Nukleinsyra nedbrytning i arkivens vävnad, tumör heterogenitet och brist på färsk fryst vävnadsprover kan negativt påverka cancer diagnostiska tjänster i patologi laboratorier över hela världen. Detta manuskript beskriver optimering av en panel av biomarkörer med en multiplex magnetiska pärla-analys för att klassificera bröstcancer.
Nukleinsyra nedbrytning i arkivens vävnad, tumör heterogenitet och brist på färsk fryst vävnadsprover kan negativt påverka cancer diagnostiska tjänster i patologi laboratorier över hela världen. Gen förstärkning och uttryck diagnostiska tester med arkivens material eller material som kräver transport till underhåll laboratorier, behöver ett mer robust och exakt test anpassas till aktuella kliniska arbetsflöden. Vår forskargrupp optimerad användning av Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) att kvantifiera RNA i arkivmaterial med Grenade-DNA (bDNA)-teknik på Luminex xMAP® magnetiska pärlor. Gen uttryck analysen beskrivs i detta manuskript är en roman, snabb och multiplex metod som kan klassificera bröstcancer i de olika molekylära subtyper, utelämna subjektivitet tolkningen inneboende i imaging tekniker. Dessutom, på grund av låg input av material krävs, heterogena tumörer kan vara laser microdissected med Hematoxylin och Eosin (H & E) färgade sektioner. Denna metod har ett brett utbud av möjliga tillämpningar inklusive tumorklassifikation med diagnostiska potential och mätning av biomarkörer i flytande biopsier, vilka skulle möjliggöra bättre patientbehandling och sjukdom övervakning. Kvantitativ mätning av biomarkörer i arkivmaterial är dessutom användbar i onkologi forskning med tillgång till bibliotek av kliniskt annotated material, där retrospektiva studier kan validera potentiella biomarkörer och deras kliniska resultat korrelation.
Optimering av RNA baserat analyser med hjälp av formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) arkivmaterial är utmanande beror på variabiliteten hos kirurgiska vävnad behandling och nedbrytning av RNA som orsakas av formalin används för vävnad integritet bevarande1, 2. För att övervinna begränsning av utför korrekt gen uttryck studier från arkivmaterial, används vår grupp bDNA multiplex magnetiska pärla analysen. I stället för enzymatisk amplifiering av en mål-mall använder bDNA tekniken hybridisering av särskilda sonder och förstärkning av en reporter signal3. Den korta erkännande sekvenser av avskiljning och upptäckt sonderna är utformade för att hybridisera till korta fragment av målet RNA4. Dessutom, övervinner användning av vävnad homogenates som direkt utgångsmaterial i denna analys, oundvikliga förlusten av RNA som resultat från analyser som kräver föregående RNA-extraktion och rening. Signalen förstärkning, användning av kort erkännande sekvenser och uteslutandet av en reningssteg, bidra till att minska i teknisk variation av analysen. Tekniken ger möjlighet att multiplex analysen (upp till 80 RNA mål) och mäta uttrycket av en panel av mål från låga material ingång. Det här protokollet beskriver beredning och färgning av vävnadsprover för laser lokalt. Färgning i membran bilderna underlätta bildtagning av tumör och histologiska arkitekturen att tillhandahålla korrekt urval och profilering av: (1) tumör och normala kanaler i bröstvävnad, och (2) maligna cellen kloner inom heterogen tumörer.
Molekylära klassifikationen av bröstcancer är en process som förhör molekylära markörer för att kategorisera patientens tumörer i tre Molekylär klasser, dvs, luminala, human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2)-berikad, och basala subtyp. Undertypen HER2-berikad är väldefinierade, med högt uttryck av HER2-receptorn, på grund av ERBB2 genen förstärkning, kombinerat med låg eller frånvarande östrogenreceptor (ER)- och progesteronreceptor (PgR). Luminala undertypen är allmänt positivt för ER och basala undertypen är i allmänt negativa för tre receptorer (HER2, ER, PgR) och betydligt överlappningar med trippel negativ bröstcancer cancer (TNBC) diagnostiska undertyp5,6. Andra markörer används för att bestämma epitelial och mesenkymala egenskaper. Fibronektin (FN1) är en huvudkomponent i bröst vävnad mesenkymala facket. Ökat FN1 uttryck åtföljs av högt Ki67 färgning, och visar en signatur för en mer invasiv tumör7,8 och är associerad med metastaser9. Intressant, befanns FN1 vara närvarande i microvesicles med ursprung från tumörcellerna, som inducerad aktivering av mitogena signaler i mottagarens fibroblaster10. Därför cirkulerar microvesicles såsom exosomes är potentiella markör för tidig upptäckt eller metastas och återfall11.
Tumör areal utväljande för bröstcancer cancer transkriptionell subtypning har återkommande utförts av macrodissection12,13. För att övervinna vävnad heterogenitet och öka känsligheten, har vi tillförlitligt kombinerat klassisk vävnad färgning med multiplex molekylär profilering metoder. Som ett bevis på principen, har två distinkta breast cancer kloner definierats av deras epitelial mesenkymala signatur och metastatisk potential. Arbetsflödet för protokollet beskrivs kan lätt översättas till den nuvarande kliniska setup och används för att selektivt isolera och karakterisera vävnad subtyper med riktade mRNA profilering.
En pärla-baserade multiplex bDNA assay var optimerad för att kvantifiera genuttryck på försämrade RNA härrör från FFPE cancer bröstvävnad och normala bröstet kanaler. Optimera analysen, normalisera inblandade utveckla en algoritm för att klassificera bröstcancer tumörer i luminala och basala subtyper utnyttja 8 kända biomarkörer och 5 potentiella gener. Datanormalisering skedde med hjälp av permutationer av generna som normaliserande. Urvalet av normaliserande generna på bästa förutsägelse av receptor status med hjälp av Luminal/basala klassificerare generna. För att klassificera Luminal/basala subtyper från FFPE-vävnad, var normaliserande generna valt Beta-aktin (ACTB), glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) och hypoxantin Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Metoden kan anpassas för användning i andra diagnostiska och forskningsområden efter lämpligt urval av den normaliserande gen-uppsättningen. En viktig tillämpning av denna metod på forskningsområdet är mätning av biomarkörer i arkivmaterial som är väl kommenterad med kliniska resultat. Detta kunde validera potentiella prediktiva markörer i retrospektiva studier, snabbt och korrekt och undvika långsiktiga framtidsstudier väntar på Sjukdomsfri överlevnad och total överlevnadsdata. Vår grupp är för närvarande undersöker användningen av analysen att upptäcka hormonreceptor-positiv exosomes, som kräver utveckling av en ny algoritm använder alternativa normalisera gener för datanormalisering. Användningen av flytande biopsier och robust gen uttryck analyser kan hög genomströmning multiplex analyser anpassad för patienthantering under behandling och tillhandahålla ett sätt att följa behandlingseffekt, potentiella återfall på grund av resistens mot behandling, och metastaserande kapacitet av tumören.
Denna metod har ett brett utbud av möjliga tillämpningar för diagnos av tumörer och är anpassad till det aktuella diagnostiska arbetsflödet. De främsta fördelarna med denna metod i fältet diagnostiska inkluderar: (1) genomförandet av hög genomströmning analyser, (2) exklusive subjektivitet och tvetydiga resultat med ursprung från image-baserad mätningar, (3) korrekt upptäckt av flera mål samtidigt som förbättra noggrannhet och minimera användningen av dyrbara patientprover och (4) inget krav för högt specialiserad utrustning och mänskliga resurser. Optimal provtagning processen, tillsammans med låg tillförsel av material som krävs för den pärla-baserade multiplex assay, tillåter ytterligare utredning av tumör heterogenitet; genom att noggrant skilja flera foci av malign vävnad från samma patient avsnitt med laser lokalt, är det möjligt att jämföra flera genuttryck mellan dem samt med matchade normal vävnad (figur 4). Låg materialinsatsen är avgörande för diagnostiska program på tumör biopsier som ger begränsad tumörvävnad. Analysens kapacitet att mäta genuttryck från försämrade RNA-prover tillåter enkel transport av prover för analys inom en institution eller till underhåll laboratorier. Hela avsnitt analys var dessutom också möjligt med H & E färgade material (figur 1).
För att lyckas med detta protokoll, är det viktigt att: (1) säkerställa korrekt provtagning av tumören webbplats/s som är lyserat för analysen och (2) utvecklas väl optimerad och validerade data normalisering algoritmer, för varje gen uttryck panel eller enskilda prognostiska eller Prediktiva biomarkörer. Den förstnämnda beror på den tekniska erfarenheten av tekniker/forskaren utför provtagning. Det rekommenderas att ta en ytterligare kärna och förbereda en tissue microarray (TMA) i samma format multiplex magnetiska pärla analysens (96 brunnar-format). Detta ger ett arkiv av tumör platser som en replik av prover som används för RNA-baserade analysen. TMAs kan också bedömas med andra metoder för uppföljande forskning eller validering av resultat. Utveckling av normalisering algoritmer är beroende på materialet som utreds och normaliserande generna valts för normalisering. Olika paneler i normalisera gener är utvalda utifrån nivå och variation av uttryck i de prov som analyseras och detta varierar mellan cancer vävnader från olika ursprung, exosomes från plasma eller cirkulerande tumörceller. Validering av analysen innehåller provet bearbetning eftersom olika preparat kommer också att resultera i olika normalisering algoritmer.
För att sammanfatta, bDNA teknik i kombination med magnetiska pärla teknik och val av korrekt panelen av målgener, ger den extra fördelen av att mäta genuttryck direkt i vävnad lysates härrör från små mängder patientmaterial, inklusive microdissected material, exosomes och cirkulerande tumörceller. Förutom identifiering av tumör heterogenitet har korrekt användning av paneler potential att upptäcka tumören härrör exosomes för tidig diagnostik och tidig upptäckt av skov. Eftersom det finns ingen anledning för ett steg för amplifiering av nukleinsyra, signal förstärkning med bDNA teknik, kombinerat med den pärla-baserade multiplex, mäter flera genuttryck i kliniskt-annotated arkivmaterial och ge en resurs för biomarkör validering.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av (1) bröst Cancer projektet stipendium (2014 – 2016) finansieras av åtgärden för Breast Cancer Foundation och ALIVE 2013 genom forskning, Innovation & Development Trust (Temaauktionen) av Maltas universitet, (2) medicinska fakulteten & Kirurgi, Maltas universitet och (3) projektet ACT finansieras av Malta rådet för vetenskap och teknik genom FUSION: The R & I teknik utveckling för 2016. Publiceringen av detta manuskript stöds genom Jove-Luminex beviljandet.
Microtome | Leica | RM2235 | |
Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit – FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
Sonicator | Silvercrest | ||
RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |