Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at analysere celle til celle overførsel af oscillerende oplysninger optogenetic kontrol og live overvågning af genekspression. Denne fremgangsmåde giver en enestående platform for at teste en funktionel betydning af dynamiske gen expression programmer i flercellede systemer.
Abstract
Celler bør reagere korrekt på tidsligt skiftende miljøer, som påvirkes af forskellige faktorer fra de omkringliggende celler. Notch signalering pathway er en af sådanne væsentlige molekylære maskineri til celle-til-celle kommunikation, som spiller vigtige roller i den normale udvikling af embryoner. Denne vej indebærer en celle til celle overførsel af oscillerende oplysninger med ultradian rytmer, men trods fremskridt i molekylærbiologiske teknikker, har det udfordrende for at belyse virkningerne af flercellede interaktioner på oscillerende gen Dynamics. Vi præsenterer her, en protokol, der tillader optogenetic kontrol og live overvågning af gen expression mønstre tidsmæssige præcist. Denne metode afslørede med held at intracellulære og intercellulære periodiske indgange af Notch signalering entrain iboende svingninger af frekvens tuning og fase skiftende den encellede opløsning. Denne fremgangsmåde gælder for analysen af de dynamiske funktioner i forskellige signaling veje, giver en unik platform for at teste en funktionel betydning af dynamiske gen expression programmer i flercellede systemer.
Introduction
Celle-til-celle kommunikation spiller en kritisk rolle i embryonale mønstre i udviklingsprocesser. Hvirveldyr embryoner udgøres de metameriske strukturer, der kaldes somites langs anterior-posterior krop akse med en præcis tidsmæssige nøjagtighed under kontrol af en tid-holder ur, kaldet segmentering uret1. Under denne proces, en gruppe af presomitic mesoderm (PSM) celler regelmæssigt omdannes til somites i en synkron måde. Denne proces indebærer synkroniserede oscillerende genekspression og PSM celler, der svinger i fase udgør de samme somites. Perioden i den oscillerende genekspression er omkring 2 til 3 timer i mus og ca 30 min i zebrafisk. Når adskilles, PSM celler mister synchrony2,3, men når de er re aggregerede, de kan selv organisere og gendanne den befolkning synchrony4, tyder på, at celle-celle kobling er en nøgle til den synkroniserede svingninger.
Omfattende indsats afslørede, at signaling molekyler i Delta-Notch pathway er tæt forbundne til synkroniserede svingninger af segmentering ur gener. Enten farmakologiske hæmmere eller genetiske mutationer af Notch signalering desynchronize befolkningen i oscillatorer. Mutanter af Notch signalering komponenter, såsom DeltaC, DeltaD og Notch1a, vist i zebrafisk, asynkron svingninger5,6. Med kylling eller mus embryoner er ikke kun Notch ligand Delta-lignende1 (Dll1), men også Notch Modulator Lunatic fringe (Lfng) påkrævet for synkroniseret svingninger7,8,9. Men det har været svært at teste den funktionelle kapacitet af sådanne molekyler til dynamisk informationsoverførsel fra celle til celle, fordi tidsmæssige resolutioner af konventionelle undertrykkelse af netbårne gen forordning dynamik ikke var tilstrækkelige til at undersøge de processer af tidsskalaer af 2-3 h (ultradian rytmer).
Vi har for nylig udviklet en integreret metode til at kontrollere og overvåge gen expression mønstre i pattedyrceller10. Denne teknologi gør det muligt for induktion af gen expression pulser af periodiske lys belysning på ultradian tid-skalaer. Denne protokol repræsenterer metoder at etablere lysfølsomme cellelinjer og observere dynamisk svar af reporter celler af live-celle luminescence overvågning i sammenhænge af celle-til-celle kommunikation. Denne metode gælder for analysen af mange andre signaling veje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generation af stabil cellelinjer af Tol2 systemet
-
Transfect plasmid vektorer (figur 1A) af Tol2-baseret optogenetic moduler sammen med transposase (Tol2) udtryk vektor (pCAGGS-mT2TP) i C2C12 celler. I alle trin, kultur celler med DMEM medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og penicillin-streptomycin ved 37 ° C (tabel 1), i nærværelse af 5% CO2, ellers betegnet.
- Tæl trypsinized celler med en celle-counter og plade 5 x 104 C2C12 celler pr. brønd i en 12-godt plade en dag før Transfektion.
- Co transfect 0.375 μg Tol2-baseret optogenetic vektorer (pAI177 eller pAI218), 0,125 μg af et stof valg vektor (pAI170) og 0,5 μg på pCAGGS mT2TP vektor ved hjælp af lipofection reagens.
- Trypsinize transfekteret celler, og plade dem i 100 mm kultur retter en dag efter Transfektion.
- Exchange næringssubstrat for transfekteret celler til næringssubstratet suppleret med 100 mg/mL hygromycin.
- Kultur celler i 3 dage for at fjerne un-transfected celler. Bemærk at medium forandring ikke er nødvendigt.
- Trypsinize transfekteret celler, og rense en befolkning af celler, der udtrykker fluorescerende proteiner for udvælgelse. For modtageren celler indstille transporterer pAI177, sortering porten til grøn-PE kanal til rensning af mCherry-positive celle befolkning. For lysfølsomt afsender celler indstille transporterer pAI218, sortering porten til APC kanal til rensning af iRFP713-positive celle befolkning.
- (valgfrit) Etablere en klonal celle population af standard metoder, såsom begrænset fortynding eller enkelt-celle sortering efter FACS.
2. evaluering af foto-følsomhed af manipulerede celler på befolkningsniveau
Bemærk: Denne del beskriver en protokol for at kontrollere dynamisk induktion af Dll1 ligand proteiner på blå-lys belysning af biokemiske assays, såsom qPCR og Western blotting.
- Opret to typer af væksthuse med eller uden lys kilder for en lys-induceret eller en mørk betingelse, henholdsvis. Set-up lys-intensitet af en blå-LEDEDE trans-illuminator, som vist i figur 1B, ved at bruge en lysmåler. Programmet tidsindstillinger og varighed af lys belysning ved at indlæse en kontrolscriptet til en single-board mikro-controller, der tillader programmerbare tidsplaner for belysning (figur 1 c).
- Tæller trypsinized celler med en celle-counter og plade 1,0 x 105 lysfølsomt afsender celler transporterer pAI218 og pAI170 på 35-mm diameter plast kultur retter (mere end 12 retter for lysforhold og 1 skål til mørke tilstand) og sæt retterne særskilte inkubatorer til mørke/lys vilkår. Efter opsætning af retter, holde døre af kuvøser lukket indtil indsamling cellelysater.
- 1,5 dage efter plating, starte lys belysning (celler forventes at blive mere end 80% sammenflydende). Ikke udsætte celler til lys til at undgå uønskede foto-stimulation.
Bemærk: Tidsplaner for belysning afhænger af formålet med eksperimenter. Bemærk, at en vedvarende belysning tilstand (fx. 1 min varighed og 10 min mellemrum med 40 µmol/m2/s lys-intensitet) er tilstrækkelig for en simpel kontrol af photo-induktion og det stærke lys belysning er skadelig for cellerne. Således sikre, at harmløse parametre for belysning er valgt. - Omkring 2 dage efter plating, forberede celle-lysate med 30-minutters intervaller. Flytte prøve retter fra inkubatorer til på is, og begynde at forberede cellelysater for yderligere analyse.
3. dynamisk afsender-modtager Assay på befolkningsniveau: Real-time overvågning af cellulære svar på optiske Stimulation af ydelse
- Trypsinize og tælle antallet af afsenderen og modtageren celler med standardmetoder. Forberede en 1 mL samlede blanding suspension af 2,5 x 104 modtager og 1,25 x 105 afsender celler (1:5 ratio).
Bemærk: 2:1, 1:1 eller 1:2 afsender-modtager nøgletal også arbejde med en cellen total antal 1,5 x 105. 10 - Plade blandet celler i hver brønd af 24-godt sorte plader med næringssubstratet indeholdende 1 mM luciferin.
- Analysere celler på Pladelæser til luciferase assay, og bekræfte at output signaler ikke er for høj for registreringssystemet.
Bemærk: Hvis output signaler er højere end 1 x 106 photon tæller/s, de kan være mættet. I så fald reducere koncentrationen af luciferin til optimale værdier, så output signaler er lavere end 1 x 106 photon tæller/s. - Sæt pladen på registreringssystemet, og starte en optagelsesprogram (fig. 1 d). For eksempel starte lys belysning på 18 h efter indstilling optagelsen.
Bemærk: Temporal filtrering, såsom detrending signaler med bevægelige gennemsnit og Savitzky-Golay filtrering, er nyttige for visualisering af wave-formularer og peak opdagelser.
4. dynamisk afsender-modtager Assay på én celle niveau: Real-time Imaging af encellede svar under kontrol af Optogenetic undertrykkelse af netbårne
- Plade 0,5 x 105 receiver og 2,5 x 105 afsender celler på 27 mm diameter glas base 35 mm diameter retter. Sikre at blande nøgletal og en total celle nummer (en celle tæthed) er korrekt justeret.
- En dag efter plating, udveksling medium med 2 mL af optagemediet (phenol-rød gratis DMEM medium suppleret med 5% FBS, penicillin-streptomycin og 1 mM luciferin), og sæt den glas-base ret på mikroskopet. Om fornødent vaskes ud snavs af døde celler med PBS (-).
Bemærk: Det er at foretrække at udføre dette trin i en mørk tilstand. - Oprette en inverteret mikroskop udstyret med en miljømæssig kammer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Oprette en afkølet CCD kamera. Sikre, at temperaturen af CCD-sensor er kølet ned til værdien destination (typisk-90 ° C).
-
Angiv parametre for "Flerdimensionel Timelapse" vinduet i automatisk erhvervelse programmel hen til fange billeder med 5 min. mellemrum og mere end 288 gange (mere end én overnatning optagelse).
- Åbne "Flerdimensionel Timelapse" vindue, Vælg luminescence kanal og en langsom 50 kHz udlæsning tilstand fra pull-down menuen og Indstil 4 x 4 binning med 4-min eksponering. Sikre, at læse-out tilstanden er indstillet til tilstanden langsom 50 kHz, som er kritiske for at reducere udlæsning støj til at opdage svagt udsender en bioluminescerende lys.
- Åbn "Flerdimensionel Timelapse" vindue, Vælg fluorescens kanaler og en hurtig 1 MHz udlæsning tilstand fra pull-down menuen og sæt 2 x 2 binning med 400 ms eksponering. Sikre, at læse-out tilstanden er indstillet til tilstanden hurtigt 1 MHz til at reducere den nødvendige tid til fluorescens billeddannelse.
- Start time-lapse optagelsen ved at klikke på "Erhverve" knappen.
- Uddrag single-celle spor af luminescence kanaler fra time-lapse film billede analyse software, som følger. Skal først luminescence og fluorescens stak billeder ved at importere billeddata til billede analyse software. For luminescence billeder, fjerne hot pixels afledt af kosmiske stråler ved at sammenligne intensiteten af pixels i tidsligt tilstødende billeder, erstatter pixelværdier til tidsmæssige gennemsnittet af de forrige og næste billeder (gennemføres som "SpikeNoise Filter"), anvende disse behandlede billeder til et rumligt udjævning filter, og fratræk baggrund pixelværdier out-field synspunkter fra hver ramme. Derefter bestemme et "interesse område" (ROI) for hver celle på en fluorescerende billedet på hvert tidspunkt, gælder ROI selvlysende billeder og måle selvlysende intensiteten af hver ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tilpasset Niels system11,12, som giver mulighed for foto-induceret genekspression i pattedyrceller til studiet af genetiske oscillatorer med 2 - 3 h hyppighed. Dette system består af to dele: foto-inducerbar transcriptional activator hGAVPO og en UAS-promotor kassette til drev transskription af vilkårlige gener af interesse. For at fremskynde den pulsatile kinetik af foto-induceret genekspression, blev polyA sekvens i UAS-promotor kassette erstattet af murine Hes1 3' UTR, som forkorter mRNA half-life til 20 min i murine fibroblaster.
For at etablere stabile cellelinjer, var tri-cistronic vektorer baseret på Tol2 transposase system brugte13 (figur 1A). Tol2 udtryk vektor er afgørende for at øge effektiviteten af kromosomale integration af plasmid kassetter14. Disse vektorer bære ikke kun udtryk kassetter af lys-inducerbar gener drevet af UAS-promotor, men også udtrykket kassetter af lysfølsomt protein hGAVPO og fluorescerende proteiner (iRFP71315 eller mCherry). Dette design tillod os at rense en befolkning af celler, der effektivt integreret plasmider i vært genomer.
Vi etablerede lysfølsomt afsender celler, der producerer Dll1 ligand proteiner ved blå lys belysning (figur 2A). Med henblik herpå, blev en Tol2 system-baseret bi-cistronic vektor (pAI218) brugt. For at kontrollere induktion af Dll1 ligand på lys belysning, blev celler dyrkes i væksthuse udstyret med programmerede LED blå lys kilder vises i figur 1B og 1 C. Repræsentative resultater af foto-induceret Dll1 protein udtryk dynamics opdaget ved Western blotting analyse er vist i figur 2B og 2 C.
For at etablere celler, der reagerer på Notch signalering indgange, brugte vi en Tol2 system-baseret bi-cistronic vektor (pAI177) transporterer destabiliseret luciferase reporter under kontrol af promotor af Notch effektor gen Hes1 og fosfoglycerat kinase (PGK) promotor-drevet kerner-lokaliseret rødt fluorescerende reporter H2B-mCherry. I dette tilfælde, er den fluorescerende reporter nyttigt for både rensning og encellede sporing i time-lapse mikroskopi.
Når foto-inducerbar afsender celler og modtager celler er oprettet, er det klar til at udføre dynamisk afsender-modtager assay ved co dyrkning af disse celler (figur 2A). I denne analyse, lysfølsomt afsender celler, der udtrykker Notch ligand protein Dll1 på blå lys belysning var Co kulturperler med foto-ufølsom modtager celler, der bærer den endogene Hes1 oscillator og en bioluminescens Hes1 reporter ( pHes1-dLuc) (figur 2D). Modtager cellerne udtrykke endogent Notch receptor, som er lydhøre over for Dll1 præsenteret af naboceller.
Repræsentative resultater af dynamiske afsender-modtager assays er vist i figur 2E og 2F. For at registrere de dynamisk svar modtager celler med bioluminescens optagelse, brugt vi første gang en live-celle overvågningssystem udstyret med en høj-følsomme foto-multiplikator tube (PMT) til foton-optælling og en LED blå-lyskilde for lys stimulation ( Figur 1 d). Dette system giver mulighed for real-time optagelse af bioluminescens signaler på befolkningsniveau med planlagte lys belysning. Når disse to typer af celler blev co kulturperler og udsat for gentagne lys belysning (30 s varighed, 2,5 h intervaller), blev cyklisk svar modtager celler påvises i forskellige betingelser for blanding nøgletal (figur 2E). I dette eksempel anvendte vi Savitzky-Golay filtrering (4th orden og en 13 datapunkt vinduet) for at dæmpe støjende signaler. Time-lapse mikroskopi med gentagne lys belysning (2 min varighed, 2,75 h intervaller) viste også de synkroniserede svar af modtageren celler i én celle niveau (grå linier i figur 2F) og på befolkningsniveau (rød linje i figur 2F). disse data tyder på, at cyklisk udtryk af Dll1 protein i afsender celler er tilstrækkelig til at synkronisere Hes1 svingninger i nabolandet modtager celler.
Figur 1: strategi til at analysere cellulære svar på optogenetic perturbationer. (A) skematisk af repræsentative plasmid vektorer bruges til denne protokol. Disse plasmider er tilgængelige på anmodning. (B) et foto af et CO2 inkubator udstyret med en blå LED under en 6-godt celle kultur plade. (C) skematisk diagram over et elektrisk kredsløb til kontrol power supply for LED lys kilde af en mikro-computer. En solid-state relay (SSR) blev sat til at relay på/off stater af digital PIN-ud af mikro-computeren til på/off stater af LED-lyskilde. (D) en foto og skematisk af en live-celle bioluminescens overvågningssystem. Bemærk, at den motoriserede Stadium kan flytte unidirectionally fra en optagelse position på toppen af ydelse detektor til en belysning position på toppen af LED-lyskilde. Bemærk også, at den ydelse detektor kan flytte fra godt til at overvåge signaler fra individuelle brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempler på optogenetic undertrykkelse af netbårne eksperimenter. I disse eksempler anvendtes murine C2C12 myoblast cellelinjer. (A) skematisk af dynamiske afsender-modtager assay. (B, C) Repræsentative resultater af lys-induceret Dll1 udtrykket analyseres ved Western blotting analyse. Dll1 proteiner var fremkaldt af periodiske lys belysning med en 2,5 h periode, 2 min varighed og intensitet af 24.7 W/m2. (D) fluorescens billede af co kultur system af afsenderen og modtageren celler. (E, F) Repræsentative resultater af dynamiske afsender-modtager assay. (E) tidsmæssige mønstre af modtager svar registreres via live-celle overvågningssystemet udstyret med restkontantrabat Cellen total antal blev fastsat til 1,5 x 105 celler, men forholdet mellem afsenderne og kuratorerne blev distribueret fra 5:1 til 1:2. (F) encellede imaging afslørede at oscillerende oplysninger, der er fremkaldt ved periodiske lys belysning (2 min varighed, 2,75 h intervaller), blev overført fra afsender til modtager celler. 1.5 x 105 celler med afsender til modtager forholdet 5:1 blev brugt. Tilpasset fra Ref. 10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viste en metode til at styre gen expression dynamics med en hyppighed på 2 til 3 h. Denne tidshorisont er meget kortere end dem i andre konventionelle systemer, herunder Tet-On-system og den oprindelige Niels. Vigtige parametre til at nå de ultradian tidsskalaer er halveringstider foto-induceret molekylære produkter, mRNAs og proteiner. Disse kinetiske parametre kan afhænge af celletyper og arter. For tuning forsvindingskinetik, er erstatter Hes1 3' UTR sekvenser med andre en straight-forward måde, fordi det ikke ændrer ved de sekvenser og funktioner af target proteiner. For at søge andre 3' UTRs at opnå ønskelige pulsatile mønstre navnlig celler af interesse, live-celle overvågning af dLuc af lys induktion er et godt udgangspunkt og anvendes til screening og validering.
En af de hyppigst stillede spørgsmål handler om den daglige håndtering af lysfølsomme celler. I forbindelse med den dynamiske afsender-modtager assay af Notch signalering, kunne vi gøre dagligt celle passager under værelse lys, fordi vores systemer (foto-inducerbar dLuc eller Dll1 celler og modtager celler) ikke ændre celleproliferation og hurtigt vende tilbage til hvile stater indenfor 6 timer efter cellerne er blevet flyttet til en mørk tilstand. Hvis gener af interesse er skæbne-bestemmelse faktorer, utætte udtryk kan fremkalde Celledifferentiering eller forhindre udvidelser af cellerne, og derfor er det vigtigt at oprette et rødt-lys miljø til at undgå uønskede optogenetic undertrykkelse af netbårne under celle håndtering.
I denne protokol præsenterede vi procedurer for at generere stabile cellelinjer med foto-inducerbar gen expression kassetter. Dette er et afgørende skridt til at opnå pålidelige resultater i den dynamiske afsender-modtager assay. Man kan overveje forbigående Transfektion for indførelsen af optogenetic moduler i celler, men det virker ikke godt i vores hænder for kvantitative målinger af ultradian impulser. Vi fandt at forbigående Transfektion af plasmider transporterer UAS-promotor kassetter fører til utætte udtryk på et relativt højt niveau selv under en mørk tilstand. Denne Utætte udtryk forårsager en høj baggrund uden nogen lys stimulation og hæmmer en pålidelig måling af tid-kursus. En alternativ metode til at etablere stabile celler er en lentivirus system, som er nyttige for celletyper, der ikke er egnet til Transfektion12. Klonede cellelinjer præsentere mere homogene svar end heterogene cellelinjer, men selv i en klonal befolkning, celle svar er ikke altid ensartet: nogle celler ikke reagerer lys stimulation-og derfor præsentere en distribueret niveauer af lys-induceret protein udtryk. Dette kan være på grund af variable udtryk niveauer af hGAVPO protein og/eller variabel endogene overflod af flavin, en farvelegeme kræves til lys sansning af hGAVPO.
Protokollen præsenteres her sørger et kraftfuldt værktøj til analyse af gen expression dynamics, men der er visse begrænsninger. En ulempe er, at nogle fluorescens kanaler til live-celle mikroskopi ikke er kompatibel med blåt-lys stimulation. Blåt-lys belysning aktiveres ikke kun de blå-lysfølsomme proteiner, men også fluorescerende proteiner, herunder grøn og gul fluorescerende proteiner (GFPs og YFPs), som er modtagelige for foto-blegning. Tværtimod, kræver visualisering af normal god landbrugspraksis blåt-lys excitation, der kan udløse uønsket aktivering af foto-følsomme celler under fluorescerende optagelse. Bright-felt (fase-kontrast) imaging af omgivende lyskilden er også uforenelig med blåt-lys optogenetic eksperimenter, men man kan omgå dette problem ved hjælp af grøn eller længere bølgelængde lys kilder for billeddannelse.
Dynamisk afsender-modtager assay ville være nyttige for at undersøge andre signaling veje. En mulighed er et program til at udskille signalering systemer. For sådanne analyser er anvende renset ligander i mikro-fluidic enheder en alternativ måde at stimulere modtager celler i en tidsmæssig præcist16,17. Men disse tilgange er utilgængelige for dynamisk produktionsprocesser af ligand molekyler i celler, afsender. Anvender dynamiske afsender-modtager assay med foto-inducerbar ligand udtryk ville tillader yderligere dissektion af signaltransmission fra afsender til modtager celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af JST, PRESTO (AI), Core forskning for Evolutional videnskab og teknologi (JPMJCR12W2 (Lisbeth)), licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (Undervisningsministeriet, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT), Japan 26119708 (AI) og 16 H 06480 (Lisbeth)), videnskabelig forskning (et) (Japan samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) 24240049 (Lisbeth)), og unge forskere (A) (JSP'ER 15 H 05326 (AI)), og en licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder "fluorescens Live imaging"MEXT, Japan og Platform for dynamiske tilgange til levende System fra MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O.
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
