Summary
نقدم هنا، بروتوكول تحليل خلية إلى نقل المعلومات متذبذبة بالتحكم أوبتوجينيتيك والعيش الرصد للتعبير الجيني. هذا النهج يوفر منبرا فريداً لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.
Abstract
ينبغي أن تستجيب الخلايا بشكل صحيح للبيئات، التي تتأثر بعوامل مختلفة من المحيطة بالخلايا المتغيرة وقتيا. الشق مما يشير إلى المسار هو واحد من هذه الآلية الجزيئية الأساسية للاتصالات خلية إلى خلية، والذي يلعب دوراً رئيسيا في التطور الطبيعي للأجنة. هذا المسار ينطوي نقل خلية إلى خلية المعلومات متذبذبة مع إيقاعات أولتراديان، ولكنه على الرغم من التقدم المحرز في تقنيات البيولوجيا الجزيئية، وقد تم تحديا لتوضيح أثر التفاعلات متعددة الخلايا في الجينات متذبذبة ديناميات. نقدم هنا، على بروتوكول يسمح بالتحكم أوبتوجينيتيك ويعيش رصد أنماط التعبير الجيني بطريقة زمنية محددة. وكشف هذا الأسلوب بنجاح أن مدخلات دورية داخل الخلايا وبين الخلايا مما يشير إلى درجة انترين ذبذبات الجوهرية بمرحلة تحول في القرار خلية واحدة وضبط التردد. وهذا النهج ينطبق على تحليل السمات الدينامية لمختلف مسارات الإشارات، توفير منصة فريدة لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.
Introduction
خلية إلى خلية الاتصالات تلعب أدواراً حاسمة في الزخرفة الجنينية في العمليات الإنمائية. في أجنة الفقاريات، تتشكل هياكل ميتاميريك يسمى سميتس على طول المحور الأمامي الخلفي الجسم مع دقة زمنية دقيقة تحت مراقبة على مدار الساعة حفظ الوقت، يسمى تجزئة عقارب الساعة1. أثناء هذه العملية، يتم تحويل مجموعة من الخلايا بريسوميتيك mesoderm (PSM) دورياً إلى سميتس على نحو متزامن. تنطوي هذه العملية على التعبير الجيني متذبذبة متزامنة والخلايا PSM أن يتذبذب في مرحلة تشكل سميتس نفسه. وفترة التعبير الجيني متذبذبة حوالي 2 إلى 3 ح في الفئران وحوالي 30 دقيقة في الزرد. عند فصله، تفقد الخلايا PSM التزامن2،3، ولكن عندما تكون إعادة تجميعها، يمكن تنظيم ذاتي واسترداد السكان تتسق4، مما يوحي بأن اقتران خلية خلية مفتاح متزامنة ذبذبات.
كشفت الجهود المكثفة أن إشارات الجزيئات في مسار دلتا-الدرجة متصلة محكم بذبذبات متزامنة من الجينات على مدار الساعة تجزئة. أما مثبطات الدوائية أو طفرات وراثية من الدرجة الأولى مما يشير إلى لﻻستخدام سكان التذبذب. في الزرد، عرض طفرات من الدرجة الأولى مما يشير إلى عناصر، مثل ديلتاك وديلتاد و Notch1a، ذبذبات غير متزامن5،6. في الأجنة الفرخ أو الماوس، يجند الشق دلتا-like1 (Dll1) ليس فقط، بل أيضا هامش "حز المغير مجنونة" (لفنج) مطلوب لذبذبات متزامنة7،،من89. ومع ذلك، كان من الصعب لاختبار القدرة الوظيفية لهذه الجزيئات لنقل المعلومات الحيوية من خلية إلى أخرى، نظراً لأن قرارات مؤقتة من اضطراب التقليدية لديناميات تنظيم الجينات لم تكن كافية للتحقيق العمليات لفترات زمنية من 2-3 ح (إيقاعات أولتراديان).
قمنا مؤخرا بتطوير أسلوب متكامل لمراقبة ورصد أنماط التعبير الجيني في خلايا الثدييات10. هذه التكنولوجيا تمكن الاستقراء البقول التعبير الجيني بالإضاءة الخفيفة دورية على جداول زمنية أولتراديان. ويمثل هذا البروتوكول الأساليب إنشاء خطوط الخلايا حساس ومراقبة ردود دينامية للخلايا مراسل التﻷلؤ خلية يعيش الرصد في السياقات من خلية إلى خلية الاتصالات. هذا الأسلوب المنطبق على تحليل العديد من مسارات الإشارات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جيل خطوط الخلايا مستقرة بنظام Tol2
-
ترانسفيكت بلازميد ناقلات (الشكل 1A) من الوحدات النمطية المستندة إلى Tol2 أوبتوجينيتيك إلى جانب ناقلات التعبير ترانسبوساسي (Tol2) (بكاجس-mT2TP) إلى الخلايا C2C12. في كل الخطوات، خلايا الثقافة مع دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين-ستربتوميسين في 37 درجة مئوية (الجدول 1)، حضور 5% CO2، الإشارة إلى خلاف ذلك.
- عد الخلايا تريبسينيزيد مع خلية-عداد، ولوحة 5 × 104 C2C12 الخلايا الواحدة وكذلك في لوحة 12-جيدا قبل تعداء بيوم واحد.
- شارك ترانسفيكت ميكروغرام 0.375 ناقلات المستندة إلى Tol2 أوبتوجينيتيك (pAI177 أو pAI218) وميكروغرام 0.125 ناقل التحديد المخدرات (pAI170) و 0.5 ميكروغرام من ناقلات بكاجس-mT2TP باستخدام كاشف ليبوفيكشن.
- تريبسينيزي transfected الخلايا، ولوحة لهم في أطباق الثقافة 100 ملم يوم واحد بعد تعداء.
- تبادل الثقافة المتوسطة للخلايا ترانسفيكتيد للثقافة المتوسطة وتستكمل مع هيجروميسين 100 ملغ/مل.
- خلايا الثقافة لمدة 3 أيام للقضاء على الخلايا ترانسفيكتيد الأمم المتحدة. لاحظ أنه ليس من الضروري تغيير المتوسطة.
- تريبسينيزي transfected الخلايا، وتطهير عدد خلايا معربا عن البروتينات الفلورية للتحديد. لاستقبال الخلايا تحمل pAI177، تعيين بوابة الفرز إلى قناة الأخضر-PE لتنقية سكان الخلية مشري-إيجابية. للخلايا الحساسة صور المرسل تحمل pAI218، تعيين بوابة الفرز إلى قناة الجيش الشعبي الكونغولي لتنقية سكان الخلية iRFP713 إيجابية.
- (اختياري) وضع سكان خلية الاستنساخ بالأساليب القياسية، مثل تخفيف محدود أو خلية واحدة بالفرز حسب الأصول.
2-تقييم صور حساسية الخلايا المهندسة على مستوى السكان
ملاحظة: هذا الجزء يصف وضع بروتوكول للتحقق التعريفي دينامية Dll1 يجند البروتينات عند إضاءة الضوء الأزرق بفحوصات الكيمياء الحيوية، مثل قبكر والنشاف الغربية.
- قم بإعداد نوعين من الحاضنات مع أو بدون مصادر الضوء لشرط المستحثة بالضوء أو شرط الظلام، على التوالي. إنشاء ضوء كثافة الأزرق تقودها ترانس-إضاءة، كما هو مبين في الشكل 1 باء، باستخدام ضوء متر. توقيت البرنامج ومدة الإضاءة الخفيفة قبل تحميل عنصر تحكم نصي واحد-المجلس الصغير-تحكم تسمح الجداول القابلة للبرمجة للإضاءة (الشكل 1).
- عد الخلايا تريبسينيزيد مع خلية-عداد، ولوحة 1.0 × 105 المرسل المراعية لصور الخلايا تحمل pAI218 و pAI170 على أطباق الثقافة البلاستيك قطرها 35 ملم (الأطباق أكثر من 12 حالة خفيفة وطبق 1 لحالة الظلام) وتعيين الأطباق فصل حاضنات للظلام/الضوء الخافت. بعد إعداد أطباق، إبقاء أبواب حاضنات مغلقة حتى جمع ليساتيس الخلية.
- أيام ونصف بعد الطلاء، تبدأ الإضاءة الخفيفة (الخلايا ومن المتوقع أن يكون أكثر من 80% المتلاقية). لا تعرض الخلايا الضوء لتجنب التحفيز صور غير مرغوب فيها.
ملاحظة: الجداول الزمنية للإضاءة يعتمد على غرض التجارب. علما أن شرط إضاءة مستمرة (مثلاً. 1-مين فترات مدة و 10 دقيقة مع 40 µmol/م2/ق الضوء-كثافة) هو كافية لفحص بسيط صور التعريفي، وأن الإضاءة الخفيفة قوي الضارة بالخلايا. وبالتالي، تأكد من تحديد المعلمات غير مؤذية للإضاءة. - حوالي 2 أيام بعد الطلاء، تعد الخلية-مع فواصل 30 دقيقة. نقل تذوق أطباق من الحاضنات إلى على الجليد، والبدء في إعداد ليساتيس الخلية لمزيد من التحليل.
3-الدينامية المرسل والمتلقي في التحليل على مستوى السكان: في الوقت الحقيقي رصد الاستجابات الخلوية على التحفيز البصري ب PMT
- تريبسينيزي وعد الأرقام المرسل والمتلقي الخلايا مع الأساليب القياسية. إعداد 1 مل إجمالي حجم الاختلاط تعليق 2.5 × 104 المتلقي و 1.25 × 105 المرسل الخلايا (نسبة 1:5).
ملاحظة: 2:1، 1:1، أو 1:2 المرسل والمتلقي نسب أيضا العمل مع عدد خلايا إجمالي 1.5 × 105. 10 - لوحة مختلطة خلايا في كل بئر من اللوحات السوداء 24-جيدا مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على لوسيفرين 1 مم.
- تحليل الخلايا على قارئ لوحة للانزيم لوسيفراس، والتأكد من أن إشارات الإخراج ليست عالية جداً لنظام التسجيل.
ملاحظة: إذا كانت الإشارات الناتج أعلى من 1 × 106 فوتون التهم/s، أنهم قد المشبعة. وفي هذه الحالة، خفض تركيز لوسيفرين إلى القيم المثلى حيث تكون إشارات الإخراج أقل من 1 × 106 فوتون التهم/s. - تعيين اللوحة في نظام التسجيل، وبدء برنامج تسجيل (الشكل 1). على سبيل المثال، بدء تشغيل الإضاءة الخفيفة في ح 18 بعد إعداد التسجيل.
ملاحظة: التصفية الزمنية، مثل إشارات ديتريندينج مع تحريك في المتوسط و Savitzky-غولي التصفية، مفيدة لتصور أشكال موجه وذروة المكتشفة.
4. الفحص دينامية المرسل والمتلقي على مستوى خلية واحدة: في الوقت الحقيقي التصوير من الردود خلية واحدة تحت سيطرة اضطراب أوبتوجينيتيك
- لوحة 0.5 × 105 المتلقي و 2.5 × 105 المرسل الخلايا على أطباق قطرها 27 ملم-قطر-الزجاج-قاعدة 35 ملم. التأكد من أن نسب خلط وعدد مجموع خلايا (كثافة خلية) يتم تعديلها بشكل صحيح.
- يوم واحد بعد الطلاء، تبادل متوسطة مع 2 مل من تسجيل المتوسط (الفينول الحمراء المتوسطة دميم الحرة وتستكمل مع 5% FBS، البنسلين والستربتوميسين ولوسيفرين 1 ملم)، وتعيين طبق قاعدة الزجاج في المجهر. إذا لزم الأمر، تغسل حطام خلايا الميتة مع برنامج تلفزيوني (-).
ملاحظة: من الأفضل للقيام بهذه الخطوة في حالة الظلام. - قم بإعداد مجهر مقلوب مجهزة دائرة بيئية في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
- إعداد كاميرا CCD تبريد. التأكد من أن درجة الحرارة من اتفاقية مكافحة التصحر الاستشعار يتم تبريده إلى القيمة الوجهة (عادة،-90 درجة مئوية).
-
تعيين معلمات لنافذة "Timelapse متعدد الأبعاد" في مجال البرمجيات الحصول تلقائياً التقاط الصور مع فترات مدة 5 دقائق وأكثر من 288 مرات (تسجيل بين عشية وضحاها أكثر من واحد).
- فتح إطار "Timelapse متعدد الأبعاد" وحدد قناة التﻷلؤ ووضع قراءة 50 كيلوهرتز بطيئة من القائمة المنسدلة وتعيين binning 4 × 4 مع التعرض 4-دقيقة. تأكد من تعيين وضع القراءة إلى وضع 50 كيلوهرتز بطيئة، هو أمر حيوي للحد من الضوضاء القراءة للكشف عن الضوء طرحه التي ينبعث منها قدر ضعيف.
- فتح إطار "Timelapse متعدد الأبعاد" وحدد قنوات الأسفار ووضع قراءة 1 ميغاهرتز بسرعة من القائمة المنسدلة وتعيين binning 2 × 2 مع التعرض 400 مللي ثانية. تأكد من تعيين وضع القراءة بطريقة سريعة 1 ميغاهرتز لتقليل الوقت المطلوب للتصوير بالأسفار.
- بدء الوقت الفاصل بين التسجيل بواسطة النقر فوق الزر "الحصول".
- استخراج آثار خلية واحدة من القنوات التﻷلؤ من الوقت الفاصل بين الأفلام ببرنامج تحليل الصور، كما يلي. أولاً، جعل الصور المكدس التﻷلؤ والأسفار عن طريق استيراد بيانات الصورة إلى برمجيات تحليل الصور. بالنسبة للصور التﻷلؤ، إزالة بكسل الساخنة المستمدة من الأشعة الكونية بمقارنة كثافة بكسل الصور وقتيا المتاخمة، واستبدال قيم بكسل المتوسط الزمني للإطارات السابقة والتالية (تنفذ كتصفية "سبيكينويسي")، تطبيق هذه الصور المجهزة لعامل تصفية تجانس مكانياً، وطرح قيم بكسل خلفية وجهات النظر أووتفيلد من كل إطار. ثم تحديد "منطقة الاهتمام" (ROI) لكل خلية في صورة فلورسنت عند كل نقطة الوقت، تطبيق عائد الاستثمار على الصور الإنارة، وقياس شدة الإنارة لكل عائد الاستثمار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
علينا تكييف ليتون النظام11،12، الذي يتيح التعبير الجيني الناجمة عن الصور في خلايا الثدييات، لدراسة التذبذب الوراثية مع تواتر ح 2 إلى 3. ويتألف هذا النظام من جزئين: هجافبو صور إيندوسيبلي المنشط النسخي وكاسيت UAS-مروج لمحرك أقراص النسخ من جينات التعسفي للفائدة. لتسريع حركية نابض للتعبير الجيني المستحثة بالصور، حلت تسلسل بوليا في كاسيت المروج UAS مورين Hes1 3 ' UTR، الذي يقصر فترة التنصيف مرناً إلى 20 دقيقة في الخلايا الليفية مورين.
لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة، كان نواقل ثلاثي سيسترونيك استناداً إلى نظام ترانسبوساسي Tol2 تستخدم13 (الشكل 1A). ناقل التعبير Tol2 أمر ضروري لتعزيز كفاءة الصبغية دمج بلازميد أشرطة الكاسيت14. تلك الناقلات تحمل أشرطة الكاسيت تعبير الجينات الضوء إيندوسيبلي يقودها UAS-المروج ليس فقط، بل أيضا شرائط التعبير من البروتينات هجافبو ونيون صور حساسية البروتين (iRFP71315 أو مشري). هذا التصميم سمح لنا بتطهير عدد خلايا التي تدمج والبلازميدات فعالية في جينوم مضيف.
قمنا بإنشاء خلايا المرسل المراعية للصور التي تنتج بروتينات يجند Dll1 عند إضاءة الضوء الأزرق (الشكل 2A). وتحقيقا لهذه الغاية، استخدمت Tol2 المستندة إلى نظام ثنائي سيسترونيك ناقل (pAI218). للتحقق من تنظيم دورات تعريفية ليجند Dll1 عند إضاءة الضوء، كان مثقف خلايا في حضانات مجهزة المبرمجة مصادر الضوء الأزرق الصمام هو مبين في الشكل 1 باء و جيم 1. وتظهر نتائج تمثيلية المستحثة بصور Dll1 البروتين التعبير الديناميات الكشف عنها بواسطة تحليل النشاف الغربية في الشكل 2 (ب) و 2 (ج).
لتحديد الخلايا التي تستجيب للشق إشارات المدخلات، استخدمنا Tol2 المستندة إلى نظام ثنائي سيسترونيك ناقل (pAI177) يحمل المراسل زعزعة استقرار لوسيفراس الخاضعة لسيطرة المروج للجينات المستجيب درجة Hes1 وفوسفوجليسيراتي كيناز (PGK) يحركها المروج المترجمة نويات الأحمر نيون مراسل مشري H2B. وفي هذه الحالة، المراسل الفلورسنت مفيد لتنقية وتتبع في الوقت الفاصل بين الفحص المجهري خلية واحدة.
مرة واحدة بنجاح إنشاء المرسل صور إيندوسيبلي الخلايا والخلايا المتلقي، أنها على استعداد لإجراء التحليل الديناميكي المرسل والمتلقي باستزراع شاركت هذه الخلايا (الشكل 2A). في هذا التحليل، الخلايا المرسل المراعية للصور التي تعبر عن البروتين يجند الشق Dll1 عند إضاءة الضوء الأزرق كانت مثقف يشترك مع خلايا المتلقي غير متحسسة للصور التي تحمل مذبذب Hes1 الذاتية والإضاءة الحيوية (مراسل Hes1 pHes1-دلوك) (الشكل 2D). اندوجينوسلي إكسبريس استقبال الخلايا مستقبلات الدرجة، ويستجيب ل Dll1 المقدمة من الخلايا المجاورة.
تظهر نتائج الممثل لفحوصات الدينامية المرسل والمتلقي في الشكل 2E و 2F. للكشف عن الاستجابات حيوية من خلايا المتلقي مع تسجيل الإضاءة الحيوية، كنا أول نظام رصد خلية يعيش مزودة بأنبوب صور حساسية عالية-مضاعف (PMT) لعد فوتون ومصدر ضوء أزرق LED لتحفيز الضوء ( الشكل 1). يسمح هذا النظام تسجيل إشارات الإضاءة الحيوية على مستوى السكان مع الإضاءة الخفيفة المجدولة في الوقت الحقيقي. عندما يشترك مثقف هذين النوعين من الخلايا وتتعرض للإضاءة الخفيفة المتكررة (30 مدة s، فترات ح 2.5)، وكانت الردود دوري من خلايا المتلقي يمكن اكتشافها في ظروف مختلفة من خلط نسب (الشكل 2E). في هذا المثال، قمنا بتطبيق Savitzky-غولي التصفية (4ث أمر ونافذة نقطة بيانات 13) للتخفيف من إشارات صاخبة. الوقت الفاصل بين الفحص المجهري مع الإضاءة الخفيفة المتكررة (المدة 2 دقيقة، وفترات ح 2.75) كما كشفت الردود المتزامنة من خلايا المتلقي على مستوى الخلايا المفردة (الخطوط الرمادية في الشكل 2 واو) وعلى مستوى السكان (الخط الأحمر في الشكل 2F). تشير هذه البيانات إلى أن التعبير دوري Dll1 البروتين في خلايا المرسل كاف لمزامنة ذبذبات Hes1 في استقبال الخلايا المجاورة.
رقم 1: استراتيجية لتحليل الاستجابات الخلوية على اضطرابات أوبتوجينيتيك. (أ) تخطيطي ناقلات بلازميد الممثل المستخدمة لهذا البروتوكول. هذه البلازميدات متوفرة عند الطلب. (ب) صور حاضنة2 CO مزودة بجهاز الصمام أزرق تحت صفيحة ثقافة خلية 6-جيدا. (ج) رسم تخطيطي الدائرة الكهربائية لقوة مراقبة العرض لمصدر الضوء LED بكمبيوتر مايكرو القابلة لبرمجة. وكان تعيين تتابع الحالة الصلبة (SSR) ترحيل تشغيل/إيقاف الدول من خارج دبوس الرقمية الدقيقة-الكمبيوتر لتشغيل/إيقاف الدول مصدر الضوء LED. (د) صورة والتخطيطي للإضاءة الحيوية خلية يعيش نظام الرصد. علما بأن نقل المرحلة يجهز أونيديريكتيونالي من تسجيل موقف على رأس كاشف PMT لوضع إضاءة على رأس مصدر الضوء LED. أيضا، لاحظ أن كاشف PMT يمكن الانتقال من جيد إلى جيدا لرصد إشارات من الآبار الفردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أمثلة لتجارب اضطراب أوبتوجينيتيك. واستخدمت في هذه الأمثلة، مورين خطوط الخلايا في ميوبلاست C2C12. (أ) التخطيطي للتحليل الديناميكي المرسل والمتلقي. (ب، ج) الممثل نتائج التعبير Dll1 المستحثة بضوء تحليلها بواسطة تحليل النشاف الغربية. كانت البروتينات Dll1 الناجم عن الإضاءة الخفيفة دورية مع فترة ح 2.5 ومدة 2 دقيقة وكثافة 24.7 ث/م2. (د) صورة Fluorescence منظومة الثقافة المشارك من الخلايا المرسل والمتلقي. (ه، و) الممثل نتائج التحليل الديناميكي المرسل والمتلقي. (ه) الزمانية أنماط استجابات المتلقي مسجل من قبل نظام الرصد خلية يعيش مجهزة PMT. تم إصلاح عدد الخلايا الإجمالي إلى 1.5 × 105 الخلايا، ولكن تم توزيع النسب بين المرسلين وأجهزة الاستقبال من 5:1 إلى 1:2. (و) كشف التصوير خلية واحدة أن نقل المعلومات متذبذبة، والتي حملت بالإضاءة الخفيفة الدوري (المدة 2 دقيقة، وفترات ح 2.75)، من المرسل إلى المتلقي الخلايا. وقد استخدمت 1.5 × 105 الخلايا بنسبة 5:1 المرسل إلى المتلقي. مقتبس من الرقم 10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد أظهرنا أسلوب لمراقبة ديناميات التعبير الجيني مع دورية ح 2 إلى 3. هذا الجدول الزمني أقصر بكثير من تلك الموجودة في النظم التقليدية الأخرى، بما في ذلك تيت في النظام ونظام ليتون الأصلي. المحددات الأساسية للوصول إلى المقاييس الزمنية أولتراديان إنصاف المستحثة بصور المنتجات الجزيئية ومرناس والبروتينات. قد تتوقف هذه المعلمات الحركية على أنواع الخلايا والأنواع. لضبط الحركية، واستبدال تسلسل Hes1 3 ' UTR مع الآخرين طريقة مستقيم إلى الأمام، نظراً لأنها لا تغير تسلسل ووظائف البروتينات المستهدفة. لالتماس الأخرى 3 ' تحيلها الحصول على المرغوب فيه نابض أنماط خاصة الخلايا ذات الاهتمام، رصد خلية يعيش دلوك بالاستقراء الخفيفة هو نقطة انطلاق جيدة، والمستخدمة للفحص والتحقق من الصحة.
واحد الأسئلة المطروحة بشكل متكرر حول التعامل اليومي مع خلايا حساسة للضوء. وفي حالة التحليل الديناميكي المرسل والمتلقي من الدرجة الأولى، مما يشير إلى، كنا قادرين على القيام يوميا الممرات خلية تحت أضواء الغرفة، نظراً لأن أنظمتنا (دلوك صور إيندوسيبلي أو Dll1 الخلايا والخلايا المتلقي) لا يغير تكاثر الخلايا والعودة بسرعة إلى الراحة الدول خلال 6 ساعات بعد أن يتم نقل الخلايا إلى حالة الظلام. إذا كانت الجينات للاهتمام عوامل للبت في مصير، راشح التعبير يمكن أن يحفز التمايز الخلوي أو منع التوسعات للخلايا، ولذلك من الضروري إعداد بيئة الضوء الأحمر لتجنب اضطراب أوبتوجينيتيك غير مرغوب فيه أثناء التعامل مع الخلية.
وقد عرضنا في هذا البروتوكول، إجراءات لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة مع شرائط التعبير الجيني صور إيندوسيبلي. هذا خطوة حاسمة للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها في التحليل الديناميكي المرسل والمتلقي. واحد قد تنظر تعداء عابرة لإدخال وحدات أوبتوجينيتيك في الخلايا، ولكن لا يعمل جيدا في أيدينا للقياسات الكمية من الحبوب أولتراديان. ووجدنا أن تعداء عابرة من والبلازميدات تحمل UAS-مروج أشرطة الكاسيت يؤدي إلى التعبير راشح في مستويات عالية نسبيا حتى في ظل حالة الظلام. هذا التعبير راشح الأسباب خلفية عالية دون أي تحفيز الخفيفة ويعيق قياس موثوق بها من الوقت بالطبع. طريقة بديلة إنشاء خلايا مستقرة هو نظام لينتيفيروس، ومفيد لأنواع الخلايا التي ليست مناسبة تعداء12. خطوط الخلايا الاستنساخ تقديم استجابات أكثر تجانساً من خطوط الخلايا غير المتجانسة، ولكن حتى في عدد سكان الاستنساخ، استجابات الخلية ليست دائماً متماثلة: بعض الخلايا لا تستجيب للضوء على التحفيز ومن ثم يوجد مستويات توزيع الضوء الناجم عن تعبير البروتين. قد يكون هذا بسبب مستويات التعبير المتغير هجافبو البروتين و/أو متغير الذاتية وفرة فلافين، chromophore اللازمة لاستشعار الضوء هجافبو.
ينص البروتوكول على المقدمة هنا هي أداة قوية لتحليل ديناميات التعبير الجيني، ولكن هناك بعض القيود. عيب واحد أن بعض القنوات الأسفار للفحص المجهري خلية يعيش غير متوافقة مع تحفيز الضوء الأزرق. إضاءة الضوء الأزرق ينشط ليس فقط ولكن أيضا حساسة للضوء--الأزرق البروتينات البروتينات الفلورية، بما في ذلك الأخضر والأصفر فلوري البروتينات (الجنسانية ويفبس)، التي عرضه لتبييض الصورة. على العكس من ذلك، يتطلب التصور للتجارة والنقل الضوء الأزرق الإثارة التي قد تؤدي إلى التنشيط غير مرغوب فيه من الخلايا الحساسة صور أثناء التقاط الصور الفلورسنت. برايت-حقل (مرحلة التباين) التصوير بمصدر الضوء المحيط أيضا متوافق مع تجارب الضوء الأزرق أوبتوجينيتيك، ولكن واحدة يمكن التحايل على هذه المشكلة باستخدام مصادر الضوء الأخضر أو أطول طول الموجه للتصوير.
التحليل الديناميكي المرسل والمتلقي سيكون مفيداً للتحقيق في مسارات الإشارات الأخرى. واحد الاحتمالات تطبيق لإفراز إشارات النظم. لهذه التحليلات، تطبيق يغاندس المنقاة في الأجهزة الدقيقة-فلويديك طريقة بديلة لحفز خلايا المتلقي في16،طريقة زمنية دقيقة17. بيد أن هذه النهج غير قابل للوصول إلى عمليات الإنتاج الحيوي ليجند الجزيئات في الخلايا المرسل. توظيف التحليل الديناميكي المرسل والمتلقي جنبا إلى جنب مع صور إيندوسيبلي يجند التعبير سيسمح كذلك تشريح لنقل الإشارات من المرسل إلى المتلقي الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها JST، المعزوفة (بالنيابة)، والبحوث الأساسية افولوشونال العلوم والتكنولوجيا (JPMJCR12W2 ())، معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (وزارة التربية والتعليم والثقافة، والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان 26119708 (بالنيابة) و 16 ح 06480 ())، والعلمية البحث (أ) (جمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) 24240049 ())، والعلماء الشباب (A) (JSPS ح 15 05326 (بالنيابة))، ومعونات للبحث العلمي في مجالات مبتكرة "الأسفار لايف "يأمرون، واليابان، ومنهاج للتصوير" النهج الديناميكي "" النظام الذين يعيشون "من يأمرون، اليابان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O.
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
