Summary
핵 산 저하 보관 조직, 종양이, 그리고 신선한 냉동된 조직 표본의 부족 병 리 실험실 전세계에 암 진단 서비스를 저하 수 있습니다. 이 원고 멀티플렉스 마그네틱 비드 분석 결과 사용 하 여 유방암을 분류 하는 마커의 패널의 최적화를 설명 합니다.
Abstract
핵 산 저하 보관 조직, 종양이, 그리고 신선한 냉동된 조직 표본의 부족 병 리 실험실 전세계에 암 진단 서비스를 저하 수 있습니다. 유전자 증폭 및 아카이브 자료 또는 교통 연구실, 서비스를 요구 하는 자료를 사용 하 여 테스트 진단 식 보다 강력 하 고 정확한 시험 현재 임상을 적응 해야 합니다. 우리의 연구 팀 Invitrogen™ QuantiGene™ 플렉스 (열 피셔 과학) Luminex xMAP® 자석 구슬에 분기 DNA (bDNA) 기술을 사용 하 여 아카이브 자료에서 RNA를 계량 분석 결과 사용 하 여를 최적화 합니다. 이 원고에 설명 된 유전자 표정 분석 결과 정확 하 게 다른 분자 하위, 이미징 기술에 내재 된 해석의 주관 생략으로 유방암을 분류할 수는 소설, 빠르고 다중 방법입니다. 또한, 필요한 재료의 낮은 입력으로 인해 다른 유형의 종양 사용 되며 레이저 microdissected 수 하 고 오신 (H & E) 스테인드 섹션 키를 누릅니다. 이 방법은 더 나은 환자 관리 및 질병 모니터링 허용 액체 biopsies에 종양 분류 진단 잠재력 및 생체의 측정을 포함 하는 가능한 응용 프로그램의 넓은 범위를 하고있다. 아카이브 자료에 생체의 양적 측정 회고전 연구 잠재적인 biomarkers 및 그들의 임상 결과 확인할 수 있는 임상 주석 소재의 라이브러리에 액세스할 수 있는 종양학 연구에 유용 또한, 상관 관계입니다.
Introduction
아카이브 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 자료를 사용 하 여 RNA 기반 분석 실험의 최적화는 가변성 수술 조직 처리와 포 르 말린 조직 무결성 보존1, 사용에 의해 발생 하는 RNA의 저하에 따른 도전 2. 아카이브 자료에서 정확한 유전자 표현 연구 수행의 한계를 극복 하기 위해 우리의 그룹 bDNA 멀티플렉스 마그네틱 비드 분석 결과 사용 합니다. 대상 서식 파일의 효소 증폭, 대신 bDNA 기술은 특정 프로브의 교 잡 및 기자 신호3의 증폭을 사용합니다. 캡처 및 감지 프로브의 짧은 인식 시퀀스는 대상 RNA4의 짧은 조각에 교배 하도록 설계 되었습니다. 또한,이 분석 결과에서 직접 시작 물자로 조직 homogenates 사용 하 여 이전 RNA 추출 및 정화를 요구 하는 분석 실험의 결과 RNA의 불가 피한 손실을 극복. 신호 증폭, 짧은 인식 시퀀스의 사용과 정화 단계 배제 분석 결과의 기술 변화에 감소에 기여. 기술 분석 결과 (최대 80 RNA 대상) 다중화 및 낮은 자료 입력에서 대상의 패널의 식 측정 가능성을 제공 합니다. 이 프로토콜 준비 하 고 서 레이저에 대 한 조직 샘플의 얼룩에 대해 설명 합니다. 조직학 아키텍처 정확한 선택을 제공 하 고 종양의 이미징 및의 프로 파일링을 용이 하 게 막 슬라이드에 얼룩: 악성 세포를 다른 유형의 종양 내 복제 (1) 종양 및 유 방 조직에서 일반 덕트 및 (2).
유방암의 분자 분류는 환자의 종양 3 분자 클래스, 즉, luminal, 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)를 분류 하는 분자 마커를 심문 하는 과정-풍부한, 그리고 기저 하위. HER2 농축 하위 잘 정의 되어, 낮은 또는 에스트로겐 수용 체 (ER) 황 체 호르몬 수용 체 (PgR)에 결 석과 결합 ERBB2 유전자 증폭 때문에 HER2 수용 체의 높은 표현 이다. 3 수용 체 (HER2, 응급실, PgR), 그리고 크게 3 배 부정적인 유방암 암 (TNBC) 진단 하위5,6오버랩에 대 한 일반적인 부정에는 응급실과 기저 하위 luminal 하위 일반적으로 긍정적 이다. 다른 마커는 상피와 중간 엽 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다. Fibronectin (FN1) 유 방 조직 엽 구획의 주요 구성 요소입니다. 증가 FN1 식 높은 Ki67 동반 하는 얼룩, 그리고 더 침략 적인 종양7,8 에 대 한 시그니처 이며 전이9와 관련. 흥미롭게도, FN1 mitogenic 신호 받는 사람 fibroblasts10의 활성화를 유발 하는 종양 세포에서 발생 하는 microvesicles에 발견 되었다. 따라서,와 같은 exosomes 조기 발견 또는 전이의 잠재적인 마커는 재발11microvesicles를 순환.
유 방 암 transcriptional 동등에 대 한 종양 영역 선택 recurrently macrodissection12,13에 의해 수행 되었습니다. 조직이 극복 하 고 감도 증가, 우리는 안정적으로 클래식 조직 멀티플렉스 분자 프로 파일링 방법으로 얼룩을 결합 했습니다. 원리의 증거로 두 가지 유 방 암 클론 그들의 상피 엽 서명 및 전이성 잠재력에 의해 정의 되고있다. 설명된 프로토콜의 워크플로 쉽게 현재 임상 설정 번역 하 고 선택적으로 분리 하 고 타겟 mRNA 프로 파일링을 사용 하 여 조직 하위를 특성화 하는 데 사용 될 수 있습니다.
Protocol
이 연구에서 유 방 조직 자료의 사용에 대 한 윤리적인 승인을 얻은에서 대학 연구 윤리 위원회 (UREC) 몰타의 대학 (Ref: 22/2012).
1. 조직 준비
- 적절 한 H & E 절차14를 사용 하 여 조직 섹션 스테인드 참조를 준비 하 고 디지털 기정 동안 참조에 대 한 슬라이드를 스캔.
- 40 ° c.에 있는 RNAse 무료 물 탕에 20 µ m 조직 섹션을 잘라는 톰을 사용 하 여 깨끗 한, RNase 소독 장비 및 재료를 사용 하 여 레이저 기정에 대 한 막 슬라이드에 섹션을 수집 합니다.
- 하룻밤 건조 인큐베이터에서 37 ° C에서 막 슬라이드를 건조. 되며 착 시간 6 분을 증가 하 고 분자 생물학 학년 솔루션은 적절 한 H & E 절차15 를 사용 하 여 얼룩. 필요한 경우 적절 한 immunohistochemical 프로토콜16막 슬라이드 얼룩.
2. 레이저 기정
- 슬라이드 한계를 설정 하 고 단계 움직임 보정.
- 레이저 보기 막 슬라이드의 빈 영역으로 이동 합니다. 레이저는 세포 막을 통해 피어스 시작 때까지 초점 간격 (5%) 증가 레이저를 발사 하 여 레이저 초점 보정. 그리기 및 microdissect 어떤 모양 및 세부적 레이저 절 개 동안 레이저 효율을 극대화 하기 위해 레이저 초점.
- 레이저 절 개 효율 손상 되지 지점으로 무대 이동 속도 증가. 선택한 목표 렌즈에 레이저를 보정 하 고 다시 4 X 목표를 사용 하는 경우 (1-15%에서 레이저 속도), 70-75%, 포커스와 90-100% 전원 목표를 변경 하는 경우 보정.
- 4 X 목표를 사용 하 여 스테인드 막 슬라이드를 검사 합니다.
- 선택 하 고 서 막 슬라이드에 대 한 대상 영역을 둘러싸 자. 레이저는 42 m m2의 최소 면적을 해 부. 기록 영역 사용 될 샘플 균질 화 버퍼의 볼륨을 결정 하기 위해 해 부.
- 모자 리프트 메커니즘을 사용 하 여 적절 한 돌출부에 연결 된 레이블이 튜브의 기관총 모자에 해 부 섹션 검색. 뚜껑에는 해 부 섹션 검색 되지 않으면, 반복 영역의 레이저 절 개 합니다.
3. 조직 세포
참고: 여러 솔루션 및 자료 테이블의 자료에 언급 된 키트와 함께 제공 됩니다.
- 후 60: 1 비율에서 균질 화 솔루션 및 가수분해 K 사용 하 여 샘플 세포에 대 한 필요한 균질 화 혼합 볼륨을 준비 합니다.
- 조직 영역, 10에 대 한 소용돌이의 각 1 m m2 에 대 한 각 관으로 솔루션을 균질의 2.4 µ L 플라스틱 최대 속도와 5에 대 한 상 온에서 원심 분리기 s 2500 x g에서 s.
- 600 rpm에서 떨고와 함께 12-18 h 65 ° C에서 난방 블록에서 품 어.
- 실 온에서 5 분에 대 한 21000 x g에서 lysates 원심
- 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 맑은 상쾌한 발음 하 고 레이블이 신선한 관으로 분배. 이 결과의 품질을 줄일 수 있습니다 조직/막 파편을 발음 하지 마십시오.
- 명확한 상쾌한-80 ° C 냉동 실에 저장 합니다.
4. 교 잡-기반 분석 결과
- 다음과 같은 준비를 수행 합니다.
- 전 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 시 약 병을 배치 하 여 세포 혼합물을 따뜻하게 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합.
- 조직 homogenates, 냉동 실 온에서 해 동 하 고 최대 속도 부 화 다음에 샘플 30 분 소용돌이 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 54 ° C에서 떨고 인큐베이터를 설정 하 고 96 잘 접시의 빈 잘에서 온도 유효성 검사 키트의 프로브를 배치. 2 시간 후 디지털 온도계에 온도 확인 하 고 떨고 어떤 온도 차이 대 한 해결 하기 위해 인큐베이터의 델타 온도 설정 합니다.
- 눈 녹은 물 및 소용돌이 프로브를 설정 하 고 10 시 차단 s, 5에 대 한 상 온에서 원심 분리기 g, 그리고 얼음에 계속 x 2500에서 s.
- 사용 하는 동안 얼음에 가수분해 K 유리병을 유지.
- 3 분, 또 다른 3 분 최대 속도로 다음 소용돌이 46 KHz에서 캡처 구슬 sonicate
- 다음 약을 적절 하 게 확장 하 여 잘 당 25 µ L 작업 구슬 믹스를 준비: Nuclease 무료 물, 세포 혼합물의 16.65 µ L, 차단 시 약, 가수분해 K의 0.10 µ L, 캡처 구슬의 0.50 µ L, 프로브 세트의 2.50 µ L의 1.00 µ L의 4.25 µ L.
- 소용돌이 작업 구슬 믹스 10에 대 한 최대 속도, s는 다음 자석 분리 판으로 25 µ L/잘 플라스틱.
- 피 펫 25 µ L 조직 homogenate 자력 분리 96 잘 접시와 25 µ L 공란으로 3 웰 스 솔루션을 조직.
- 투명 한 플라스틱 압력 물개를 사용 하 여 자력 분리 접시를 봉인 하 고 600 rpm에서 떨고 있는 동안 18-22 h 54 ± 1 ° C에 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 세척의 0.1 mL RNase 무료의 31.5 mL 물 혼합 하 여 24 웰 스 워시 버퍼 구성 요소 2 구성 요소 1 및 1.67 mL 버퍼 워시 버퍼 솔루션 X 1 준비.
- 인큐베이터에서 접시를 제거 합니다. 50 ± 떨고 인큐베이터의 온도 설정 1 ° c.
- 휴대용 자석 접시 세탁기에 자력 분리 접시를 탑재 하 고 장소에 잠금. 압력 인감을 제거 하 고 정착 자성 구슬에 대 일 분 기다립니다.
- 세척 단계: 자력 분리 플레이트에 장착 플레이트 싱크 및 오 점 부드럽게 잔여 솔루션을 제거 하는 티슈 페이퍼에 반전. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 100 µ L 워시 버퍼 솔루션 X 1의 각 음에 더하고 대기 15 미 세척 접시 3 번을이 단계를 반복.
- 각 우물에 프리 앰프 시 약의 50 µ L 플라스틱 알루미늄 플레이트 도장 접시를 봉인 하 고 실 온에서 1 분 동안 800 rpm에서 접시를 흔들어. 50 ± 1 ℃에서 1 h 동안 600 rpm에서 떨고 품 어.
- 4.9 (세척 단계) 단계를 반복 합니다.
- 각 음을 앰프 시 약의 50 µ L 플라스틱 알루미늄 플레이트 도장 접시를 봉인 하 고 단계 4.10에서 접시를 흔들어.
- 4.9 (세척 단계) 단계를 반복 합니다.
- 소용돌이 10 라벨 프로브 최대 속도에서 s. 각 우물에 레이블 프로브의 50 µ L를 추가 합니다. 봉인 하 고 흔들 플레이트 (단계 4.10).
- 단계 4.9 (세척 단계)를 반복 합니다.
- 소용돌이 Streptavidin phycoerythrin (SAPE) 10에 대 한 최대 속도에서 s. 각 우물에 SAPE의 50 µ L를 추가 합니다. 봉인 하 고 흔들 플레이트 (단계 4.10).
- 워시 버퍼 솔루션 대신 SAPE 워시 버퍼를 사용 하 여 제외 하 고 단계 4.9 (세척 단계)를 반복 합니다.
- 알루미늄 플레이트 도장 각 우물 및 격판덮개에 SAPE 워시 버퍼의 130 µ L를 추가 합니다. 3 분 동안 실 온에서 800 rpm에서 접시를 흔들어.
- 마그네틱 비드 분석기 시작입니다. 제조업체의 지침에 따라 교정 및 검증 루틴을 수행 합니다.
- 다음 매개 변수를 사용 하 여 자석 구슬 분석기에서 프로토콜 설정: 샘플 크기: 100 µ L; DD 게이트: 5000-25000; 시간 초과: 90 s; 구슬 이벤트/구슬 지역: 100; 그리고을 클릭 합니다. 패널에서 각 구슬 숫자를 선택 하 고 제조 업체에 의해 표시 된 대로 해당 대상 유전자와 구슬 영역을 정의.
- 일괄 처리 탭에서 "생성 일괄 처리를 사용 하 여 기존 프로토콜"을 선택 하 여 새 분석을 추가 합니다. 플레이트 레이아웃 에서 우물으로 지정 하거나 알 수 없거나 빈각각 고 [ 견본 ] 패널에서 각 샘플에 대 한 레이블을 제공 합니다.
- 96-잘 반응 판에서 알루미늄 플레이트 물개를 제거 합니다. 플레이트 트레이 꺼내기 단추를 클릭 하 여 추출, 자석 구슬 분석기에 접시를 로드 합니다. 취소를 클릭 하십시오 | 일괄 처리 실행 분석기를 시작 하입니다. 읽기 후에, 추출 하 고 96 잘 접시를 제거 합니다. 깨끗 하 고 제조업체에서 권장 하는 대로 자기 비드 분석기 종료.
5. 데이터 분석
- 일괄 처리에서 | 결과 탭을 각각 분석 파일을 선택 하 고 to.csv 내보내기 버튼을 클릭 합니다. 오픈 the.csv 파일 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여입니다.
- 구슬 개수를 확인 하 고 < 40 구슬/지역에 대 한 어떤 결과 든 지 생략.
- 빈 우물의 값을 평균 하 고 표준 편차 (SD) 및 검출 한계 (LOD) (평균 빈 + (3xSD)) 대상 유전자 당. LOD 보다 들 키 지로 값을 설정 합니다.
참고: 정규화 표현식 값은 감지, 부적절 한 예제 데이터를 간주 한다. 식 값으로 20000 이상 위 감도 제한을 고려 합니다. 이 샘플의 lysates 희석 하 고 다시 분석 해야 합니다. - 유전자 당 원시 데이터에서 빈 평균을 뺍니다.
- 샘플 당 선택한 정규화 유전자의 기 평균을 계산 합니다. 각각은 개별 샘플 데이터를 정상화.
- 데이터 과학 플랫폼 또는 정의 된 알고리즘을 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
- 데이터 과학 플랫폼에 데이터 추가클릭 하 여 데이터를 가져옵니다. 데이터 파일 프로세스 작업 영역 으로 끌어서 연결 [속성 선택] 연산자 다음에 주 구성 요소 분석 (PCA) 연산자, 그리고 result 포트에 다음.
- 선택 특성 연산자에서 정규화 된 유전자 데이터의 하위 집합 및 유 방 암 하위 같은 명목 변수를 선택 합니다. 재생을 클릭 하 여 프로세스를 실행 합니다. 차트 탭에는 "3D 컬러 분산형" 차트 스타일에서 및 색 필드에 명목 변수를 선택 합니다. 3 차원 플롯에 PCA 데이터 변화를 평가 합니다.
Representative Results
설명된 방법 H & E (그림 1) 스테인드 40 증명서의 동시 측정을 위해 적용 된, microdissected (그림 2) 매우 저하 FFPE 소재. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 보여 수용 체 상태 (그림 3A), luminal 및 기초 분자 하위17에 종양의 분류 및 엽 마커의 FN1, 차동 식의 정확한 특성화 종양을 비교할 때 그리고 일치 제어 조직 (그림 3B), 다양 한 수용 체 양수와 음수 하위에서.
그림 1: H & E를 사용 하 여 유전자 발현 자료 스테인드. 식 프로필 간의 상관 관계가 얼룩진된 종양 섹션에 비해 흠 없는 종양 섹션에서 파생 된. [피어슨 상관 관계 p-값 = 5.34E-26]. 허가17재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: FFPE 직물의 레이저 기정. (A) H & E 스테인드 슬라이드; (B) Immunohistochemical 응급실 식; 얼룩 (C) HER2 immunohistochemical 얼룩이 지기; (D) 흠 없는 20 µ m 레이저 서 막 슬라이드에 섹션. 노란색 화살표는 명확 하 게 인해 얼룩이 지기의 부족으로 구분 하지는 침략 적인 종양의 영역을 나타냅니다. (E) A 20 µ m 섹션 관심 분야의 더 나은 묘사를 위한 H & E와 스테인드. 흰색 화살표는 빨간색 화살표 해 부 동안 레이저 초점을 표시 하는 동안 레이저 절 개 흔적을 나타냅니다. 모든 삽화는 10 배 확대에 점령 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: (A) 수용 체 상태 및 (B) 엽 마커 FN1, 유 방 종양에 비해 표현의 일치 정상. 고전적인 진단 유 방 암 하위 immunohistochemistry 및 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 HER2 애매 immunohistochemical 얼룩에 대 한 진단 결과 따라 정의 됩니다. (A) HER2과 응급실, (B) FN1 교 잡 기반 분석 결과 의해 측정의 표준화 된 표현은 HER2 긍정적인, 긍정적인, 응급실 그리고 환자에 비해 TNBC 경우 일치 정상 유 방 조직에에서 나와 있습니다. Kruskal 월리스 테스트 통계 (K-W χ2) 보여주는 HER2의 식을 크게 (p < 0.05) 및 크게 TNBC 일대에 HER2 긍정적인 일대에 일치 정상 조직의 반대로 종양 조직에 더 높은. 어 식 어 긍정에 TNBC 동료 일치 정상 반대로 종양 조직에 크게 높은 것으로 찾을 수 없습니다. FN1은 HER2 및 응급실 긍정적인 하위에 종양 조직에서 상당히 높은 이며 또한 TNBC 일대에 종양 조직에 크게 상승 되 고 향해 추세를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 사례 연구: 종양이. 형태학 상으로 뚜렷한 종양 microdissected 그리고 다른 샘플으로 취급. (A) 마스터 H & E 섹션의 스캔. (B, C) 10 배 및 40 배 확대, 각각 식별 각 종양 형태에 대 한. (D) Immunohistochemical 응급실에 대 한 10 배 확대에 얼룩. (E) Immunohistochemical Ki67에 대 한 종양 1에서에서 높은 mitotic 활동을 보여 주는 10 배 확대에 얼룩. (F) 식 수준 ESR1 유전자 immunohistochemical 결과에서 예상 대로 상대적으로 높고 동등한 식 종양 사이 보여주는 각 종양에 대 한 정규화 된. (G) 식 수준의 FN1, 엽 마커 증가 FN1 식 높은 Ki67를 동반 정규화 더 침략 적인 종양에 대 한 서명을 보여주는 얼룩. 역은 느리게 proliferating 종양 낮은 악성 잠재력 감소 FN1 식으로 표현 된 것 처럼 보인다 종양 2에서에서 관찰 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
멀티플렉스 bDNA 구슬 기반 분석 결과 FFPE 유방암 조직 및 정상적인 유 방 덕트에서 파생 된 저하 RNA에 유전자 발현을 계량에 최적화 되었다. 최적화 분석 결과, 유전자 정상화 luminal 및 기저 하위 8 잘 알려진 biomarkers 및 5 잠재적인 활용에 유방암 종양을 분류 하는 알고리즘을 개발 하는 관련 된. 데이터 정규화 이루어졌다 정규화 유전자의 순열을 사용 하 여. 정상화 유전자의 선택 Luminal/기초 분류자 유전자를 사용 하 여 수용 체 상태의 최고의 예측에 근거 했다. FFPE 직물에서 Luminal/기초 하위 분류 선택 정규화 유전자 베타-말라 (ACTB), Glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH)와 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) 했다.
메서드는 다른 진단에 사용 및 연구 분야 정상화 유전자 세트의 적절 한 선택에 따라 적용할 수 있습니다. 연구 분야에서이 방법의 한 가지 중요 한 응용 프로그램 아카이브 자료 잘 임상 결과와 주석에서 바이오 마커의 측정입니다. 이 신속 하 고 정확 하 게, 회고전 연구에 잠재적인 예측 마커를 확인 하 고 장기 잠재 연구 질병-무료 생존 및 전반적인 생존 데이터 기다리는 피할 수 있습니다. 현재 우리의 그룹은 데이터 정규화에 대 한 유전자를 정상화 대체 사용 하 여 새로운 알고리즘의 개발을 필요로 하는 수용 체-양성 exosomes를 검색 하는 분석 결과의 사용을 조사 하 고 있다. 액체 biopsies을 강력한 유전자 표정 분석 실험을 사용 하 여 높은 처리량 다중 분석 치료, 중 환자 관리에 대 한 적응을 허용 하 고 따라 치료 효능, 잠재적인 타락 때문에 치료에 저항 하는 수단을 제공 하 고는 전이성 종양의 용량입니다.
이 메서드는 또한 종양의 진단에 가능한 응용 프로그램의 넓은 범위를가지고 하 고 현재 진단 워크플로에 적응. 진단 분야에서이 방법의 주요 이점은 포함 한다: (1) 구현 (2) 제외 주관 및 확실치 않은 결과 이미지 기반 측정에서 발생 하는 높은 처리량 분석 실험의 여러 대상 (3) 정확한 탐지 동시에,는 정확도 강화 하 고 고도로 전문화 된 시설 및 인적 자원 필요 없음 소중한 환자 샘플, 및 (4)의 사용을 최소화. 구슬-기반 다중 분석에 필요한 재료의 낮은 입력 함께 최적화 된 샘플링 과정 수 추가 조사 종양이; 를 사용 하 여 레이저 기정을 정확 하 게 같은 환자 섹션에서 악성 조직의 여러 foci 일치 정상 조직 (그림 4) 뿐만 아니라 그들 사이 여러 유전자 발현을 비교 가능 하다. 낮은 재료 입력은 제한 된 종양 조직을 종양 생 검에서 진단 응용 프로그램에 대 한 중요 합니다. 저하 RNA 샘플에서 유전자 발현을 측정 하는 분석 결과의 용량 분석 기관 내 또는 실험실 서비스에 대 한 샘플의 쉬운 수송을 허용 한다. 또한, 전체 섹션 분석 H & E 스테인드 소재 (그림 1)를 사용 하 여 또한 이었다.
이 프로토콜의 성공을 위해 필수적입니다: (1) 보장 분석 결과 대 한 lysed 고 (2) 잘 개발 s/종양 사이트의 적절 한 샘플링 최적화 및 데이터 정규화 알고리즘, 각 유전자 식 패널 및/또는 개별 전조에 대 한 유효성 검사 또는 예측 생체입니다. 전 기술자/과학자는 샘플링을 수행의 기술 경험에 따라 다릅니다. 추가 코어는 다중 마그네틱 비드 분석 결과 (96-잘 형식)의 동일한 형태로 조직 microarray (TMA)을 준비 하는 것이 좋습니다. 이 RNA 기반 분석 결과 대 한 사용 하는 샘플의 복제본으로 종양 사이트의 아카이브를 제공 합니다. TMAs 또한 후속 연구 또는 결과의 유효성 검사에 대 한 다른 기술로 평가 될 수 있습니다. 정규화 알고리즘의 개발 조사 자료 및 정규화 유전자 정규화에 대 한 선택에 따라 달라 집니다. 정상화 유전자의 다른 패널 수준 및 샘플 분석에 표현의 다양성에 따라 선택 하 고이 다른 기원에서 암 조직, 플라즈마, 또는 순환 종양 세포에서 exosomes 사이 변화 한다. 분석 결과의 유효성 검사 샘플 처리 때문에 다양 한 준비 또한 다른 정규화 알고리즘 귀 착될 것입니다 포함 되어 있습니다.
요약 하면, bDNA 기술과 마그네틱 비드 기술 함께 사용 하 고 대상 유전자의 적절 한 패널의 선택 조직 lysates의 작은 금액에서 파생 된에 직접 유전자 발현 측정의 추가 된 이점을 제공할 것입니다. 환자 자료, microdissected, exosomes, 및 순환 종양 세포. 종양이 성분의 검출, 뿐만 아니라 패널의 적절 한 사용 파생 종양 exosomes 조기 진단 및 relapses의 조기 발견에 대 한 검색 가능성이 있다. 비드 기반 멀티 플렉스와 결합 하는 bDNA 기술을 사용 하 여 신호 증폭 임상 주석 아카이브 자료에 여러 유전자 발현을 측정 하 고이 제공 하는 리소스에 대 한 핵 산 증폭 단계에 대 한 필요가 없습니다 있기 때문에, 바이오 마커 검증입니다.
Disclosures
The Invitrogen™ QuantiGene™ 플렉스 분석 결과 과학 열 피셔의 독점 이다.
Acknowledgments
작품 (1) 유 방 암 프로젝트 장학금 (2014-2016) 유방암 재단 및 연구, 혁신 및 개발 신뢰 (RIDT) 몰타의 대학, (2)의 학부의 통해 살아 2013에 대 한 작업에 의해 자금에 의해 지원 되었다 & 수술, 몰타의 대학 및 과학 기술 융합 통해 몰타 위원회에 의해 자금 법 (3) 프로젝트:의 연구 나 기술 개발 프로그램 2016. 이 원고 출판 지원 정돈 Luminex 보조금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
| Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
| Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
| Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
| ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
| HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
| Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
| Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
| Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
| mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
| mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
| Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
| mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
| 1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
| 96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
| Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
| LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
| Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
| Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
| Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
| Sonicator | Silvercrest | ||
| RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
| Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
| RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
| Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |
References
- Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
- Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
- Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
- Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
- Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
- Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).
- Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
- Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
- Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
- Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
- Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
- Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
- Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from: http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus (2018).
- Lin, F., Prichard, J. Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).
