasta 3 meses.
    Nota: El volumen total de la captura de hibridación será dos veces el volumen de la muestra resultante en el paso anterior (como se ha descrito hasta ahora, el volumen de muestra sería alrededor de 6 mL y por lo tanto el volumen total de la hibridación sería 12 mL).
  2. Dejar de lado los granos igual al 5% del volumen de captura total de la hibridación (600 μL en este caso). Un imán apropiado y adecuado es necesario para trabajar con las cuentas en los siguientes pasos.
  3. Lavar los granos tres veces con 1 x Hyb Buffer usando dos veces el volumen de los granos (1200 μL). Resuspender los granos en 1.200 μL de 2 x Hyb Buffer. Colocar los tubos en el imán, hasta que la solución se aclare y retirar el tampón.
  4. Realizar pre-claro reacciones en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con un máximo de 700 μl de muestra por tubo. Añadir suficientes granos (5%) y 2 x Hyb Buffer para diluir el Hyb buffer 1 x (10 tubos con 600 μl de muestra y 120 μl de granos lavados resuspendió en 2 x Hyb Buffer 480 μl de 2 x Hyb Buffer). Incubar 10 min a 31 ᵒC con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm).
  5. Colocar los tubos en un imán, hasta que los granos son inmovilizados y transferir las muestras a tubos nuevos. Deseche los granos.
    Nota: Desde este punto hacia adelante, se recomiendan tubos de enlace de baja.
  6. Suspender las captura de oligonucleótidos a una solución de trabajo de 10 pmol/μl y añada 4 μL de esta solución en cada tubo.
    Nota: Diferentes regiones pueden actuar como control uno para el otro, pero se recomienda incluir un oligonucleótido de captura con su secuencia codificada para servir como un control negativo verdadero.
  7. Incubar los tubos durante 40 min a 42 ᵒC con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm).
  8. Durante la incubación, apartar los granos necesitados (0,3 μl/pmol de oligonucleótidos de captura). Lavar los granos tres veces como se describe en el paso 4.3, pero resuspender las células en 1 x Hyb Buffer.
  9. Agregue los granos lavados a la muestra e incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente con el extremo sobre rotación final (~ 30-60 rpm). Colocar los tubos en el imán y eliminar el sobrenadante una vez que los granos han sido inmovilizados.
  10. Lavar los granos
    1. Añadir 1,2 mL de tampón de lavado e incubar la muestra durante 5 minutos con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en tubos RT. lugar en el imán y espere un par de minutos hasta que la solución se despeja. Extraiga el tampón y repita este paso.
    2. Añadir 1,2 mL de tampón de lavado e incubar durante 1 h con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en RT. colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Extraiga el tampón y repita este paso reduciendo el tiempo de incubación a 30 min del segundo tiempo.
    3. Añadir 200 μL de tampón de lavado e incubar durante 15 minutos con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en 31 ᵒC. Colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Retirar el tampón.
    4. Añadir 200 μL de PBS e incubar por 5 min con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en RT. colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Extraiga el tampón y repita este paso.
  11. Elución simple
    1. Agregar 40 μl de agua grado molecular a los granos e incubar a 94 ᵒC durante 5 minutos.
    2. Colocar los tubos en el imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.
    3. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche los granos.
    4. Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC.
      Nota: Este tipo de elución funciona bien para el posterior análisis de qPCR y algunas mediciones de proteómica, pero en otros casos dos enfoques alternativos que se describen a continuación eluatos de rendimiento "limpiador".
  12. Elución de DNasa.
    1. Agregar 40 μl de 1 x Buffer de DNasa y 2 U de la ADNsa a cada tubo.
    2. Incubar los tubos durante 15 min a 37 ᵒC.
    3. Colocar los tubos en un imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.
    4. Retire las muestras eluídas de los granos y colocar las muestras en un tubo nuevo de enlace de baja.
    5. Incubar el tubo a 94 ᵒC por 7 min inactivar la enzima y proceder a los análisis proteómicos.
      Nota: Concentraciones más bajas de la ADNsa pueden utilizarse si se observa interferencia con los análisis proteómicos. No será posible calcular los captura de los enriquecimientos por qPCR si este método de elución se usa ya que el tratamiento de DNasa destruye totalmente el material de ADN en la muestra.
    6. Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC.
  13. Elución de punto de apoyo17.
    Nota: Este método no se recomienda para oligonucleótidos más largo (> 40 bases). Este método requiere las captura de oligonucleótidos contener un 8 bases adicionales que no se superponen con la secuencia genómica y oligonucleótidos complementarios liberación con el fin de desplazar el objetivo de las captura de oligonucleótidos.
    1. Diluir 2 nanomoles de oligonucleótidos de liberación en 40 μl de tampón SSC.
    2. Incubar por 20 min a TA.
    3. Colocar los tubos en un imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.
    4. Retire la solución de los abalorios.
    5. Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC.

5. evaluación de captura de rendimiento por qPCR con las cartillas para el objetivo captura de región de interés

  1. Utilizar un software apropiado o herramienta en línea para el diseño de primers y sondas para la región de destino.
    Nota: En este experimento, la región del promotor del DUSP3 y DUSP5 fueron atacados. Los cebadores y sondas son las siguientes. DUSP3: cartilla 1 - GTG TTT AGG TTC GAT CCT CC, cartilla 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, punta de prueba etiquetada FAM - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: cartilla 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, cartilla 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, sonda marca FAM TGC ATT etiqueta AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Tomar una alícuota de eluido (no más de 10 μl) y diluir 1:10 con grado molecular H2O.
  3. Extraer el ADN de una de las alícuotas tomadas en el paso 2.1.7 y utilizar esa muestra de ADN para realizar una curva estándar haciendo cinco serie 1:10 diluciones en molecular grado H2O.
  4. Preparar una mezcla maestra de qPCR (gran variedad de alternativas comerciales), añadir cebadores y sondas y dispense la cantidad adecuada (15 μl si ejecuta una reacción de 20 μl) en cada pocillo.
  5. Añadir 5 μl de cualquiera: a) diluye la muestra, b) la curva estándar o grado c) molecular H2O (para servir como ningún control de la plantilla) a cada pocillo.
  6. La placa de sello y centrifugar a 100 x g durante 1 minuto.
  7. En un sistema qPCR con los siguientes parámetros: 5 min a 95 ᵒC seguido por 40 ciclos de 95 ᵒC de 20 s, ᵒC 59 20 s y 72 ᵒC de 25 s.
  8. Utilice la curva estándar para evaluar rendimientos y captura revuelto para evaluar la especificidad de la captura.

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Representative Results

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Debido a la necesidad de grandes cantidades de entrada de la cromatina para HyCCAPP tener éxito, las células crecen a niveles relativamente altos de confluencia. Tripán coloración azul se utiliza para confirmar que las tasas de muerte celular son moderadas (< 10%). En experimentos de única copia, contenido de cromatina antes de la hibridación captura tiene que ser en la gama femtomolar, que generalmente requiere al menos 109 células como material de partida. Antes experimentos de escala completa, se recomienda para probar funcionamiento de oligonucleótidos de captura en lotes más pequeños. Capturas de hibridación usando una titulación de oligonucleótidos se muestran en la figura 1. El número de captura de oligonucleótidos se aumenta gradualmente mientras que la concentración total se mantiene constante. Este experimento muestra claramente tres aspectos fundamentales. En primer lugar, ayuda a determinar de región en particular, oligonucleótidos cuántas se necesitan para alcanzar eficiencias de hibridación óptima (y máxima). En segundo lugar, revela si hay alguna interacción perjudicial evidente entre un conjunto particular de oligonucleótidos. Por último, muestra si hay cualquier oligonucleótidos con pobre especificidad que llevan cantidades sustanciales de fondo (en este caso medido por análisis de qPCR con cebadores dirigidos a otras regiones en el genoma).

Los rendimientos de captura hibridación aparece modestos debido a la naturaleza entrelazada de la muestra de la cromatina. Una gran proporción de fragmentos en la cromatina reticular no será favorable para la captura de hibridación. Experimentos de hibridación serial demuestran este (figura 2). La captura de hibridación se ejecuta con éxito, un experimento de la captura posterior del mismo material de la cromatina con un conjunto diferente de oligonucleótidos de captura dará como resultado comparables rendimientos (ligeramente menores) que cuando se utilizan fresca cromatina (~ 11% inferior en promedio). Pero si la misma región se apunta otra vez con el mismo conjunto de oligonucleótidos en un segundo experimento de captura utilizando la cromatina muestra restante después de la captura del primer experimento, el rendimiento disminuirá cerca del 90%, lo que confirma que la mayoría de los material susceptibles de hibridación ha sido capturado. Si tal disminución en la captura no se observa después de la captura posterior con el mismo conjunto de oligonucleótidos, indica un problema técnico en el paso de captura de hibridación.

En sistemas sencillos como levadura, hemos observado eficiencias de captura a 4%5, lo que condujo a la identificación de 9 proteínas diferencialmente enriquecieron en 2 regiones cuando levadura fue cultivada bajo diferentes condiciones. En células humanas sin embargo, tener un genoma ~ 250 veces más grande que la levadura, rendimientos de hibridación son típicamente debajo de 1% (figura 3). Como muestra la figura 3 , un solo experimento puede rendir cantidades insuficientes para el análisis de proteómica. En ese caso, varias muestras capturadas tendrán que combinarse para llevar a cabo un análisis de espectrometría de masas posteriores. Por otra parte, concentraciones más bajas de la cromatina de región del objetivo capturado pueden utilizarse para análisis específicos de enfoques como el western blot y reacción seleccionada basadas en espectrometría de masa, seguimiento de los ensayos.

Figure 1
Figura 1: representación de parcela cuadro de valoración de captura del oligonucleótido. Incremento de captura de oligonucleótidos fueron probados y analizados por qPCR. Fondo se refiere a ensayos de qPCR a otras regiones en el genoma. Los valores se presentan como doble cambio de captura de hibridación mediante un único oligonucleótido. Bigotes representan los valores mínimos y máximos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: representación de diagrama de caja de capturas de la serie. Capturas de hibridación secuencial con el mismo conjunto de oligonucleótidos (A_A) muestran una fuerte caída en el enriquecimiento en comparación con hibridación secuencial captura utilizando diferentes oligonucleótidos (a-b) (p = 3.88 e-5). Enriquecimiento se mide por qPCR y los valores se muestran en relación con la captura con cromatina fresca. Bigotes representan los valores mínimos y máximos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: captura de hibridación con células humanas. Hibridación captura de regiones ubicadas en cromosomas diferentes. Cada región sirve como un control negativo para el otro. Además, una captura de la hibridación se realiza utilizando la secuencia de (Scr) revuelta como un verdadero control negativo. Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El método de HyCCAPP descrito aquí tiene muchas características únicas que lo convierten en un enfoque de gran alcance para descubrir el ADN-las interacciones que de lo contrario seguiría siendo difícil de alcanzar. La naturaleza del proceso da HyCCAPP la flexibilidad para trabajar en diferentes organismos y regiones del genoma. Es un método, sin embargo, que tiene varias limitaciones a tener en cuenta.

HyCCAPP es un método que evita las modificaciones celulares que potencialmente puede ser aplicado en células primarias, sistemas de cultivo de células o las muestras de tejido uniforme. Por eso, sin embargo, requiere muestras ser reticulado, que reduce la sensibilidad en el análisis proteómico y por lo tanto requiere grandes cantidades de entrada. Surgen los enfoques que se basan en CRISPR y biotinylation de alrededor de proteínas que pueden funcionar sin reticulación reacciones12,13,14,18. Estos enfoques pueden ser muy poderosos si inserciones plásmido no representan una limitación, pero sólo pueden ser utilizadas en sistemas de cultivo celular. Otros enfoques son muy adecuados para identificar proteínas general asociaciones basan en un estado de cromatina o en la presencia de un particular de factores de transcripción, pero no pretenden estudiar lugares geométricos individuales9,10,19 .

El enfoque de HyCCAPP presenta una alternativa de amplia aplicabilidad, pero es probable que las aplicaciones en sistemas de diferentes células u organismos requiere optimización. El paso más crítico de la optimización en el método consiste en el diseño y la selección de oligonucleótidos de captura. Una serie de pruebas a pequeña escala debe mostrar si los oligonucleótidos diseñados son apropiados y si efectivamente es capturada la secuencia en la región. Hay varios factores que deben considerarse al diseñar y pruebas de captura de oligonucleótidos, como longitud del oligonucleótido, grado de especificidad a la región de destino y las interacciones entre el conjunto de los oligonucleótidos para ser utilizado. Todas estas interacciones se pueden probar fácilmente usando un análisis de qPCR específicos a la región de destino. Si lo desea, puede utilizarse un flujo de trabajo de ChIP-Seq-como la secuencia de los fragmentos de ADN resultantes y asegurar que la especificidad del enriquecimiento es satisfactoria en la totalidad del genoma5.

Por último, las condiciones de cross-linking son también muy importantes en el procedimiento de HyCCAPP, y hemos observado diferencias notables entre los distintos sistemas, obtener los mejores resultados en las células humanas por Cross-linking con formaldehído al 1%, mientras que en la levadura, Cross-linking con formaldehído al 3% rindió más resultados reproducibles. Es posible que el cross-linking más intensa con formaldehído al 3% en células humanas con una estructura más compleja de la cromatina no proporciona suficiente accesibilidad para la captura de oligonucleótidos de hibridación. También es concebible que la presencia de una pared celular de levadura impide acceso de formaldehído en las células, aumentando la cantidad de formaldehído para los niveles de entrecruzamiento exitoso en la cromatina.

Realizar la viruta y otros métodos de captura dirigida a cromatina humano reticulado, hemos observado que realmente puede capturar sólo un 1% del ADN diana. Para la mayoría de los enfoques basados en ADN y análisis, no es un factor limitante. Sin embargo, a diferencia de la viruta, donde la lectura final se basa en ADN amplificable, HyCCAPP se basa en el contenido de proteína para la lectura final. Debido a esta limitación intrínseca, se requieren grandes cantidades de material de entrada (células cultivadas en los experimentos aquí presentados): este restringir debe considerarse cuidadosamente antes de explorar esta metodología, especialmente cuando se aplica a las regiones de la solo-copia. No todos los sistemas serán capaces de producir el número de células necesarias, o el costo de crecer el número de células necesario podría ser prohibitivo. Las cantidades de entrada que HyCCAPP requiere (~ 109 células) es comparable a otros métodos que dependen de material reticulado con entrada cantidades que oscilan entre los 108 y 10 de11 células de9,11,15. Modificaciones futuras de la tecnología de HyCCAPP explorar enfoques para incrementar artificialmente los números de copia de las regiones de destino, para hacer este método más ampliamente aplicable. Al mismo tiempo, trabajaremos para seguir aumentando la eficiencia global del proceso que junto con los continuos avances en espectrometría de masas debe reducir las cantidades de entrada necesarios y viabilizar esta tecnología en más sistemas.

Biotinilación basado en enfoques utilizando CRISPR, como enCHiP18 y otros13,14, han demostrado ser muy eficaz eliminando la necesidad de material reticulado, aumentando rendimientos y reduciendo significativamente la entrada de requisitos. Sin embargo, el elaborado proceso de células en estos métodos no permite estas técnicas aplicables a las muestras de tejido, una dirección que hemos empezado a seguir con HyCCAPP y que está produciendo resultados alentadores.

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Disclosures

Hay no hay conflictos de interés que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH P50HG004952 y R01GM109099 a MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

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References

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Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos
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Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

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