Agrégation de récepteur de Surface cellulaire microscopie confocale révèle par spectroscopie de corrélation d’Image

Summary

Anticorps qui se fixent à des récepteurs sur la surface de la cellule cible peuvent conférer conformation et altérations clusters. Ces changements dynamiques ont des implications pour caractériser le développement des médicaments dans les cellules cibles. Ce protocole utilise la microscopie confocale et spectroscopie de corrélation d’image par le biais de ImageJ/Fidji pour quantifier l’ampleur du récepteur clustering sur la surface de la cellule.

Abstract

Microscopie confocale fournit une méthodologie accessible pour capturer les interactions subcellulaires critiques pour la caractérisation et le développement d’agents précliniques marquées avec des sondes fluorescentes. Avec des avancées récentes en anticorps cytotoxique vecteurs, comprendre les altérations induites par ces agents dans le domaine de l’agrégation des récepteurs et l’internalisation est d’une importance cruciale. Ce protocole s’appuie sur la méthodologie bien établie de l’immunocytochimie fluorescent et la distribution de Fidji open source d’ImageJ, avec son autocorrélation intégrée et des fonctions mathématiques d’image, pour effectuer la corrélation d’images spatiales spectroscopie (ICS). Ce protocole quantitates l’intensité de fluorescence des récepteurs étiquetées en fonction de la zone de la poutre du microscope confocal. Ceci fournit une mesure quantitative de l’état d’agrégation de molécule cible sur la surface de la cellule. Cette méthodologie est axée sur la caractérisation des cellules statiques avec un potentiel d’enquêtes temporelle de l’agrégation des récepteurs. Ce protocole présente une méthodologie accessible pour fournir la quantification du regroupement des événements qui se produisent à la surface cellulaire, utilisant bien mis en place des techniques et des appareils d’imagerie non spécialisés.

Introduction

Le développement d’anticorps thérapeutiques a montré un succès remarquable dans le traitement des tumeurs multiples types¹. Les progrès récents des conjugués anticorps-médicament (ADC) comme les mécanismes de prestation pour les composés cytotoxiques a élargi les conditions requises pour comprendre la dynamique des interactions entre les anticorps : récepteurs à la cellule de surface². Après le succès de ciblage d’un anticorps dirigé contre le récepteur de surface cellulaire, ces complexes peuvent induire des patrons d’agrégation semblables à celles observées dans d’interactions ligand : anticorps³. Altérations dans l’agrégation des récepteurs peuvent induire des modifications de la membrane et le résultat dans l’internalisation du récepteur et son retrait de la surface de la cellule. Dans le contexte d’un conjugué d’anticorps-médicament, ce processus libère ensuite la charge cytotoxique dans les endosomes intériorisée et par la suite le cytoplasme, entraînant dans la mort cellulaire efficace.

Microscopie confocale a fourni un moyen efficace de visualiser ces interactions importantes des anticorps et leur cible les récepteurs⁴. Pour explorer les changements de l’agrégation de la molécule cible à la surface cellulaire ce protocole utilise le post-traitement des images de microscopie confocale par une image spatiale corrélation spectroscopie (ICS) technique ^5,6,7 .

La Fondation de la spectroscopie de corrélation d’image est l’observation que les fluctuations d’intensité de fluorescence spatiale partagent une relation à l’état de densité et de regroupement des structures étiquetées. Cette relation est établie suivant le calcul d’une fonction d’autocorrélation spatiale d’une image capturée⁵.

Toutes les variantes de la spectroscopie de corrélation d’image exigent le calcul d’une autocorrélation d’image. Il est suivi en ajustant cette fonction à une courbe gaussienne bidimensionnelle pour extraire des paramètres d’État agrégation quantitative contenue dans l’image. En termes simples le calcul d’une autocorrélation d’image consiste à comparer toutes les paires possibles pixel contenu dans une image et en calculant la probabilité que les deux tout aussi aussi brillant que l’autre. C’est visualisé en fonction de la distance et directions de pixel séparation⁸.

Le cadre théorique pour la spectroscopie de corrélation d’image a été établi et défini par Petersen et Wiseman et coll.. ^{5 , 6}. dans le présent protocole, les calculs de l’autocorrélation sont effectuées en Fidji/ImageJ comme une application de tableur, la base de la fonction d’autocorrélation spatiale intensité fluctuation peut être décrit comme (Eq 1):

     

où F représente la transformation de Fourier ; F⁻¹ l’inverse de Fourier transform ; F * son conjugué complexe ; et le décalage spatial variables ε et η. Dans ICS spatiale, comme décrit dans le présent protocole, la fonction d’autocorrélation peut être calculée à l’aide d’un 2D fast Fourier transform algorithm^7,9. L’autocorrélation à zéro séparation spatiale, autrement connue comme zéro lag, g₁₁(0,0), fournit l’inverse nombre moyen de particules présentes par surface de faisceau du microscope. Il peut être obtenu en installant la fonction d’autocorrélation spatiale d’une fonction gaussienne bidimensionnelle (Eq 2):

     

Comme les pixels capturés dans une image sont contenus dans une zone définie et ces mesures ne s’étendent pas à l’infini, le terme g∞ est utilisé comme une compensation pour tenir compte des corrélations spatiales à longue distance, contenues dans l’image. Pour les agrégats moléculaires taille, ω est la fonction de point-propagation du microscope et décrite par la pleine largeur à moitié-maximum de la fonction d’autocorrélation spatiale. La zone comprise dans la fonction de point de répandre de l’instrument peut être étalonnée à l’aide de perles fluorescentes sous résolution.

Pour l’image corrélation spectroscopie protocole décrit ci-après, l’autocorrélation et fonctions mathématiques doit remplir l’ICS sont effectuées à l’aide de la plate-forme d’imagerie-traitement de l’open source, Fidji¹⁰, une distribution de la ImageJ programme^11,12. Fidji/ImageJ utilise le Fourier rapide préinstallée dans la fonction FFT Math. Cette fonction permet de réduire le temps de calcul requis de ce calcul en réduisant l’éventail des données par un facteur de deux dans chaque dimension¹³. Comme la fonction d’autocorrélation 2D est approximativement symétrique en x, axe y, une parcelle de profil de ligne unique à travers l’image de l’autocorrélation peut être utilisée pour mesurer l’autocorrélation brute en fonction du GAL spatiale. N’importe quel bruit de zéro lag est supprimé avant le calcul plus loin, à l’amplitude résultante de l’autocorrélation (valeur de crête, g(0)_T) corrigé pour le fond avec l’expression (Eq 3):

     

où j’ai_b est l’intensité moyenne d’une région de fond, à l’exclusion de la cellule. La densité de cluster, ou la densité des objets fluorescents, est définie par (Eq 4):

    

Dans le protocole décrit ci-après, nous avons plus simplement le calcul de la densité de cluster (CD), avec l’hypothèse fondée sur l’observation selon laquelle une fonction d’autocorrélation normalisée décroîtra à une valeur approchante 1.0 avec l’augmentation de décalage spatial. Avec un décalage spatial maximal, il y a non plus aucune corrélation de fluorescence valeurs d’intensité et donc sans une corrélation les calculs dans cette région sont calcul de la valeur d’une intensité multipliée par l’intensité qui est ensuite divisée par le la place de cette intensité, qui, par définition, est égale à 1.0. Ainsi, la densité d’une fonction d’autocorrélation normalisée cluster peut être calculée en soustrayant 1.0 de la fonction d’autocorrélation normalisée avant de prendre sa réciproque (Eq 5):

     

Étalonnage supplémentaire de la région de faisceau peut être effectuée afin de quantifier le nombre de clusters contenus dans le domaine de la fonction point de répandre de l’instrument. Cet étalonnage doit être effectué en utilisant les mêmes conditions optiques utilisées lors de l’analyse de la spectroscopie de corrélation d’image.

Protocol

1. ensemencement des lignées de cellules adhérentes d’imagerie Experiment

1. 10 000 cellules de carcinome épidermoïde A431 par puits pendant la nuit (O/N) à 300 µL de médias de Modified Eagle Medium/nutriments mélange F-12 (DMEM/F-12) de Dulbecco contenant 10 % de graines sérum de veau fœtal, 1 % la pénicilline-streptomycine et 1 % GlutaMAX dans un 8 chambré imaging diapositive adapté aux lentilles d’objectif haute résolution huile d’immersion (p. ex., NuncTM Lab-TekTM lamelles compartimentées).
2. Stimuler l’agrégation des récepteurs sur les cellules A431 additionné de 100 ligand d’EGF ng/mL dans les médias pendant 10 min à température ambiante (RT).

2. primaire d’anticorps Incubation

1. Retirer et laver les cellules avec 300 µL d’une solution saline tamponnée au phosphate de température ambiante (RT) (solution de 1 PBS x) deux fois.
2. Fixer les cellules avec 200 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
   NOTE : Afin d’étudier les changements temporels de l’agrégation de la cible, cette étape de fixation doit être omise.
3. Retirez les PFA et laver les cellules avec 300 µL de PBS de la température ambiante.
4. Incuber les cellules avec 200 µL de PBS contenant l’anticorps primaire à une concentration de 10 µg/mL pendant au moins 2 h à 4 ° C.
   NOTE : Pour les calculs de ICS être valides, tous les récepteurs présents à la surface de la cellule doivent être étiquetés avec l’anticorps primaire. Cela nécessite des expériences préliminaires avec une série de dilution de chaque anticorps primaire (01:10, 01:50, 1/100, 1 : 200, 1/500 1 / 1 000, etc.) à réaliser. Concentration en anticorps primaire optimale est déterminée grâce à l’analyse de l’intensité de la fluorescence par rapport à la densité de cluster. La concentration principale sélectionnée se produit lorsque la densité de la grappe des plateaux avec augmentation des concentrations d’anticorps primaire avant une nouvelle augmentation en densité de cluster en raison de la liaison des anticorps non-spécifiques. L’anticorps primaire peut être diluée dans des médias libres sériques si vous effectuez une expérience d’imagerie temporelle.
5. Issue de la période d’incubation désiré, laver les cellules avec 300 µL de PBS de RT.
6. Bloquer l’échantillon avec 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS pendant au moins 2 h à 4 ° C.
   NOTE : Échantillons fixes sont régulièrement bloqués toute la nuit (O/N) à 4 ° C.

3. secondaires anticorps Incubation

1. Préparation d’un stock de 10 µg/mL de fluorescent étiquetée anticorps secondaire (p. ex. Alexa Fluor 488 IgG) dans du PBS. 2 µg/mL de Hoechst 33342 peuvent figurer dans cette dilution permettant la découverte d’échantillons améliorés sur le microscope.
   Remarque : Pour des expériences de Time-lapse, PBS peuvent être échangés contre des médias libres sériques.
2. Enlevez 5 % BSA/PBS des cellules et incuber avec la solution d’anticorps secondaire pendant 2 h à 4 ° C, tout en protégeant les échantillons de la lumière ambiante.
3. À la fin du temps d’incubation anticorps secondaire, laver les cellules avec 300 µL de PBS (deux fois) et conserver à 4 ° C, protéger de la lumière ambiante.
4. Pour empêcher l’évaporation, envelopper les bords de la diapositive de chambre avec du parafilm.

4. confocal Microscopy d’échantillons

Remarque : Les paramètres utilisés pour l’analyse confocale vont dépendre de l’équipement et des fluorophores utilisés dans l’expérience individuelle. Les instruments confocal modernes fournissent des mécanismes pour enregistrer tous les paramètres d’imagerie utilisées pour l’expérience dans le format de fichier d’image native de l’instrument. Il est important que ces paramètres sont enregistrés afin de fournir à la réplication appropriée des conditions expérimentales à travers différentes périodes d’acquisition de données.

1. Au cours de l’imagerie de signaux fluorescents, éviter la sursaturation. Utiliser un regard de l’image vers le haut de tableau qui fournit une représentation en fausses couleurs de saturation de pixel et réduire le gain de détecteur et puissance du laser en conséquence. Instruments confocal de plus incluent un paramètre « voyant » ou une option analogue dans le logiciel d’acquisition pour cela.
2. Minimiser l’exposition du fluorophore d’intérêt pour la puissance du laser. L’utilisation d’une tache de marquage ADN telles que Hoechst 33342 fournit un mécanisme simple pour détecter et positionner l’échantillon dans le champ de vision avant le prélèvement.
3. Effectuer l’analyse initiale de l’échantillon à une résolution faible et si le logiciel permet une rapide vitesse de numérisation. Vous limiterez ainsi le photoblanchiment possible de l’échantillon.
4. Augmenter la résolution de capture et de ralentir la vitesse de balayage lorsque vous êtes prêt à recueillir des données de l’image.
5. Si l’instrument confocale permet, collecter des données à l’aide d’un photon mode comptage.
   Remarque : Si le comptage de photon n’est pas disponible sur l’instrument : niveaux de gris soient linéaires au cours de l’acquisition d’images.
6. Définissez le sténopé pour chaque ligne de laser utilisé pour 1 unité aérée (UA).
7. Ligne ou cadre en moyenne au cours de l’acquisition d’images (x4) pour réduire le détecteur associée bruit.
   Remarque : Dans cette variante de l’ICS comme seul temps-point est capturé temps d’acquisition n’est pas expérimental facteur limitant.
8. Pour l’image sélection de collection un fort grossissement, objectif de forte ouverture numérique, notamment un objectif Plan-Apochromat, pour fournir la résolution maximale et la correction des aberrations chromatiques et sphériques (exemples : Plan-Apochromat 100 X ou 63 X /1.40 Objectifs de l’huile).
9. Suréchantillon la taille des pixels contenus dans l’image capturées. Il est recommandé à chaque pixel capturer une région de 50 x 50 nm. Pour ICS efficace, taille de pixel doit être inférieure à 0,1 x 0,1 µm² par pixel. Ceci est réalisé par une combinaison de zoomer pour balayer une zone relativement restreinte et en sélectionnant un format d’image relativement grand (par exemple 1024 x 1024 ou 2048 x 2048 pixels).
10. Se concentrer sur la surface apicale ou basale de la cellule dans une région aussi plate que possible. Plusieurs cellules peuvent être collectées dans les régions d’intérêt traités individuellement au cours de l’analyse de l’ICS et une seule image.
11. Capture d’une région de fond libre de cellule en utilisant les mêmes paramètres de l’instrument à utiliser pour la normalisation de l’échantillon.

5. calcul de la spectroscopie de corrélation d’Image

Remarque : La plate-forme open-source-traitement de l’imagerie, Fidji, une distribution du programme ImageJ, est nécessaire pour effectuer l’autocorrélation et fonctions mathématiques essentielles à ICS. Cette distribution de ImageJ est recommandée car il comprend de nombreux plugins préinstallés et une architecture plus facile de mise à jour qui peut effectuer des opérations à travers de multiples expériences d’imagerie.

1. Installez le programme Fidji (http://fiji.sc/Downloads).
2. Charger les ensembles de données acquises.
3. Indiquez la région apicale ou carcinome baso-cellulaire de surface membranaire des intérêts et des duplicata de taille de pixel de 2ⁿ (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). « Menu : Image > Dupliquer... »
4. Calculer l’intensité moyenne de la zone recadrée d’intérêt « Menu : analyser > mesures. »
5. Identifier une zone de fond et de reproduire à la même taille de pixel de la membrane de surface cellulaire capture (2ⁿ: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). « Menu : Image > Dupliquer... »
6. Calculer l’intensité moyenne de l’arrière-plan recadrée domaine d’intérêt. « Menu : analyser > mesures. »
7. Soustraire l’intensité moyenne de l’arrière-plan de l’image contenant la région d’intérêt. « Processus > Calculatrice d’Image > soustraire. »
8. Effectuer le calcul de l’autocorrélation. Ce calcul est contenu dans la Structure de Menu : « processus > ttf > FD Math. »
   1. Dans le calcul de la FD sélectionner de la boîte de dialogue : Image 1 : nom de l’Image recadrée, opération comme corrélation, Image 2 : nom de l’Image recadrée, la transformation Inverse.
9. Normaliser l’image obtenue en divisant par le nombre total de pixels. « Menu : processus > mathématiques > diviser... » (c'est-à-dire: 64 x 64 pixels = 4096)
10. Normaliser à nouveau en divisant par l’intensité moyenne de le normalisée recadrée zone au carré. « Menu : processus > mathématiques > diviser... »
    NOTE : Ceci est possible en divisant l’image par la valeur d’intensité moyenne, deux fois.
11. Tracez une ligne grâce à la fonction de point propagation.
12. Tracer le profil de cette ligne pour calculer la valeur de crête. « Menu : analyser > tracer le profil. »
13. Calculer les grappes par zone de faisceau par le transfert de la valeur de crête (résultat de 5.12) dans une feuille de calcul et d’effectuer le calcul suivant (Eq 6) :
    

6. traitement des datasets ICS des lots

Remarque : La création d’une macro de Fidji/ImageJ est recommandée pour répliquer les procédures décrites dans le protocole ci-dessus. Cela permet l’analyse cohérente et rapide de plusieurs fichiers d’images au cours de l’analyse de la spectroscopie de corrélation image.

1. Mettre en place un workflow ICS macro en enregistrant chaque commande de menu dans le protocole ICS
   « Menu : Plugins > Macros > Record... ».
2. Sélectionnez « Créer » pour créer la Macro.
3. Sélectionnez « langue > IJ1 Macro. »
4. Enregistrez la Macro.
5. Ajouter les boîtes de dialogue aux diverses étapes de la macro, fournissant des rappels aux opérateurs de chaque fonction. Boîtes de dialogue servent également de méthode pour interrompre le processus d’analyse pour permettre les sélections appropriées à effectuer avant la poursuite de la procédure (c'est-à-dire la région de recadrer)
   1. Boîte de dialogue Macro Code
      titre = « Titre de la boîte dialogue » ;
      MSG = « Dialogue boîte/protocole étape Message » ;
      waitForUser (titre, msg) ;
      Remarque : Les économies additionnelles peuvent être établies en vous inscrivant sur le site de mise à jour de BAR au sein de l’Updater de Fidji (Instructions https://imagej.net/BAR). Cette disposition offre Fidji « une collection de Routines largement Applicable » ¹⁴. Une telle routine est de trouver des pics. Structure du menu : « BAR > analyse de données > Find pics. » Ce script fournit que moyen rapide de calculer que la valeur de crête dans le profil du point spread function.

7. Protocole Extensions : Calcul de superficie de faisceau de Microscope

Remarque : La fonction de transfert optique du microscope s’assure que les objets même moléculaire taille apparaissent sous forme d’images avec un rayon d’environ 200-300 nm dans le plan x-y. Le protocole ICS permet la détermination de la fonction de point-propagation en effectuant les étapes 4 et 5 sur perles fluorescentes sous résolution. Plus précisément :

1. Monter sous résolution (i.e. < 100 nm de diamètre) perles fluorescentes sur un 8 chambre diapositive d’imagerie.
2. Perles d’image selon le protocole décrit à l’aide de microscope confocal utilisé pour des expériences de l’ICS.
3. Calculer la fonction ICS de l’image résultante comme par les Etapes protocole 5.1-5,13.
4. Du profil tracé, calculer le rayon de faisceau (r) comme la largeur totale à une valeur maximale de la moitié de la fonction ICS.
5. Calculer l’aire du faisceau (BA) (Eq 7) :

8. Protocole Extensions : Calcul des grappes par unité de surface

1. Calculer la densité de cluster (CD) par unité de surface (Eq 8) :
   
   
2. Diviser les clusters surfacique de faisceau (résultat de 5.13) par la zone de la poutre (résultat de 7,5).

Representative Results

Une expérience de spectroscopie de corrélation d’image réussie dépend de la bonne application des contrôles de traitement. Ces groupes de traitement comprennent l’examen de la fluorescence dans aucun anticorps primaire et aucun groupe de traitement d’anticorps secondaire. Une fois les réglages optimum laser confocale sont établies pour une expérience, les images doivent faire parties de ces groupes de contrôle pour confirmer l’absence de fluorescence non spécifiques au sein de l’échantillon. De nombreuses lignées cellulaires de cancer adhérentes, l’identification des régions pour ICS est limitée par le manque de surfaces planes. Ceci est compensé par la possibilité de capturer un grand champ de vision des multiples cellules cancéreuses dans une seule image confocale. Cela permet de générer l’échantillonnage requis pour effectuer des comparaisons statistiques entre les groupes de traitement.

Dans cette expérience de représentant, les cellules de carcinome épidermoïde positive A431 EGFR, sont stimulées avec 100ng/mL du ligand EGF pendant 10 min à température ambiante pour induire l’EGFR clustering. Analyse de l’ICS a été réalisée sur les deux FEM stimulée (Figure 1 a) et des cellules (Figure 1) non stimulées après incubation avec l’EGFR ciblant l’anticorps monoclonal humanisé, le cetuximab. Par la suite, une récolte de 64 x 64 pixels d’une région (boîte jaune) contenue dans la membrane cellulaire (Figure 1 b et 1E) ont été traitées en utilisant la fonction d’autocorrélation figurait dans le programme de traitement d’images open source, Fidji. Cette image d’autocorrélation obtenue a été normalisée en soustrayant la fluorescence de fond avant de diviser par deux le carré de l’intensité moyenne de la région normalisée d’intérêt comme le carré du nombre de pixels dans la région rognée ( Figure 1 et 1F). L’outil de ligne de fonction a été utilisé pour tracer le profil de la fonction de point-propagation de cette image (Figure 1 et 1 H). La valeur maximale de ces profils ont été transposées à une application de tableur pour traitement des données. Une macro de Fidji a été générée pour répliquer ces étapes de traitement de Fidji pour un traitement rapide d’une série de cellules (n = 6) des deux groupes de traitement après le cetuximab immunocytochimie (Figure 1I). Dans cette expérience, le récepteur de l’EGFR a été identifié en grappes de 5,84 ± 0,85 surfacique du faisceau sur la surface de l’A431 cellules stimulées contre 14.94 ± 1,62 clusters surfacique de faisceau dans les populations de cellules non stimulées. En supposant que les conditions expérimentales utilisées pour ce roulement de récepteur rapide analyse limite, la densité de cluster EGFR dans les cellules A431 stimulées a diminué de 2.56-fold. Lorsque des conditions sont comparées pour l’état d’agrégation de la molécule cible même dans des conditions lorsque cible molécule roulement est limité, un nombre de grappes par zone de faisceau inférieur indique l’agrégation de cible accrue. Après l’agrégation d’EGF EGF ligand stimulation augmente 2.56-fold comme prévu dans ce système. La génération d’une macro de Fidji en suivant les étapes décrites dans le présent protocole permet la comparaison statistique des traitements variés ou de différences environnementales et de leurs effets sur l’agrégation des récepteurs.

Figure 1 : spectroscopie de corrélation d’Image pour détecter fluorescent étiqueté grappes sur la surface des cellules cancéreuses adhérentes. Image de microscopie confocale d’EGF représentant stimulée (A) ou (D) non stimulées A431 adhérentes cellules carcinome épidermoïde marquées avec des anticorps primaire cetuximab ciblant le récepteur EGFR surface de cellule avec Alex Fluor 488 secondaire anticorps. Cellules stimulées ont été traités avec 100 ng/mL EGF pendant 10 min à température ambiante pour induire l’EGFR regroupement avant la fixation et l’immunocytochimie. Membrane cellulaire contenant zones cadrées (boîte jaune) avec des dimensions en pixels (64 x 64 [2ⁿ]) ont été utilisés pour effectuer des analyses de l’ICS (B et E). Après normalisation de la fonction d’autocorrélation à Fidji/ImageJ, l’outil en ligne (jaune) fut utilisé pour mesurer la fonction point propagation (C et F) le profil de cette fonction de ligne est tracé pour détecter la valeur de crête (G et H ). Stimulation de l’EGF est observée pour induire une diminution de 2.56-fold détecté EGFR grappes par faisceau zone 5,84 ±0.85 comparée à 14,9 5±1.62 aux cellules non stimulées (n = 6) (I). Avec la prise en charge, les conditions expérimentales utilisées dans cette analyse un nombre constant de récepteurs de la membrane cellulaire, cela représente une augmentation en agrégation EGFR, suite à la stimulation de l’EGF. Barres d’échelle = 10 µm (A et D) ; 1 µm (B-C et E-F). Zone de terrain affiché à l’aide de Tukey Style avec moustaches représentant les valeurs minimales et maximales observées ne dépasse pas 1,5 × intervalle interquartile (IQR). Grappes par faisceau zone ± écart-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La technique de spectroscopie de corrélation d’image (ICS) que nous décrivons dans ce protocole utilise des microscopes confocaux standards sans besoin de détecteurs spécialisés. La technique ICS décrite applique des méthodes immunocytochimie bien établi à fournir pour l’échantillonnage rapide de multiples conditions de traitement pour l’analyse statistique accrue. Cette méthodologie fait avec une légère réduction de précision absolue par rapport aux techniques alternatives molécule unique basé sur la corrélation entre les fluctuations de la fluorescence des molécules mobiles diffusant à travers un volume confocal, comme la fluorescence corrélation de spectroscopie (FCS)¹⁵. L’approche plus spécialisée de la FCS exige également des photons de haute sensibilité comptant des détecteurs tels qu’avalanche photodiode (APD) ou GaAsP détecteurs avec un logiciel spécialisé dédié qui n’est pas systématiquement disponible sur instruments confocal standards. Une analyse exhaustive de la fidélité d’ICS déterminé cette technique permet de mesurer avec précision le nombre de clusters où > 1 particule est présente dans le foyer du faisceau du laser scanning microscope⁷.

La collection d’images fluorescentes appropriés est d’une importance cruciale pour une analyse réussie des ICS. La région d’intérêt doit contenir un haut rapport signal sur fond fluorescent avec laser et gagner des intensités ajustées pour supprimer toute saturation du signal. La région cellulaire capturée doit être suréchantillonnée avec une taille de pixel d’environ 50 nm. Cette région doit être homogène, avec une attention minutieuse payée pour éviter des bords cellulaires ou jonctions qui peuvent augmenter les artefacts dans le calcul de l’autocorrélation. L’un des principaux pièges d’une approche de l’ICS est la sensibilité aux surfaces cellulaires hétérogènes. Ainsi, limiter la région capturée à la surface plane maximale, quelle que soit la forme des cellules améliorera la précision de toute analyse d’ICS.

Plusieurs modalités d’imagerie ont été explorées pour étudier l’agrégation des complexes du récepteur. Microscopie électronique (me) évalue à haute résolution spatiale d’agrégation de la protéine mais opère sous vide très poussé et n’est pas applicable aux études nécessitant une résolution temporelle. EM est en outre limitée car sa préparation de l’échantillon rigoureux est prohibitive pour la vie tissu enquêtes⁵. Pour surmonter les limitations inhérentes de la résolution de la microscopie confocale standard, transfert d’énergie Förster (FRET) peut être utilisée pour calculer l’organisation spatiale des structures marquées avec chevauchement des paires de fluorophores donneur et accepteur¹⁶ . Malgré sa sensibilité, frette ne prévoit pas cependant d’informations concernant la taille des agrégats sous enquête⁶. Le développement de diverses méthodes de microscopie de fluorescence Super-résolution offrent des possibilités intéressantes pour résoudre les objets cellulaires n’est pas possibles avec la résolution standard des méthodes confocal^17,18. Les frais et les compétences requises de ces technologies et instruments, limite leur disponibilité actuelle de banal.

Avec l’augmentation de sensibilité et une faible toxicité-photo en instrumentation confocale, spectroscopie de corrélation d’image peut être étendue afin d’explorer les changements temporels de l’agrégation des récepteurs dans les cellules vivantes dans des expériences de Time-lapse. Cela peut être juxtaposée avec l’augmentation de la puissance du laser utilisée pour induire délibérément photo blanchiment des échantillons individuels avec évaluation subséquente de ICS (pbICS) de distinguer l’agrégation d’ordre supérieur présente dans certains récepteurs complexes⁹. Une autre adaptation, spectroscopie de corrélation croisée image (CIEC) fournit une analyse de la co-localisation des deux protéines membranaires basé à travers l’analyse des couples d’images pour chaque protéine fluorescent étiquetés¹⁹. La force de cette méthode de spectroscopie de corrélation d’image est qu’elle s’appuie sur des techniques bien établies dans le domaine et fournit une canalisation librement disponible de l’analyse quantitative des événements très dynamiques qui se produisent à la membrane cellulaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG