Summary
Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.
Abstract
Cellen moeten goed reageren op stoffelijk veranderende omgevingen, die worden beïnvloed door verschillende factoren uit de omliggende cellen. De inkeping signalering traject behoort tot deze essentiële moleculaire machines voor cel-naar-cel communicatie, die spelen een belangrijke rol in de normale ontwikkeling van embryo's speelt. Dit traject omvat een cel-naar-cel overdracht van oscillerende informatie met ultradian ritmes, maar ondanks de vooruitgang in moleculaire biologietechnieken, heeft het ophelderen van de impact van meercellige interacties op oscillerende gen is uitdagend dynamiek. Hier presenteren we een protocol waarmee optogenetic controle en live gen expressiepatronen in een nauwkeurige temporele manier. Deze methode met succes gebleken dat intracellulaire en intercellulaire periodieke ingangen van de inkeping signalering later intrinsieke oscillaties door frequentie afstemming en faseverschuiving bij de eencellige resolutie. Deze benadering is van toepassing op de analyse van de dynamische functies van verschillende signaalroutes, bieden een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.
Introduction
Cel-naar-cel communicatie speelt een belangrijke rol in embryonale patronen in ontwikkelings processen. Bij gewervelde embryo's, de metameric structuren genaamd somieten langs de as van het anterior-posterior lichaam gevormd met een precieze temporele nauwkeurigheid onder de controle van een tijd-keeping klok, genaamd de segmentatie klok1. Tijdens dit proces, een groep presomitic mesoderm (PSM) cellen worden periodiek omgezet somieten op synchrone wijze. Dit proces omvat gesynchroniseerde oscillerende genexpressie en PSM cellen die in fase oscilleren vormen de dezelfde somieten. De periode van de oscillerende genexpressie is ongeveer 2 tot 3 h in muizen en ongeveer 30 min in zebrafish. Wanneer losgekoppeld, PSM cellen verliezen de synchrony2,3, maar wanneer ze opnieuw geaggregeerde, ze kunnen zelf organiseren en herstellen van de bevolking synchrony4, suggereert dat cel koppeling een sleutel voor de gesynchroniseerde is oscillaties.
Uitgebreide inspanningen bleek dat de signalering moleculen in de Delta-Notch pathway strak met de gesynchroniseerde oscillaties van de segmentatie klok genen verbonden bent. Farmacologische remmers of genetische mutaties van Inkeping signalering desynchronize de bevolking van de oscillatoren. Mutanten van Inkeping signalering van onderdelen, zoals DeltaC, DeltaD en Notch1a, weergeven in zebrafish, asynchrone oscillaties5,6. In chick of muis embryo's is niet alleen de inkeping ligand Delta-like1 (Dll1), maar ook de inkeping Modulator waanzinnige rand (Lfng) vereist voor gesynchroniseerde oscillaties7,8,9. Echter, het moeilijk geweest om te testen het functionele vermogen van dergelijke moleculen voor dynamische informatieoverdracht van cel naar cel, omdat tijdelijke resoluties van conventionele perturbation van gene verordening dynamiek waren niet voldoende om te onderzoeken de processen van tijdschalen van 2 – 3 h (ultradian ritmes).
Onlangs hebben wij een geïntegreerde methode voor controle en monitor gen expressiepatronen in zoogdiercellen10ontwikkeld. Deze technologie maakt inductie van gen expressie pulsen door periodieke lichte verlichting op ultradian tijdschalen. Dit protocol vertegenwoordigt de methoden lichtgevoelige cel-lijnen te observeren dynamische reacties van verslaggever cellen door live-cel luminescentie toezicht in de context van cel naar cel communicatie. Deze methode is van toepassing op de analyse van vele andere signaalroutes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generatie van stabiele cellijnen door het Tol2-systeem
-
Plasmide vectoren (figuur 1A) transfect van optogenetic Tol2-based modules samen met de vector expressie transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in C2C12 cellen. In alle stappen, cultuur cellen met DMEM medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en penicilline-streptomycine bij 37 ° C (tabel 1), in aanwezigheid van 5% CO2, anders aangeduid.
- Rekenen trypsinized cellen met een cel-teller en plaat 5 x 104 C2C12 cellen per putje in een 12-well bord één dag vóór de transfectie.
- Co transfect 0.375 μg van vectoren van de Tol2 gebaseerde optogenetic (pAI177 of pAI218), 0,125 μg van een drug selectie vector (pAI170) en 0.5 μg van pCAGGS-mT2TP-vector met behulp van lipofection reagens.
- Trypsinize van transfected cellen, en hen één dag na de transfectie plaat tot 100 mm cultuur gerechten.
- Exchange-kweekmedium voor transfected cellen aan kweekmedium aangevuld met 100 mg/mL hygromycin.
- De cellen van de cultuur voor 3 dagen om te un-transfected cellen te elimineren. Merk op dat middelgrote verandering niet nodig is.
- Trypsinize van transfected cellen, en te zuiveren van een bevolking van cellen uiten van fluorescente proteïnen voor selectie. Voor ontvanger cellen uitvoering van pAI177, de sorteer poort groen-PE kanaal ingesteld voor zuivering van mCherry-positieve-celpopulatie. Voor cellen lichtgevoelig afzender uitvoering van pAI218, de sorteer poort APC kanaal ingesteld voor zuivering van iRFP713-positieve-celpopulatie.
- (optioneel) Maak een klonale celpopulatie standaardmethoden, zoals beperkte verdunning of eencellige FACS sorteert.
2. evaluatie van foto-gevoeligheid van gemanipuleerde cellen op het bevolkingsniveau
Opmerking: Dit deel beschrijft een protocol om te controleren van dynamische inductie van Dll1 ligand eiwitten bij blauw-licht verlichting door biochemische tests, zoals qPCR en het westelijke bevlekken.
- Twee soorten starterscentra met of zonder lichtbronnen voor een licht-geïnduceerde voorwaarde of een donkere opgeeft, respectievelijk instellen. Set-up licht-intensiteit van een blauw-LED trans-illuminator, zoals afgebeeld in figuur 1B, met behulp van een lichtmeter. Programma tijdsinstellingen en duur van lichte verlichting door het laden van een controle-script naar een single-board-micro-controller waarmee programmeerbare planningen voor verlichting (Figuur 1 c).
- Rekenen trypsinized cellen met een cel-teller en plaat 1.0 x 105 lichtgevoelig afzender cellen uitvoering van pAI218 en pAI170 op 35-mm diameter kunststof cultuur gerechten (meer dan 12 gerechten voor lichte voorwaarde en 1 schotel voor donkere voorwaarde) en stel de gerechten in aparte voorbroeders voor donker/licht. Na het opzetten van gerechten, de deuren van de incubators tot het verzamelen van cel lysates gesloten te houden.
- Een en een half dagen na beplating, start licht verlichting (cellen zijn naar verwachting meer dan 80% confluente). Niet blootstellen cellen aan het licht om te voorkomen dat ongewenste foto-stimulatie.
Opmerking: Schema's voor verlichting is afhankelijk van het doel van de experimenten. Merk op dat een duurzame verlichting voorwaarde (bv. 1-min duur en 10 min. intervallen met 40 µmol/m2/s licht-intensiteit) is voldoende voor een simpele controle van foto-inductie, en dat sterke licht verlichting schadelijk voor de cellen is. Dus zorg dat onschadelijk parameters voor verlichting zijn geselecteerd. - Ongeveer 2 dagen na de beplating, bereiden cel-lysate met 30-min intervallen. Monster gerechten van starterscentra naar verplaatsen op-ijs en start voorbereiding van cel lysates voor verdere analyse.
3. dynamische zender-ontvanger Assay op het bevolkingsniveau: Real-time bewaking van cellulaire reacties op optische stimulatie door bet
- Trypsinize en de nummers van de afzender en de ontvanger cellen tellen met standaardmethoden. Voorbereiden van een totaal volume van 1 mL van het mengen van opschorting van 2.5 x 104 ontvanger en 1.25 x 10-5 afzender cellen (verhouding 1:5).
Opmerking: 2:1, 1:1 of 1:2 zender-ontvanger-ratio's ook werken met een cel Totaal aantal 1.5 x 105. 10 - Plaat gemengde cellen in elk putje van 24-well zwarte platen met kweekmedium dat 1 mM luciferine.
- Analyseren van de cellen op afleesapparaat voor luciferase assay, en bevestigen dat de uitgangssignalen niet te hoog voor het registratiesysteem zijn.
Opmerking: Als uitgangssignalen hoger dan 1 x 106 foton graven/s zijn, zij kunnen worden verzadigd. In dat geval, verminderen de concentratie van luciferine op optimale waarden zodat uitgangssignalen lager dan 1 x 106 foton graven/s zijn. - De plaat op de opnamesysteem is ingesteld, en start een programma voor het opnemen (Figuur 1 d). Bijvoorbeeld, om lichte verlichting om 18 h na het instellen van de opname te starten
Opmerking: Temporele filtering, zoals detrending signalen met bewegende gemiddeld en Savitzky-Golay filteren, zijn nuttig voor visualisatie van Golf-formulieren en piek detecties.
4. dynamische zender-ontvanger Assay op het niveau van eencellige: Real-time Imaging van eencellige reacties onder de controle van Optogenetic Perturbation
- Plaat 0,5 x 10-5 -ontvanger en 2.5 x 105 afzender cellen op 27-mm-diameter-glas-base 35 mm diameter gerechten. Erop toezien dat mengverhoudingen en een totale celaantal (een celdichtheid) correct worden aangepast.
- Een dag na de beplating, wisselen medium met 2 mL van het opnamemedium (fenol-rood gratis DMEM medium aangevuld met 5% FBS, penicilline-streptomycine en 1 mM luciferine), en de glas-base schotel aangezet met de Microscoop. Indien nodig, wassen puin van dode cellen met PBS (-).
Opmerking: Het is beter te doen deze stap in een donkere conditie. - Een omgekeerde Microscoop voorzien van een milieu kamer bij 37 ° C en 5% CO2instellen.
- Opzetten van een gekoelde CCD-camera. Zorg ervoor dat de temperatuur van de CCD-sensor is afgekoeld naar de waarde van de bestemming (meestal-90 ° C).
-
Parameters instelt voor "Multidimensionale Timelapse" venster in automatische overname software voor het vastleggen van beelden met intervallen van 5 min en meer dan 288 keer (meer dan één overnachting opname).
- Open "Multidimensionale Timelapse" venster, selecteer een kanaal van luminescentie en een langzame 50 kHz uitlezing modus in het pull-down menu en stel het weggooien van 4 x 4 met 4-min blootstelling. Ervoor zorgen dat de uitlezing-modus is ingesteld op de langzame 50 kHz, die is van cruciaal belang voor het verminderen van de uitlezing lawaai te sporen zwak emitterende bioluminescente licht.
- Open "Multidimensionale Timelapse" venster, selecteer fluorescentie kanalen en een snelle 1 MHz uitlezing modus van het pull-down menu en stel 2 x 2 weggooien met 400 ms blootstelling. Ervoor zorgen dat de uitlezing-modus is ingesteld op de snelle 1 MHz te verminderen de tijd die nodig is voor fluorescentie imaging.
- Start time-lapse opname door te klikken op "Verwerven" knop.
- Uittreksel van eencellige sporen van luminescentie kanalen van time-lapse films door de software van de analyse van de afbeelding, als volgt. Controleer eerst luminescentie en fluorescentie stapel afbeeldingen de door afbeeldingsgegevens te importeren naar de software van de analyse van de afbeelding. Voor luminescentie afbeeldingen verwijderen hot pixels afgeleid van kosmische straling door het vergelijken van de intensiteiten van de pixels in stoffelijk aangrenzende beelden, ter vervanging van de pixelwaarden temporele berekend als het gemiddelde van de vorige en volgende frames (geïmplementeerd als "SpikeNoise Filter"), toepassing van deze verwerkte beelden op een ruimtelijk smoothing filter en achtergrond pixelwaarden van out-field uitzicht vanuit elk frame aftrekken. Vervolgens een "gebied van belang" bepalen (ROI) voor elke cel op een fluorescerende afbeelding op elk tijdstip, de ROI van toepassing op lichtgevende beelden en de verlichte intensiteit van elke ROI meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij de LightOn systeem11,12, waarmee foto-geïnduceerde genexpressie in cellen van zoogdieren, tot de studie van genetische oscillatoren met 2 - tot 3-h periodiciteit aangepast. Dit systeem bestaat uit twee delen: de foto-afleidbare transcriptionele activator hGAVPO en een UAS-promotor cassette naar station transcriptie van willekeurige genen van belang. Om te versnellen de Pulsatiele kinetiek van foto-geïnduceerde genexpressie, werd de volgorde van de polyA in de UAS-promotor cassette vervangen door lymfkliertest Hes1 3' UTR, dat de halfwaardetijd van mRNA naar 20 min in lymfkliertest fibroblasten verkort.
Om vast te stellen stabiele cellijnen, werd tri-cistronic vectoren gebaseerd op het Tol2 transposase systeem gebruikte13 (figuur 1A). De Tol2 expressie vector is essentieel voor het verbeteren van de efficiëntie van chromosomale integratie van plasmide cassettes14. Deze vectoren dragen niet alleen de cassettes van de expressie van licht-afleidbare genen gedreven door de UAS-promotor, maar ook de cassettes van de expressie van de lichtgevoelig eiwit hGAVPO en TL eiwitten (iRFP713,15 of mCherry). Dit ontwerp konden we voor het zuiveren van een bevolking van cellen die de plasmiden effectief geïntegreerd in het genoom van de gastheer.
Wij opgericht lichtgevoelig afzender cellen die Dll1 ligand eiwitten op blauwe lichte verlichting (figuur 2A produceren). Te dien einde werd een Tol2 systeem gebaseerde bi-cistronic vector (pAI218) gebruikt. Om te controleren de inductie van Dll1 ligand op lichte verlichting, werden cellen gekweekt in de incubators uitgerust met geprogrammeerde LED blauw-licht bronnen weergegeven in figuur 1B en 1 C. Representatieve resultaten van foto-geïnduceerde Dll1 eiwit expressie dynamiek gedetecteerd door Westelijke Bevlekkende analyse staan in figuur 2B en 2 C.
Om cellen die reageren op Notch signalering ingangen, gebruikten we een Tol2 systeem gebaseerde bi-cistronic vector (pAI177) uitvoering van de gedestabiliseerd luciferase verslaggever onder de controle van de promotor van de inkeping effector gen Hes1 en de fosfoglyceraat kinase (PGK) promotor gestuurde kernen-gelokaliseerde rood fluorescerende verslaggever H2B-mCherry. In dit geval is de fluorescerende verslaggever nuttig voor zowel zuivering en eencellige bijhouden in time-lapse microscopie.
Zodra de cellen van de foto-afleidbare afzender en ontvanger cellen zijn gebracht, is het klaar voor het uitvoeren van dynamische zender-ontvanger assay door mede het kweken van deze cellen (figuur 2A). In deze test, de cellen lichtgevoelig afzender die uitdrukking geven aan de inkeping ligand proteïne Dll1 op blauwe lichte verlichting waren mede gekweekte met de foto-ongevoelig ontvanger cellen die de endogene Hes1 oscillator en een bioluminescentie (verslaggever) Hes1 dragen pHes1-dLuc) (figuur 2D). De ontvanger cellen express endogeen de inkeping receptor, die inspelen op de Dll1 gepresenteerd door naburige cellen is.
Representatieve resultaten van dynamische zender-ontvanger tests worden weergegeven in figuur 2E en 2F. Om te ontdekken de dynamische reacties van ontvanger cellen met bioluminescentie opname, we eerst een live-cel controlesysteem uitgerust met een hoog-gevoelige foto-multiplier buis (PMT) voor foton-tellen en een LED blauw-licht bron voor lichte stimulatie ( gebruikt Figuur 1 d). Dit systeem staat real-time opname van bioluminescentie signalen op het bevolkingsniveau met geplande lichte verlichting. Wanneer deze twee soorten cellen werden mede gekweekt en blootgesteld aan repetitieve lichte verlichting (30 s duur, 2,5 h intervallen), werden cyclische reacties van ontvanger cellen in verschillende omstandigheden van het mengen van ratio's (figuur 2E) worden opgespoord. In dit voorbeeld, wij Savitzky-Golay filteren (4th orde en een 13 gegevenspunt venster) om te verzachten lawaaierige signalen toegepast. Time-lapse microscopie met repetitieve lichte verlichting (2 min duur, 2.75 / h intervallen) bleek ook de gesynchroniseerde reacties van cellen van de ontvanger op het niveau van de eencellige (lichtgrijze lijnen in de figuur 2F) en op het bevolkingsniveau (rode lijn in figuur 2F). deze gegevens suggereren dat de cyclische expressie van Dll1 eiwitten in cellen van de afzender voldoende om te synchroniseren van Hes1 trillingen is in het naburige cellen van de ontvanger.
Figuur 1: strategie voor het analyseren van cellulaire reacties op optogenetic verstoringen. (A) schema van representatieve plasmide vectoren voor dit protocol gebruikt. Deze plasmiden zijn beschikbaar op aanvraag. (B) een foto van een CO2 incubator voorzien van een blauwe LED-apparaat onder een 6-well cel cultuur plaat. (C) schematisch diagram van een elektrische schakeling aan de controle-macht leveren voor de LED-lichtbron door een programmeerbare micro-computer. Een solid-state relais (SSR) is ingesteld op het doorsturen aan/uit Staten van digitale PIN-out van de micro-computer aan/uit Staten van de LED lichtbron. (D) een foto en een schematische voorstelling van een live-cel bioluminescentie monitoringsysteem. Merk op dat de gemotoriseerde fase unidirectionally vanuit een positie van de opname op de bovenkant van de detector bet naar een positie van de verlichting op de bovenkant van de LED-lichtbron verplaatsen kunt. Merk ook op dat de detector bet verplaatsen kunt van goed tot goed naar signalen uit individuele putten controleren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbeelden van optogenetic perturbation experimenten. In deze voorbeelden, werden lymfkliertest C2C12 myoblast cellijnen gebruikt. (A) schema van de dynamische zender-ontvanger-bepaling. (B, C) Representatieve resultaten van licht-geïnduceerde Dll1 meningsuiting geanalyseerd door Westelijke Bevlekkende analyse. Dll1 eiwitten werden veroorzaakt door periodieke lichte verlichting met een periode van 2,5 h, 2 min duur en de intensiteit van 24.7 W/m2. (D) fluorescentie afbeelding van co cultuur systeem van de verzender en ontvanger van cellen. (E, F) Representatieve resultaten van de dynamische zender-ontvanger-bepaling. (E) tijdelijke patronen van reacties van de ontvanger opgenomen door het leven-cel monitoringsysteem uitgerust met de vervaldatum Het nummer van de cel totaal was vast aan 1.5 x 105 cellen, maar de verhoudingen tussen de afzenders en de ontvangers aan 1:2 van 5:1 werden verspreid. (F) eencellige imaging geopenbaard dat oscillerende informatie, die werd veroorzaakt door periodieke lichte verlichting (2 min duur, 2.75 / h intervallen), werd overgebracht van afzender naar ontvanger cellen. 1.5 x 105 cellen met de afzender-to-ontvanger-verhouding van 5:1 werden gebruikt. Aangepast uit Ref. 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We toonden een methode wilt besturen van gen expressie dynamiek met een frequentie van 2 tot en met 3 h. Deze tijdsschaal is veel korter dan die in andere conventionele systemen, met inbegrip van het Tet-On systeem en de oorspronkelijke LightOn-systeem. Sleutelparameters te bereiken de ultradian termijnen zijn half-leven van foto-geïnduceerde moleculaire producten, mRNAs en eiwitten. Deze kinetische parameters kunnen afhangen van celtypen en soorten. Voor het afstemmen van de kinetiek, is ter vervanging van Hes1 3' UTR sequenties met anderen een rechttoe-rechtaan manier, omdat het verandert niets aan de reeksen en de functies van eiwitten van de doelgroep. Voor het zoeken naar andere 3' UTRs verkrijgen wenselijk Pulsatiele patronen met name cellen van belang, live-cel controle van dLuc door lichte inductie is een goed uitgangspunt en gebruikt voor screening en bevestiging.
Een van de meest gestelde vragen gaat over de dagelijkse afhandeling van lichtgevoelige cellen. In het geval van de dynamische zender-ontvanger-bepaling van de inkeping signalering, konden we doen dagelijks cel passages onder kamer lichten, omdat onze systemen (foto-afleidbare dLuc of Dll1 cellen en cellen van de ontvanger) niet wijzigen van celproliferatie en snel terug te naar rust keren Staten binnen 6 uur na de cellen worden verplaatst naar een donkere voorwaarde. Indien de genen van belang zijn lot-bepaling factoren, lekkende expressie kan veroorzaken celdifferentiatie of voorkomen van uitbreidingen van de cellen, en daarom is het essentieel het instellen van een rood-licht-omgeving om te voorkomen dat ongewenste optogenetic perturbation tijdens de afhandeling van de cel.
In dit protocol presenteerden we de procedures voor het genereren van stabiele cellijnen met foto-afleidbare gen expressie cassettes. Dit is een cruciale stap om betrouwbare resultaten in de dynamische zender-ontvanger-bepaling te verkrijgen. Een voorbijgaande transfectie voor de invoering van optogenetic modules in cellen kan overwegen, maar het werkt niet goed in onze handen voor kwantitatieve metingen van ultradian pulsen. We vonden dat voorbijgaande transfectie van plasmiden, uitvoering van UAS-promotor cassettes leidt tot lekkende expressie op een relatief hoog niveau zelfs onder een donkere voorwaarde. Deze lekkende expressie zorgt ervoor dat een hoge achtergrond zonder enige lichte stimulatie en belemmert een betrouwbare meting van de tijd-cursus. Een alternatieve methode om stabiele cellen is een lentivirus systeem, dat is handig voor celtypes die niet geschikt voor Transfectie12 zijn. Klonen cellijnen presenteren homogener reacties dan heterogene cellijnen, maar zelfs in een populatie van klonen, cel reacties zijn niet altijd uniform: sommige cellen Reageer niet te licht stimulatie en daarom een gedistribueerde risiconiveaus van de licht-geïnduceerde eiwit expressie. Dit kan te wijten zijn aan variabele expressie niveaus van hGAVPO eiwit en/of variabele endogene overvloed van flavin, een chromofore vereist voor lichte sensing van hGAVPO.
Het hier gepresenteerde protocol biedt een krachtig instrument voor de analyse van gen expressie dynamiek, maar er zijn enkele beperkingen. Een nadeel is dat sommige fluorescentie kanalen voor live-cel microscopie niet compatibel met blauw-licht stimulatie zijn. Blauw-licht verlichting activeert de blauw-lichtgevoelige eiwitten maar ook fluorescerende eiwitten, met inbegrip van groene en gele fluorescerende eiwitten (GFPs en YFPs), die gevoelig zijn voor foto-bleken. Integendeel, vereist visualisatie van GFP blauw-licht excitatie, die leiden ongewenste activering van cellen lichtgevoelig tot kan tijdens het vastleggen van fluorescerende beelden. Bright-veld (fase contrast) imaging door de ambient lichtbron is ook onverenigbaar met blauw-licht optogenetic experimenten, maar een kunt dit probleem omzeilen met behulp van groene of langere golflengte lichtbronnen voor de beeldvorming.
De dynamische zender-ontvanger-bepaling zou nuttig zijn voor het onderzoeken van andere signaalroutes. Een mogelijkheid is een toepassing op afscheidende signalering van systemen. Voor dergelijke analyses is het toepassen van gezuiverde liganden in micro-fluidic apparaten een alternatieve manier om het stimuleren van de cellen van de ontvanger in een nauwkeurige temporele manier16,17. Deze benaderingen zijn echter niet toegankelijk voor dynamische productieprocessen van ligand moleculen in cellen van de afzender. De bepaling van de dynamische zender-ontvanger met foto-afleidbare ligand expressie in dienst zou verder dissectie van signaaloverdracht van afzender naar ontvanger cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door JST, PRESTO (A.I.), Core Research voor evolutionaire wetenschap en technologie (JPMJCR12W2 (R.K.)), Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (Ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT), Japan 26119708 (A.I.) en 16 H 06480 (R.K.)), wetenschappelijk onderzoek (A) (Japan Society voor de bevordering van de wetenschap (JSPS) 24240049 (R.K.)), en jonge wetenschappers (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)), en een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden "fluorescentie Live imaging"van de MEXT, Japan en Platform voor een dynamische aanpak leven systeem van de MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
