Summary
Nous présentons ici un protocole visant à analyser le transfert de cellule à cellule de renseignements oscillatoires par optogenetic contrôle et suivi de l’expression génique en direct. Cette approche constitue une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.
Abstract
Cellules doivent répondre correctement à l’évolution dans le temps des environnements qui sont influencés par divers facteurs d’entourant les cellules. L’encoche voie de signalisation est l’une de ces machines moléculaires essentielles pour les communications de cellule à cellule, qui joue un rôle clé dans le développement normal des embryons. Cette voie implique un transfert de cellule à cellule d’informations oscillatoires avec rythme ultradien, mais malgré les progrès des techniques de biologie moléculaire, il a été difficile à élucider l’impact des interactions multicellulaires sur gène oscillatoire dynamique. Nous présentons ici un protocole qui permet le contrôle d’optogenetic et de surveillance en direct des modèles d’expression de gène de manière temporelle précise. Avec succès, cette méthode a révélé que les entrées périodiques intracellulaires et intercellulaires de signalisation Notch monter oscillations intrinsèques de réglage de fréquence et déphaseurs à la résolution de cellule unique. Cette approche est applicable à l’analyse des caractéristiques dynamiques des différentes voies de signalisation, fournissant une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.
Introduction
Cellule-cellule communication joue un rôle crucial dans la structuration embryonnaire dans le processus de développement. Chez les embryons de vertébrés, les structures métamérique appelées somites sont forment le long de l’axe antéro-postérieur corps avec une précision temporelle sous le contrôle d’une horloge de chronométrage, appelée la segmentation horloge1. Au cours de ce processus, un groupe de cellules somitiques mésoderme (PSM) sont périodiquement convertis en somites de manière synchrone. Ce processus implique l’expression des gènes oscillatoire synchronisé et cellules PSM qui oscillent en phase forment les somites mêmes. La période de l’expression génique oscillatoire est environ 2 à 3 h chez la souris et environ 30 min chez le poisson zèbre. Lorsque dissociées, les cellules PSM perdent la synchronie2,3, mais quand ils sont re-agrégés, qu’ils puissent s’organiser et récupérer la population synchronie4, ce qui suggère que le couplage cellule-cellule est une clé pour la synchronisation oscillations.
Des efforts considérables ont révélé que des molécules de signalisation de la voie Delta-encoche sont correctement raccordés aux oscillations des gènes segmentation horloge synchronisées. Inhibiteurs pharmacologiques ou mutations génétiques de la signalisation Notch désynchroniser la population des oscillateurs. Chez le poisson zèbre, mutants de Notch signalisation composants, tels que DeltaC, DeltaD et Notch1a, affichent les oscillations asynchrone5,6. Chez les embryons de poulet ou de la souris, non seulement le ligand Notch Delta-like1 (Dll1), mais aussi l’encoche modulateur Lunatic fringe (LNFG) est nécessaire pour des oscillations synchronisées7,8,9. Cependant, il a été difficile à tester la capacité de telles molécules pour le transfert des informations dynamiques de cellule en cellule, parce que des résolutions temporelles des classique perturbation de la dynamique de règlement de gène n’étaient pas suffisantes pour enquêter sur les processus de délais de 2 à 3 h (rythme ultradien).
Nous avons récemment mis au point une méthode intégrée pour contrôler et surveiller profils d’expression génique dans les cellules de mammifères,10. Cette technologie permet l’induction d’impulsions d’expression de gène par une illumination lumineuse périodique sur des échelles de temps ultradiennes. Ce protocole représente les méthodes pour établir des lignées de cellules photosensibles et observer les réactions dynamiques des cellules journaliste par luminescence de cellules vivantes suivi dans les contextes de communication de cellule à cellule. Cette méthode est applicable à l’analyse des nombreuses autres voies de signalisation.
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Protocol
1. génération de lignées cellulaires stables par le système Tol2
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Transfecter des vecteurs de plasmide (Figure 1 a) des modules axés sur les Tol2 optogenetic ainsi que le vecteur d’expression transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) dans les cellules C2C12. Dans toutes les étapes, les cellules de culture avec un milieu DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et de la pénicilline-streptomycine à 37 ° C (tableau 1), en présence de 5 % CO2, notée dans le cas contraire.
- Compter les débris de cellules avec un compteur de cellules et plaque 5 x 104 C2C12 cellules / puits dans une plaque de 12 puits un jour avant la transfection.
- Transfecter Co 0,375 μg de vecteurs de base Tol2 optogenetic (pAI177 ou pAI218), 0,125 µg d’un vecteur de choix du médicament (pAI170) et 0,5 μg de pCAGGS-mT2TP vector à l’aide de lipofection réactif.
- Trypsinize cellules transfectées et leur plaque dans les récipients de culture de 100 mm, un jour après la transfection.
- Échange de milieu de culture pour les cellules transfectées de milieu de culture additionné de 100 mg/mL hygromycine.
- Cellules en culture pendant 3 jours pour éliminer les cellules non transfectées. Notez que le changement médiatique n’est pas nécessaire.
- Trypsinize cellules transfectées et purifier une population de cellules exprimant des protéines fluorescentes pour la sélection. Pour les cellules réceptrices transportant des pAI177, la valeur la porte triage canal vert-PE pour la purification de la population de cellules mCherry-positif. Pour les cellules photosensibles expéditeur transportant pAI218, réglé la tri porte sur APC canal pour la purification de la population de cellules iRFP713-positif.
- (facultatif) Établir une population clonale de cellules par les méthodes usuelles, telles que la dilution limitée ou unicellulaires Tri par FACS.
2. evaluation de la Photo-la sensibilité des cellules modifiées au niveau des populations
NOTE : Cette partie décrit un protocole pour vérifier l’induction dynamique des protéines ligand Dll1 sur l’éclairage en lumière bleu par des tests biochimiques, comme qPCR et éponger occidental.
- Mis en place deux types d’incubateurs avec ou sans sources lumineuses pour une maladie induite par la lumière ou une condition sombre, respectivement. Intensité lumineuse mise en place d’un bleu-trans-Illuminateur LED, comme le montre l' Figure 1 b, à l’aide d’un luxmètre. Programme horaires et durée de l’éclairement lumineux en chargeant un script de contrôle à un micro-contrôleur monocarte qui permet des horaires programmables pour l’éclairage (Figure 1).
- Comte trypsinisés cellules avec un compteur de cellules et transportant des pAI218 et pAI170 sur la vaisselle de culture en plastique de 35 mm de diamètre (plus de 12 plats pour l’état lège et 1 plat pour condition sombre) de cellules photosensibles expéditeur de5 plaque 1,0 x 10 et la valeur de la vaisselle séparer les incubateurs pour conditions de clair/sombre. Après avoir configuré les plats, garder les portes des incubateurs fermées jusqu’en collectant les lysats cellulaires.
- Un an et demi jours après l’ensemencement, commencer léger éclairage (cellules devraient être plus de 80 % confluentes). Ne pas exposer à la lumière pour éviter les indésirables de photo-stimulation des cellules.
NOTE : Horaires d’éclairage dépend le but des expériences. Notez qu’une condition d’éclairage durable (e.g. intervalles de durée et 10 min 1 min avec 40 µmol/m2/s intensité lumineuse) est suffisant pour un simple contrôle du photo-induction et cette forte illumination lumineuse est nocif pour les cellules. Ainsi, vérifiez que les paramètres inoffensifs pour l’illumination sont sélectionnés. - Environ 2 jours après l’ensemencement, préparer cellule-lysat avec intervalles de 30 min. Passer des plats échantillon d’incubateurs à sur la glace et commencer à préparer des lysats de cellules pour une analyse ultérieure.
3. dynamique expéditeur-destinataire test au niveau des populations : surveillance en temps réel des réponses cellulaires lors de la Stimulation optique par PMT
- Trypsinize et compter le nombre de l’expéditeur et les récepteur des cellules avec des méthodes standard. Préparer un volume total de 1 mL du mélange suspension de 2,5 x 104 récepteur et 1,25 x 105 cellules d’expéditeur (ratio de 1:5).
NOTE : 2:1, 1:1 ou 1:2 expéditeur-destinataire ratios également travaillent avec un nombre total de cellules de 1,5 x 105. 10 - Plaque mixé des cellules dans chaque cupule des plaques 24 puits noirs avec milieu de culture contenant luciférine de 1 mM.
- Analyser les cellules sur le lecteur de plaque pour l’analyse de luciferase et confirmer que les signaux de sortie ne sont pas trop élevés pour le système d’enregistrement.
Remarque : Si des signaux de sortie sont supérieures à 1 x 106 photon compte/s, ils peuvent être saturés. Dans ce cas, réduire la concentration de luciférine aux valeurs optimales pour que les signaux de sortie sont inférieures à 1 x 106 photon compte/s. - Mettre la plaque sur le système d’enregistrement et commencer un programme d’enregistrement (Figure 1). Par exemple, commencer léger éclairage à 18 h après le réglage de l’enregistrement.
Remarque : Un filtrage temporel, comme le redressement de signaux avec le déplacement en moyenne et Savitzky-Golay, filtrage, sont utile pour la visualisation des formes d’ondes et détections de pointe.
4. dynamique expéditeur-destinataire dosage au niveau unicellulaire : en temps réel d’imagerie des unicellulaires réponses sous le contrôle d’une Perturbation de la Optogenetic
- Plaque de 0,5 x 105 récepteur et 2,5 x 105 cellules de l’expéditeur sur plats de diamètre 27 mm-diamètre-verre-base 35 mm. S’assurer que les rapports de ce mélange et un nombre total de cellules (une densité cellulaire) sont correctement ajustés.
- Un jour après l’ensemencement, échanger le milieu avec 2 mL de support d’enregistrement (milieu DMEM sans phénol rouge, additionné de 5 % FBS, pénicilline-streptomycine et luciférine de 1 mM) et placer le plat de verre-base sur le microscope. Si nécessaire, laver les débris de cellules mortes avec du PBS (-).
NOTE : Il est préférable de faire cette étape dans des conditions sombres. - Mettre en place un microscope inversé équipé d’une chambre à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Mettre en place une caméra CCD refroidie. Veiller à ce que la température du capteur CCD est refroidie à la valeur de destination (en général,-90 ° C).
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Définir les paramètres de la fenêtre « Multi-Dimensional Timelapse » dans le logiciel d’acquisition automatique pour capturer des images avec des intervalles de 5 min et plus de 288 heures (plus d’un enregistrement au jour le jour).
- Ouvrez « Multi-Dimensional Timelapse » fenêtre, sélectionnez un canal de luminescence et un mode de lecture de 50 kHz lent dans le menu déroulant et définissez 4x4 binning bénéficiant d’une orientation de 4 min. Veiller à ce que la lecture est réglée sur le mode de 50kHz lente, ce qui est essentiel pour réduire les bruits de la lecture pour détecter bioluminescente faiblement émettant de la lumière.
- Ouvrez « Multi-Dimensional Timelapse » fenêtre, sélectionnez canaux fluorescence et un mode de lecture rapide 1 MHz dans le menu déroulant et définissez binning de 2 x 2 avec exposition de 400 ms. Veiller à ce que la lecture est réglée sur le mode rapide de 1 MHz à réduire le temps nécessaire pour l’imagerie de fluorescence.
- Commencez en Time-lapse enregistrement en cliquant sur le bouton « Acquérir ».
- Extraire des unicellulaires traces des canaux de la luminescence des films Time-lapse par logiciel analyse d’images, comme suit. Tout d’abord, faire des images de pile de luminescence et fluorescence en important les données de l’image au logiciel d’analyse image. Pour les images de la luminescence, supprimer les pixels chauds provenant des rayons cosmiques en comparant les intensités des pixels dans les images adjacentes dans le temps, remplaçant les valeurs de pixel à la moyenne temporelle des trames précédentes et suivante (implémenté comme « SpikeNoise filtre »), appliquer ces images traitées à un filtre de lissage dans l’espace et soustraire des valeurs de pixel de fond de répertorie vues de chaque image. Ensuite, déterminer une « région d’intérêt » (ROI) pour chaque cellule sur une image fluorescente à chaque instant, enduire le retour sur investissement des images lumineuses et mesurer l’intensité luminescente de chaque ROI.
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Representative Results
Nous avons adapté la LightOn système11,12, qui permet l’expression des gènes photoinduit dans des cellules de mammifères, à l’étude des oscillateurs génétiques avec une périodicité de 2 à 3 h. Ce système se compose de deux parties : l’activateur de la transcription inductibles par photo hGAVPO et une cassette de SAMU-promoteur de transcription de lecteur des gènes arbitraires d’intérêt. Afin d’accélérer la cinétique pulsatile de l’expression génique photoinduit, la séquence polyA dans la cassette de SAMU-promoteur fut remplacée par murin Hes1 3' UTR, qui raccourcit la demi-vie de l’ARNm à 20 min dans des fibroblastes murins.
Pour établir des lignées cellulaires stables, tri-cistronic vecteurs basés sur le système de transposase Tol2 a été utilisé13 (Figure 1 a). Le vecteur d’expression Tol2 est essentiel pour améliorer l’efficacité de l’intégration chromosomique du plasmide cassettes14. Ces vecteurs portent non seulement les cassettes d’expression de gènes inductibles par lumière conduits par le SAMU-promoteur, mais aussi les cassettes d’expression des protéine photosensible hGAVPO et fluorescentes protéines (iRFP71315 ou mCherry). Cette conception nous a permis de purifier une population de cellules qui intégrer efficacement les plasmides dans le génome hôte.
Nous avons établi des cellules photosensibles expéditeur qui produisent des protéines ligand Dll1 sur éclairage lumineux bleu (Figure 2 a). À cette fin, un vecteur bi-cistronic de Tol2 basées sur le système (pAI218) a été utilisé. Pour vérifier l’induction du ligand Dll1 à éclairement lumineux, les cellules sont cultivées dans les incubateurs équipés de sources de lumière bleue LED programmées illustrés à la Figure 1 b et 1C. Résultats représentatifs de photoinduit Dll1 expression dynamique de protéine détectée par l’analyse Western Blot sont indiqués dans la Figure 2 b et 2C.
Pour établir des cellules qui répondent à l’encoche signalisation entrées, nous avons utilisé un Tol2 basé sur un système bi-cistronic vecteur (pAI177) transportant le rapporteur luciférase déstabilisés sous le contrôle du promoteur du gène Notch effecteur Hes1 et la phosphoglycérate kinase (PGK) pilotée par le promoteur localisée noyaux rouge fluorescent journaliste H2B-mCherry. Dans ce cas, le journaliste fluorescent est utile pour la purification et de suivi en Time-lapse microscopie unicellulaires.
Une fois les cellules photo-inductible de l’expéditeur et récepteur sont établies avec succès, il est prêt à effectuer le dosage dynamique expéditeur-destinataire par co-culture de ces cellules (Figure 2 a). Dans ce test, les cellules photosensibles expéditeur qui expriment la protéine ligand de Notch Dll1 sur éclairage lumineux bleu ont été conjointement cultivées avec les cellules de récepteur photo insensible qui portent l’oscillateur endogène de Hes1 et une bioluminescence (journaliste) Hes1 pHes1-dLuc) (Figure 2D). Les cellules réceptrices endogène expriment le récepteur de Notch, qui tient compte des Dll1 présenté par les cellules voisines.
Les résultats représentatifs des essais dynamiques expéditeur-destinataire figurent dans la Figure 2E et 2F. Pour détecter les réactions dynamiques des cellules réceptrices avec enregistrement de bioluminescence, nous avons d’abord utilisé un système de surveillance de cellules vivantes équipé d’un tube à haute sensibilité photo-multiplicateur (PMT) pour le comptage de photons et d’une source de lumière bleue LED pour photostimulation ( Figure 1). Ce système permet d’enregistrer en temps réel des signaux de bioluminescence au niveau des populations avec un éclairage léger régulier. Lorsque ces deux types de cellules ont été conjointement mis en culture et exposés aux répétitive éclairage léger (30 s durée, 2,5 h d’intervalle), réponses cycliques des cellules réceptrices sont décelables dans diverses conditions de rapports (Figure 2E) de mélange. Dans cet exemple, nous avons appliqué Savitzky-Golay, filtrage (4ème ordre et une fenêtre de données-point 13) pour atténuer les signaux bruyants. Time-lapse microscopie avec un éclairage lumineux répétitif (durée 2 min, 2,75 h d’intervalle) a également révélé les réponses synchronisées des cellules réceptrices au niveau unicellulaire (lignes grises à la Figure 2F) et au niveau de la population (la ligne rouge en Figure 2F). ces données suggèrent que l’expression cyclique de Dll1 protéine dans les cellules de l’expéditeur est suffisante pour synchroniser les oscillations Hes1 dans le pays voisin de cellules réceptrices.
Figure 1 : stratégie visant à analyser les réponses cellulaires à des perturbations optogenetic. (A) schéma des vecteurs de plasmide représentatif utilisé pour ce protocole. Ces plasmides sont disponibles sur demande. (B) une photo d’un incubateur à CO2 équipé d’un dispositif LED bleu sous une plaque de culture de cellules de 6 puits. (C) le schéma d’un circuit électrique à commande électrique d’approvisionnement pour la source de lumière LED par un micro-ordinateur programmable. Un relais à état solide (SSR) a été créé pour relayer marche/arrêt États de brochage numérique de la micro-ordinateur pour marche/arrêt des États de la source lumineuse de LED. (D) une photo et schéma d’une bioluminescence de cellules vivantes, système de surveillance. Notez que la platine motorisée peut se déplacer façon unidirectionnelle d’un poste d’enregistrement sur le dessus du détecteur PMT à un poste d’éclairage sur le dessus de la source lumineuse de LED. Notez également que le détecteur PMT peut passer de bien de bien écouter les signaux provenant des puits individuels. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : exemples d’expériences de perturbation optogenetic. Dans ces exemples, les lignées cellulaires myoblastiques C2C12 murines ont été utilisées. (A) schéma du dosage dynamique expéditeur-destinataire. (B, C) Résultats représentatifs de photo-induits Dll1 expression analysée par Western Blot analyse. Dll1 protéines ont été induites par un éclairage léger périodique avec une période de 2,5 h, durée 2 min et l’intensité de 24,7 W/m2. Image de Fluorescence (D) du système de co-culture de cellules de l’expéditeur et le récepteur. (E, F) Résultats représentatifs du dosage dynamique expéditeur-destinataire. Tendances temporelles (E) des réponses de récepteur enregistrées par le système de surveillance de cellules vivantes avec la PMT. Le nombre total de cellules a été fixé à 1. 5 x 105 cellules, mais les rapports entre les expéditeurs et les récepteurs ont été distribués entre 5:1 à 1 / 2. (F) imagerie de la cellule unique a révélé qu’informations oscillatoires, qui a été induites par périodique éclairement lumineux (durée de 2 min, 2,75 h d’intervalle), a été transféré de l’expéditeur à cellules réceptrices. 1. 5 x 105 cellules avec le rapport expéditeur à récepteur de 5:1 ont été utilisés. Adapté de Réf. 10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons montré une méthode pour contrôler la dynamique d’expression de gène avec une périodicité de 2 à 3 h. Cette échelle de temps est plus courte que ceux dans d’autres systèmes conventionnels, y compris le système Tet et le système de LightOn original. Les paramètres clés pour atteindre les échelles de temps ultradiennes sont demi-vies de produits moléculaires photoinduit, ARNm et de protéines. Ces paramètres cinétiques peuvent dépendre des espèces et des types de cellules. Pour le réglage de la cinétique, remplaçant des séquences Hes1 3' UTR avec d’autres est une façon directe, car il ne modifie pas les séquences et fonctions des protéines cibles. Pour la recherche d’autres 3' UTR pour obtenir souhaitable pulsatile patterns en particulier cellules d’intérêt, cellules vivantes suivi de dLuc par induction légère est un bon point de départ et utilisé pour le dépistage et la validation.
Une des questions plus fréquemment posées est sur la gestion quotidienne des cellules sensibles à la lumière. Dans le cas de l’essai dynamique expéditeur-destinataire de la signalisation Notch, nous avons pu faire tous les jours passages de cellule sous les lumières de la pièce, parce que nos systèmes (photo-inducible dLuc ou cellules Dll1 et cellules réceptrices) ne pas modifier la prolifération cellulaire et revenir rapidement au repos États dans les 6 heures après que les cellules sont déplacés vers une condition sombre. Si les gènes d’intérêt sont des facteurs de détermination du destin, expression qui fuite peut induire la différenciation cellulaire ou empêcher l’expansion des cellules, et il est donc essentiel de mettre en place un environnement de feux rouges pour éviter la perturbation indésirable optogenetic pendant manipulation de cellules.
Dans ce protocole, nous avons présenté les procédures afin de produire des lignées cellulaires stables avec des cassettes d’expression de gènes inductibles par photo. Il s’agit d’une étape essentielle pour obtenir des résultats fiables dans l’essai dynamique expéditeur-destinataire. On peut considérer une transfection transitoire pour la mise en place de modules d’optogenetic dans les cellules, mais il ne fonctionne pas bien dans nos mains pour des mesures quantitatives d’impulsions ultradiennes. Nous avons trouvé que transfection transitoire des plasmides portant des pistes cassettes SAMU-promoteur d’expression qui fuite à des niveaux relativement élevés même dans des conditions sombres. Cette expression qui fuite provoque un fond important sans aucune stimulation lumineuse et entrave une mesure fiable de l’évolution temporelle. Une autre méthode pour établir des cellules stables est un système de lentivirus, qui est utile pour les types de cellules qui ne sont pas adaptés pour la transfection12. Les lignées clonales présentent des réponses plus homogènes que les lignées de cellules hétérogènes, mais même dans une population clonale, réponses des cellules ne sont pas toujours uniformes : certaines cellules ne répondent pas à la lumière de la stimulation et donc présenter un niveaux distribués d’induit par la lumière expression de la protéine. Cela pourrait être dû à des niveaux d’expression variable de hGAVPO protéines et/ou variable endogène abondance de flavin, un chromophore requis pour la détection de lumière de hGAVPO.
Le protocole présenté ici fournit un outil puissant pour l’analyse de la dynamique d’expression de gène, mais il existe certaines limitations. Un inconvénient est que certaines chaînes de fluorescence pour la microscopie des cellules vivantes ne sont pas compatibles avec une stimulation de la lumière bleue. Illumination de la lumière bleue active non seulement les protéines bleu-sensible à la lumière, mais aussi des protéines fluorescentes, y compris les verts et jaunes protéines fluorescentes (coordonnateurs et YFPs), qui sont susceptibles d’être photo-blanchiment. Au contraire, la visualisation de GFP nécessite excitation de lumière bleue qui peut déclencher l’activation indésirable de cellules photosensibles au cours de la capture d’images fluorescentes. Bright-champ (contraste de phase) imagerie de la source de lumière ambiante est également incompatible avec les expériences d’optogenetic de la lumière bleue, mais on peut contourner ce problème en utilisant des sources de lumière de longueur d’onde verte ou plus pour l’imagerie.
L’essai dynamique expéditeur-destinataire serait utile d’étudier d’autres voies de signalisation. Une possibilité est une application à sécrétant des systèmes de signalisation. Pour ces analyses, appliquant des ligands purifiées dans dispositifs microfluidique est une autre façon de stimuler les cellules réceptrices dans une manière temporelle précise16,17. Cependant, ces approches sont inaccessibles aux procédés de production dynamique de molécules de ligand dans les cellules de l’expéditeur. Employant le dosage dynamique expéditeur-destinataire ainsi que l’expression inductible photo ligand permettrait davantage dissection de transmission de signal d’expéditeur de cellules réceptrices.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par JST, PRESTO (par intérim), les recherches de base évolutif des sciences et technologies (JPMJCR12W2 (R.K.)), subventions pour la recherche scientifique sur les régions innovantes (ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT), Japon 26119708 (par intérim) et 16 H 06480 (R.K.)), scientifique (A) (société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS) 24240049 (R.K.)), de recherche et jeunes scientifiques (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) et une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants « Fluorescence Direct d’imagerie » du MEXT, Japon et plate-forme pour des approches dynamiques au système vivant depuis le MEXT, Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
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