Summary
Nükleik asit bozulması arşivleme doku, tümör heterojenite ve taze donmuş doku örnekleri eksikliği kanser tanı Hizmetleri dünya çapında patoloji laboratuarlarında olumsuz etkileyebilir. Bu el yazması meme kanserlerinin sınıflandırmak için bir multiplex manyetik boncuk tahlil kullanarak biyolojik bir panel optimizasyonu açıklar.
Abstract
Nükleik asit bozulması arşivleme doku, tümör heterojenite ve taze donmuş doku örnekleri eksikliği kanser tanı Hizmetleri dünya çapında patoloji laboratuarlarında olumsuz etkileyebilir. Gene amplifikasyon ve arşivleme malzeme veya laboratuvarları, hizmet için ulaşım gerektirir malzeme kullanarak test tanı ifade geçerli klinik iş akışları için uyarlanmış bir daha sağlam ve doğru test ihtiyacı vardır. Araştırma ekibimiz Invitrogen™ QuantiGene™ Plex tahlil (Thermo Fisher RNA arşivleme malzeme Luminex xMAP® manyetik boncuklar dallı DNA (bDNA) teknolojisini kullanarak ölçmek için bilimsel) kullanımını en iyi duruma getirilmiş. Bu el yazması açıklanan gen ifade tahlil yorumlama teknikleri Imaging'de doğasında öznellik atlama moleküler alt türlerinden farklı içine meme kanseri doğru bir şekilde sınıflandırmak bir roman, hızlı ve çok katmanlı yöntemidir. Buna ek olarak, düşük giriş gerekli malzeme nedeniyle türdeş olmayan tümörler hematoksilen kullanarak lazer microdissected olabilir ve eozin (H & E) bölümleri lekeli. Bu yöntem olası uygulamaları tümör sınıflandırma tanılama potansiyeli ve biyolojik ölçümü ile daha iyi hasta yönetimi ve hastalık kontrolü sağlayacak sıvı biyopsi dahil olmak üzere geniş bir yelpazesi vardır. Buna ek olarak, biyolojik arşivleme malzeme nicel ölçüm Onkoloji araştırma klinik olarak açıklamalı malzeme retrospektif çalışmalar potansiyel biyolojik ve onların klinik sonuç doğrulamak için kitaplıklarına erişim ile yararlıdır korelasyon.
Introduction
Arşivleme formalin sabit parafin gömülü (FFPE) malzeme kullanımına dayalı RNA deneyleri duruma getirilmesi cerrahi doku işleme ve doku bütünlüğü koruma1içinkullanılan formalin neden RNA'ın yıkımı değişkenlik nedeniyle zordur, 2. Arşiv malzemesinden doğru gen ifade çalışmaları gerçekleştirme sınırlamayı aşmak için bDNA multiplex manyetik boncuk tahlil grubumuza kullanılır. Bir hedef şablonu enzimatik amplifikasyon yerine belirli probları hibridizasyon ve bir muhabir sinyal3amplifikasyon bDNA teknolojisini kullanır. Yakalama ve algılama probları kısa tanıma dizisi hedef RNA4kısa parçaları melezlemek için tasarlanmıştır. Buna ek olarak, bu tahlil doğrudan Başlangıç materyali olarak doku homogenates kullanımı gerektiren önceki RNA çıkarma ve arıtma deneyleri sonuçları RNA kaçınılmaz kaybı üstesinden gelir. Sinyal güçlendirme, kısa tanıma dizileri kullanımı ve arıtma adım dışlanması testin teknik değişim azaltın katkıda bulunur. Teknoloji tahlil (80 RNA hedef) multiplex ve düşük malzeme giriş hedeflerden oluşan bir panel ifade ölçmek imkanı sağlar. Bu iletişim kuralı hazırlık ve lazer mikrodiseksiyon için doku örnekleri boyama açıklar. Membran slaytlarda boyama kolaylaştırmak, tümör ve histolojik mimari doğru seçim sağlamak için görüntüleme ve profilleme: (1 tümör ve meme dokusu içinde normal kanalları ve (2) içinde türdeş olmayan tümörler malign Hücre klonlar.
Meme kanseri moleküler sınıflandırma hasta Tümörleri (HER2) üç moleküler sınıfları, yani, luminal, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 kategorilere ayırmak için moleküler işaretleyiciler SorguladıSARAYBOSNA bir işlem olup-zenginleştirilmiş ve bazal alt türü. HER2 zenginleştirilmiş alt türü de düşük yok veya östrojen reseptör (ER) ve progesteron reseptör (PgR) ile birlikte ERBB2 gene amplifikasyon nedeniyle HER2 reseptör yüksek ifade ile tanımlanmıştır. Luminal alt türü genellikle olumlu içindir üç reseptörleri (HER2, ER, PgR) ve önemli ölçüde örtüştüğü Üçlü negatif meme kanseri (TNBC) tanı alt tür5,6için genel negatif ER ve bazal alt türü bulunmaktadır. Diğer işaretleri epitelyal ve mezenkimal özelliklerini belirlemek için kullanılır. Fibronektin (FN1), meme dokusu mezenkimal bölmesi ana bileşenidir. Artan FN1 ifade tarafından yüksek Ki67 eşliğinde boyama ve bir daha invaziv tümör7,8 için bir imza gösterir ve metastaz9ile ilişkilidir. İlginçtir, FN1 harekete geçirmek-in alıcı fibroblastlar10mitogenic sinyalleri indüklenen tümör hücreleri kaynaklanan microvesicles bulunması için bulundu. Bu nedenle, öyle aynı derecede exosomes bir potansiyel işareti erken teşhis ya da metastaz vardır ve11nüks microvesicles dolaşan.
Tümör alan seçimi için meme kanseri transkripsiyon subtyping yerleştirilmiştir macrodissection12,13tarafından yapılmıştır. Doku heterojenite üstesinden gelmek ve duyarlılığı artırmak için biz güvenilir bir şekilde klasik doku multiplex moleküler profil oluşturma yöntemleri ile boyama birleştirdik. İlke kanıtı olarak iki ayrı meme kanseri klon epitel mezenkimal imza ve metastatik potansiyel tarafından tanımlanmış. İş akışını açıklanan protokol ve kolayca geçerli klinik kurulumu için tercüme ve seçmeli olarak ayırmak ve hedeflenen mRNA profil oluşturma kullanarak doku alt türlerini tanımlamak için kullanılan.
Protocol
Bu çalışmada meme dokusu malzemenin kullanım için etik onay Üniversitesi Araştırma Etik Komitesi (UREC üzerinden) Malta Üniversitesi elde edilen (Ref: 22/2012).
1. doku hazırlık
- Uygun H & E yordamlar14kullanarak, lekeli başvuru doku bölümleri hazırlamak ve dijital olarak slaytlar için başvuru sırasında mikrodiseksiyon inceden inceye gözden geçirmek.
- Bir microtome kullanarak yarma 20 µm doku üzerine 40 ° C'de RNAse free bir su banyosu Temiz, RNase dekontamine ekipman ve malzeme kullanarak lazer mikrodiseksiyon için membran slaytlardaki bölümler toplamak.
- Membran slaytlar bir kurutma kuluçka 37 ° C'de gecede kuru. Moleküler biyoloji sınıf çözümlerle15 uygun H & E yordamı kullanarak ve Hematoksilen boyama zamanı 6 dk ile artan leke. Gerekirse, uygun immunohistokimyasal protokolleri16membran slaytlarla leke.
2. lazer mikrodiseksiyon
- Slayt sınırları ayarlamak ve sahne hareket kalibre.
- Lazer görünümü bir membran slayda boş bir alanı taşıyın. Lazer odak odak aralıkları (% 5) membran delmek lazer başlayana kadar artırmaya vurdu bir lazer kovarak kalibre. Beraberlik ve microdissect herhangi bir şekil ve finetune lazer diseksiyon sırasında lazer verimliliği maksimize etmek için lazer odak.
- Nerede lazer diseksiyon verimliliği uzlaşma bir noktaya sahne hareket hızını artırın. Seçili objektif lens, lazer kalibre ve hedefleri (lazer hız 1-%15), % 70-75 odak ve güç % 90-100 4 X objektif kullanırken değişen Eğer yeniden kalibre.
- 4 X amacı istimal lekeli membran slaytları tarama.
- Seçin ve membran slayda mikrodiseksiyon için hedef alanları sarmak. Lazer teşrih 42 mm2en az bir alan. Kayıt alanı örnek homojenizasyon arabellek kullanılacak hacmi belirlemek için kesmiştim.
- Cap Asansör mekanizması etiketli tüpler için uygun apendiks bağlı disseke bölümünü difüzör kapaklar üzerine almak için kullanın. Disseke bölüm kap alınmaz, çevrenin lazer diseksiyon işlemini yineleyin.
3. doku lizis
Not: Birkaç çözümleri ve malzemeler Malzemeler tablobelirtilen kitleri ile birlikte verilir.
- Bir 60:1 oranında homojenizasyon çözüm ve İndinavir K kullanarak örnek lizis için gerekli homojenizasyon karışımı cilt hazırlayın.
- Doku alan, girdap 10 için her 1 mm2 için her tüpün içine çözüm homojenizasyon 2.4 µL pipet s maksimum hız ve 5 için oda sıcaklığında santrifüj 2500 x g s.
- 600 devir / dakikada sallayarak ile Isıtma blok 12-18 h için 65 ° C'de kuluçkaya.
- 21.000 x g oda sıcaklığında 5 min için de lysates santrifüj kapasitesi.
- Bir pipet kullanarak, dikkatle net süpernatant Aspire edin ve etiketli bir taze tüp içine dağıtmak. Bu sonuçlar kalitesini azaltabilir gibi doku/membran parçaları aspirating kaçının.
- Açık süpernatant-80 ° C dondurucuda saklayın.
4. hibridizasyon tabanlı tahlil
- Aşağıdaki hazırlıkların gerçekleştirin.
- Lizis karışımı bir kuluçka 37 ° C'de 30 dk için reaktif şişe koyarak önceden sıcak ve karışımı yavaşça INVERSION tarafından.
- Doku homogenates dondu, oda sıcaklığında erimek ve 30 dk. girdap 37 ° C'de maksimum hızda kuluçka takip örnekleri kuluçkaya.
- Titreyen kuluçka 54 ° C'de ayarla ve sıcaklık doğrulama seti probe bir 96-şey plaka boş bir kuyuya yerleştirin. 2 h sonra dijital termometre sıcaklık kontrol ve herhangi bir sıcaklık farkı için düzeltmek için kuluçka sallayarak delta sıcaklığı ayarlayın.
- Tezcan ve girdap ayarla ve reaktif 10 için engelleme sonda s, 5 oda sıcaklığında santrifüj s 2500 x g ve buz üzerinde tutun.
- Kullanım sırasında İndinavir K şişe buz üzerinde tutun.
- 46 kHz yakalama boncuk 3 dk, sonra girdap başka bir 3 min için maksimum hızda için solüsyon içeren temizleyicide.
- Buna göre aşağıdaki reaktifleri ölçekleme tarafından iyi başına 25 µL çalışma boncuk karışımı hazırlayın: nükleaz ücretsiz su, 16.65 µL lizis karışımı, engelleme reaktif, İndinavir k 0.10 µL, 0.50 µL yakalama boncuk, sonda kümesinin 2.50 µL 1.00 µL 4.25 µL.
- Girdap 10 için çalışma boncuk karışımı s maksimum hızda sonra pipet 25 µL/iyi manyetik ayırma plaka.
- Pipet 25 µL doku homogenate manyetik ayırma 96-şey plaka ve 25 için eriyik-e doğru boşlukları olarak 3 kuyu homojenizasyon µL.
- Şeffaf plastik baskı mühür kullanarak manyetik ayırma plaka mühür ve 600 devir / dakikada sallayarak süre 54 ± 1 ° C, kuluçka 18 – 22 h için plaka yer.
- Bileşen 1 ve 1.67 mL yıkama arabelleği bileşenin 2 RNase free 31,5 mL su yıkama ile 0.1 mL karıştırma tarafından 24 kuyu tampon 1 yıkama arabellek çözüm X hazırlamak.
- Plaka kuluçka kaldırın. Titreyen kuluçka makinesi sıcaklığı ayarlamak için 50 ± 1 ° c
- Manyetik ayırma plaka el Manyetik plaka contalara dağ ve yerine kilitlemek. Basınç mührü kaldır ve yerleşmek manyetik boncuklar için 1 dakika bekleyin.
- Çamaşır adım: plaka lavabo ve leke üzerinde hafifçe bir doku kağıt üzerinde kalıntı çözüm kaldırmak için monte manyetik ayırma plaka tersine çevirin. Bir çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 1 yıkama arabellek çözüm X 100 µL ekleyin ve bekleyin 15 s. plaka 3 kere yıkamak için bu adımı yineleyin.
- Her şey için ön amplifikatör reaktif 50 µL pipet. Plaka ile bir alüminyum plaka mühür mühür ve 1 dakika oda sıcaklığında 800 rpm'de plaka sallamak. 50 ± 1 ° C, 1 h için 600 devir / dakikada sallayarak süre kuluçkaya.
- 4,9 (çamaşır adım) arasındaki adımları yineleyin.
- Her şey için amplifikatör reaktif 50 µL pipet. Bir alüminyum plaka mühür ile plaka mühür ve plaka adım 4,10 olduğu gibi salla.
- 4,9 (çamaşır adım) arasındaki adımları yineleyin.
- Girdap 10 etiket prob s maksimum hızda. Etiket inceleyebilirsek 50 µL her şey için ekleyin. Mühür ve plaka (adım 4.10) sallamak.
- Adım (adım yıkama) 4,9 yineleyin.
- Girdap 10 Streptavidin phycoerythrin (SAPE) maksimum hızda s. SAPE 50 µL her şey için ekleyin. Mühür ve plaka (adım 4.10) sallamak.
- Kullanım SAPE yıkama arabellek yıkama arabellek çözüm yerine dışında adım 4,9 (çamaşır adım) yineleyin.
- SAPE yıkama arabelleği 130 µL bir alüminyum plaka mühür ile her şey ve mühür plaka ekleyin. 3 dakika oda sıcaklığında 800 rpm'de plaka sallamak.
- Başlangıç manyetik boncuk Çözümleyicisi. Üreticinin yönergelerini izleyerek kalibrasyon ve doğrulama yordamı gerçekleştirin.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak manyetik boncuk analyzer bir iletişim kuralını ayarlayın: örnek boyutu: 100 µL; DD kapısı: 5.000-25.000; Zaman aşımı: 90 s; Boncuk olay/boncuk bölge: 100; ve ileri'yi tıklatın. İlgili boncuk numaraları panelinde seçin ve üretici tarafından belirtildiği gibi ilgili hedef genleri olan boncuk bölgeleri tanımlamak.
- Yeni bir analiz toplu işlemleri sekmesinden "oluşturmak toplu kullandığınız varolan bir protokol" seçerek ekleyin. Plaka düzen kuyuları Bilinmeyen veya boş, sırasıyla atayın ve örnekleri panelinde her örnek için bir etiket sağlar.
- Alüminyum plaka mühür 96-iyi tepki plaka kaldırın. Yanında tıkırtı üstünde belgili tanımlık dışarı atmak düğme tabak Tepsi dışarı atmak, plaka manyetik boncuk çözümleyicisine yük. Geri çek' i tıklatın | Belgili tanımlık çözümlemek başlatmak için Toplu iş çalıştırın . Okuma sonra dışarı atmak ve 96-şey plaka kaldırın. Temiz ve üretici tarafından önerilen gibi manyetik boncuk analyzer kapa.
5. veri analizi
- Toplu iş| Sonuçları sekmesini, anılan sıraya göre analiz dosyayı seçin ve to.csv dışa aktar düğmesini tıklatın. Bir elektronik tablo yazılımı kullanarak açık the.csv dosyasını.
- Boncuk sayar gözlemlemek ve herhangi bir sonuç ile < 40 boncuk/bölge atlayabilirsiniz.
- Boş kuyu değerleri dışarıda ortalama ve standart sapma (SD) ve algılama sınırı (LOD) (boş ortalama + (3xSD)) hedef gen başına. LOD daha düşük olarak algılanmayan küme değerleri.
Not: herhangi normalize ifade değerleri tespit edilmemiş ise, örnek veriler yetersiz olarak görür. İfade değerleri üzerinde 20.000 olarak üst duyarlılık sınırın üzerinde düşünün. Bu örneklerin lysates seyreltilmiş ve yeniden analiz. - Ham veri gen başı boş ortalama çıkarma.
- Seçili normalize genler örnek başına geometrik ortalamasını hesaplamak için. İlgili geometrik ortalama tek tek örnek verileri normalleştirmek.
- Veri bilim platformlarında veri çözümlemek veya algoritmaları kullanılarak tanımlanmış.
- Veri veri bilim platformu Veri Ekletıklatarak. Veri dosyası İşlemi çalışma alanına sürükleyin ve [Öznitelikleri Seç] operatöre bağlanın bir asıl bileşen analizi (PCA) operatör ve sonra result bağlantı noktası için.
- Seçin öznitelik işleci normalleştirilmiş gen veri alt kümesini ve meme kanseri alt türü gibi bir nominal değişkeni seçin. Oyuntıklayarak işlemini çalıştırın. Grafik sekmesinde "3D renkli dağılım" grafik tarzı ve nominal değişken renk alanında seçin. 3 boyutlu bir arsa üzerinde PCA veri değişkenliği değerlendirmek.
Representative Results
H & E (Şekil 1) lekeli 40 transkript eşzamanlı ölçümü için açıklanan yöntemi uygulanmış, microdissected (Şekil 2) son derece FFPE malzeme bozulmuş. Bu yöntemi kullanarak, biz reseptör durumu (Şekil 3A), tümör luminal ve bazal moleküler alt türlerinden17içine sınıflandırılması ve mezenkimal işaretin, FN1, fark ifade doğru karakterizasyonu tümör karşılaştırırken göster ve eşleşen denetim doku (Şekil 3B), çeşitli reseptör pozitif ve negatif alt türlerinden.
Şekil 1: gen ekspresyonu H & E kullanarak malzeme lekeli. Lekeli tümör bölümü ile karşılaştırıldığında bir günahı tümör bölümünden elde edilen bir ifade profil arasında korelasyon. [Pearson korelasyon p-değeri 5.34E =-26]. İzin17ile çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: lazer mikrodiseksiyon FFPE dokuların. (A) H & E lekeli slayt; (B) immunohistokimyasal; ER ifade için boyama (C) HER2 immunohistokimyasal boyama; (D) günahı 20 µm bölümünü lazer mikrodiseksiyon membran slaytlarda. Sarı ok açıkça nedeniyle boyama olmaması için kesin değil invaziv tümör bir alanı gösterir. (E) A 20 µm kısmı ile H & E ilgi alanları daha iyi tarif için lekeli. Kırmızı ok diseksiyon sırasında lazer odak gösterirken beyaz okları Lazer diseksiyon iz gösterir. Tüm resimler 10 x büyütme oranında ele geçirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: (A) reseptör durumu ve (B) mezenkimal işaretleyicisinde FN1, meme tümör karşılaştırıldığında ifadesi eşleşen normal. Klasik tanı meme kanseri alt türlerinden HER2 belirsiz İmmunohistokimyasal boyama için immünhistokimya ve floresans in situ hibridizasyon (balık) kullanarak tanılama sonucu göre tanımlanır. (A)HER2 ve ER, (B) FN1 hibridizasyon tabanlı tahlil tarafından ölçülen normalleştirilmiş ifade HER2 pozitif, pozitif ER ve TNBC durumlarda hastaya göre normal meme dokusu eşleşen gösterilmektedir. Kruskal Wallis Test İstatistiği (K-W χ2) HER2 ifade anlamlı olduğunu göstermektedir (p < 0,05) eşleşen normal doku HER2 olumlu kohort aksine tümör dokusunda daha yüksek ve daha düşük TNBC kohort. ER ifade ER pozitif ve TNBC birlik eşleşen normal aksine tümör dokusunda daha yüksek bulundu. FN1 HER2 ve ER pozitif alt türlerinden tümör dokusunda içinde önemli ölçüde daha yüksektir ve önemli ölçüde tümör dokusunda TNBC kohort da yükselmiş doğru bir eğilim gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: örnek çalışma: tümör heterojenite. Morfolojik ayrı tümörler microdissected vardı ve farklı örnek olarak tedavi. H & E bölümünün (A) asıl tarama. (B, C) 10 x ve sırasıyla her tümör morfoloji tespit için 40 x büyütme. (D) immunohistokimyasal ER için 10 x büyütme oranında boyama. (E) immunohistokimyasal Ki67 için daha yüksek mitotik aktivite gösteren tümör 1 10 x büyütme, boyama. (F) ifade düzeyleri immunohistokimyasal sonucu beklendiği gibi nispeten yüksek ve eşit ifade tümörler arasında gösterilen her tümör ESR1 gen için normalleştirilmiş. (G) ifade düzeyde nerede artan FN1 ifade tarafından yüksek Ki67 eşliğinde FN1, mezenkimal bir işaretleyici normalleştirilmiş bir imza daha invaziv bir tümör için gösterilen boyama. Tersini azaltılmış FN1 ifade tarafından temsil edilen daha düşük bir malign potansiyeli ile daha yavaş Proliferasyona tümör gibi görünüyor tümör 2, gözlemlenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bir çok katmanlı bDNA boncuk tabanlı tahlil gen ekspresyonu bozulmuş RNA FFPE meme kanser dokusu ve normal meme kanalları elde üzerinde ölçmek için optimize edildi. Tahlil en iyi duruma getirme, işin içinde meme kanser tümörleri luminal ve bazal alt türlerini kullanmak 8 iyi bilinen biyolojik ve 5 potansiyel olarak sınıflandırmak için bir algoritma geliştirme genler normale. Veri normalleştirme yapıldı permütasyon normalize genlerin kullanarak. Normalize genlerin seçimi Luminal/bazal Sınıflandırıcısı genleri kullanarak reseptör durumunu en iyi tahminini dayanıyordu. Luminal/bazal alt türlerinden FFPE dokulara gelen sınıflandırmak için seçili normalize genler Beta-aktin (ACTB), gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) ve Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) idi.
Yöntem diğer tanılama kullanımda ve araştırma alanlarına normalize gen kümesinin yeterli seçimi takip için adapte edilebilir. Bir önemli araştırma sektöründe bu yöntemin biyolojik ölçümü de klinik sonuçlar ile açıklamalı arşivleme malzeme uygulamasıdır. Bu retrospektif çalışmalarında potansiyel akıllı işaretler hızlı ve doğru doğrulamak ve hastalıksız sağkalım ve genel sağkalım verileri bekleyen uzun vadeli prospektif çalışmalar kaçının. Şu anda bizim grup yeni bir algoritma kullanarak veri normalleştirme için gen normalize alternatif geliştirme gerektirir reseptör pozitif exosomes algılamak için tahlil kullanımını araştırmaktadır. Sıvı biyopsi ve sağlam gen ifade deneyleri kullanımı yüksek işlem hacmi çok katmanlı deneyleri tedavi sırasında hasta yönetimi için uyarlanmış izin ve tedavi etkinliği, terapi, direnç nedeniyle olası nüks takip etmek için bir yol sağlar ve metastatik tümör kapasitesi.
Bu yöntem aynı zamanda tümör tanısında olası uygulamaları geniş bir alanı vardır ve geçerli tanılama iş akışı için uyarlanmış. Bu yöntemde tanı alan ana avantajları şunlardır: (1) uygulanması (2) hariç öznellik ve belirsiz sonuçları görüntü tabanlı ölçümleri kaynaklanan yüksek işlem hacmi deneyleri, birden çok hedef (3) doğru algılama aynı anda, hangi doğruluk geliştirmek ve çok özel imkanlar ve insan kaynakları için bir gereksinim değerli hasta numuneleri ve (4) kullanımını en aza indirmek. Düşük giriş boncuk tabanlı multiplex tayini için gerekli malzeme ile birlikte en iyi duruma getirilmiş örnekleme işlemi daha fazla tümör heterojenite incelenmesi sağlar; Lazer mikrodiseksiyon doğru birden çok resimde aynı hasta bölümünden malign doku ayırarak, birden çok gen ekspresyonu arasında onları yanı sıra eşleşen normal doku (Şekil 4) ile karşılaştırmak mümkündür. Düşük malzeme giriş sınırlı tümör doku sağlamak tümör biyopsi üzerinde tanılama uygulaması için hayati önem taşımaktadır. Gen ifadesinin bozulmuş RNA örneklerinden ölçmek için tahlil kapasitesini numunelerin Analizi bir kurum içinde veya laboratuvar hizmet için kolay ulaşım sağlar. Buna ek olarak, Bölüm Analizi da H & E malzeme (Şekil 1) lekeli kullanarak mümkün oldu.
Bu iletişim kuralı başarı için bunun için zorunludur: (1) uygun örnekleme tümör sitesi/s tahlil için lysed ve geliştirmek (2) de en iyi duruma getirilmiş ve her gen ifade paneli ve/veya bireysel prognostik veri normalleştirme algoritmaları doğrulanmış olun veya akıllı biyolojik. Eski örnekleme gerçekleştirme teknisyen/bilim teknik deneyime bağlıdır. Bu ek bir çekirdek al ve bir doku Mikroarray (TMA) multiplex manyetik boncuk tahlil (96-şey biçimi) aynı biçimde hazırlamak için tavsiye edilir. Bu örneklerin RNA tabanlı tahlil için kullanılan çoğaltma olarak tümör sitelerin bir arşiv sağlayacaktır. Ayarlayınca da takip araştırma veya doğrulama sonuçlarının diğer teknikleri ile tespit edilebilir. Normalleştirme algoritma geliştirme soruşturuluyor malzeme ve normalleştirme için seçili normalize genler bağlıdır. Genler normalize farklı paneller düzeyi ve ifade içinde analiz örnek değişkenliği göre seçilir ve bu farklı kökenleri dokulardan kanser, plazma veya tümör hücreleri dolaşan exosomes arasında değişir. Testin doğrulama çeşitli hazırlıklar da farklı normalleştirme algoritmaları neden olur bu yana örnek işleme içerir.
BDNA teknoloji manyetik boncuk teknoloji ile birlikte kullanımı ve uygun panelinin hedef genlerin seçimi özetlemek doğrudan küçük miktarlarda türetilmiş doku lysates gen ifadesinde ölçme ek fayda sağlayacaktır microdissected malzeme, exosomes de dahil olmak üzere ve tümör hücreleri dolaşan hasta bir malzeme. Tümör heterojenite tespiti yanı sıra, paneller doğru kullanımı erken teşhis ve erken çabaladıkça tespiti için türetilmiş tümör exosomes tespit potansiyeline sahiptir. Bir nükleik asit amplifikasyon adım gerek yok olduğundan, boncuk tabanlı multiplex ile kombine bDNA teknolojisini kullanarak sinyal güçlendirme birden çok gen ekspresyonu arşivleme malzeme klinik olarak açıklamalı ölçü ve sağlamak için bir kaynak biyomarker doğrulama.
Disclosures
Invitrogen™ QuantiGene™ Plex tahlil Thermo Fisher bilimsel tescilli.
Acknowledgments
Çalışmaları (1) meme kanseri proje göğüs kanseri Vakfı ve araştırma, yenilik ve geliştirme güven (RIDT) (2) Tıp Fakültesi Malta Üniversitesi ile ALIVE 2013 için hareket tarafından finanse edilen burs (2014-2016) tarafından desteklenmiştir & Cerrahi, Malta Üniversitesi ve (3) proje için bilim ve teknoloji füzyon yoluyla Malta Konseyi tarafından finanse Yasası: R & ı teknoloji geliştirme programı 2016. Bu makale yayın desteklenir Jüpiter-Luminex hibe yoluyla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
| Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
| Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
| Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
| ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
| HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
| Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
| Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
| Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
| mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
| mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
| Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
| mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
| 1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
| 96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
| Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
| LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
| Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
| Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
| Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
| Sonicator | Silvercrest | ||
| RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
| Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
| RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
| Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |
References
- Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
- Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
- Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
- Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
- Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
- Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).
- Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
- Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
- Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
- Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
- Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
- Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
- Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from: http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus (2018).
- Lin, F., Prichard, J. Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).
