Konfokal mikroskopi afslører celle overflade Receptor sammenlægning gennem billedet korrelation spektroskopi

Summary

Antistoffer, der binder til at målrette receptorer på cellens overflade kan tillægge kropsbygning og klyngedannelse ændringer. Disse dynamiske ændringer har konsekvenser for kendetegner stof udvikling i target-cellerne. Denne protokol udnytter Konfokal mikroskopi og billede korrelation spektroskopi gennem ImageJ/FIJI at opgøre omfanget af receptor klynger på cellens overflade.

Abstract

Konfokal mikroskopi giver en tilgængelig metode til at fange subcellulære interaktioner kritisk til karakterisering og videreudvikling af prækliniske agenter mærket med fluorescerende sonder. Med de seneste fremskridt i antistof baseret cytotoksiske medicin er leveringssystemer, forstå de ændringer, der er fremkaldt af disse agenter i realm af receptor sammenlægning og internalisering af afgørende betydning. Denne protokol udnytter den veletablerede metode af fluorescerende immuncytokemi og open source FIJI distribution af ImageJ, med dens indbyggede autokorrelation og billede matematiske funktioner, til at udføre fysisk billede korrelation spektroskopi (ICS). Denne protokol quantitates fluorescerende intensiteten af mærket receptorer som en funktion af området stråle af en Konfokal mikroskop. Dette giver en kvantitativ måling af target molekyle sammenlægning sundhedstilstand på cellens overflade. Denne metode er fokuseret på karakterisering af statisk celler med potentiale til at udvide til tidsmæssige undersøgelser af receptor sammenlægning. Denne protokol udgør en tilgængelig metode til at give kvantificering af klyngedannelse hændelser, som forekommer på celleoverfladen, udnytte godt etableret teknikker og ikke-specialiserede imaging apparater.

Introduction

Udviklingen af terapeutiske antistoffer har vist bemærkelsesværdige succes i behandling af flere tumor typer¹. De seneste fremskridt for antistof-drug konjugater (ADC) overflade som gennemførelsesmekanismer for cytotoksiske stoffer har udvidet krav for at forstå dynamikken i antistof: receptor interaktioner på cellen². Efter den vellykkede målretning af et antistof til celle overflade receptor, kan disse komplekser fremkalde lignende sammenlægning mønstre til dem, der observeres i ligand: antistof interaktioner³. Ændringer i receptor sammenlægning kan fremkalde ændringer i membranen og resultat i internaliseringen af receptor og dens fjernelse fra cellens overflade. Inden for rammerne af en antistof-drug konjugat udgivelser denne proces efterfølgende cytotoksiske nyttelast i internaliseret endosomes og efterfølgende cytoplasma, hvilket resulterer i effektiv celle drab.

Konfokal mikroskopi har givet et effektiv middel til at visualisere disse vigtige interaktioner af antistoffer og deres mål receptorer⁴. For at undersøge ændringer af sammenlægning af target molekyle på celleoverfladen udnytter denne protokol efterbehandling af konfokalmikroskopi billeder via en rumlig billede korrelation spektroskopi (ICS) teknik ^5,6,7 .

Grundlaget for billede korrelation spektroskopi er den observation at rumlige fluorescens intensitet udsving deler en relation til tilstanden tæthed og sammenlægning af mærket strukturer. Dette forhold er etableret efter beregning af en rumlig autokorrelation funktion af en fanget billed⁵.

Alle varianter af billede korrelation spektroskopi kræver beregning af et billede autokorrelation. Dette er efterfulgt af montering denne funktion til en todimensional Gaussisk kurve til udvinding af kvantitative sammenlægning stat parametre indeholdt i billedet. I enkle vendinger beregningen af et billede autokorrelation indebærer sammenligne alle de mulige pixel par indeholdt i et billede og beregning af sandsynligheden for at begge lige så lyse som hinanden. Dette er visualiseret som funktion af afstanden og retninger af pixel adskillelse⁸.

Den teoretiske ramme for billede korrelation spektroskopi var etableret og defineret af Petersen og Wiseman mfl. ^{5 , 6}. i denne protokol, autokorrelation beregningerne udføres i Fiji/ImageJ samt et regnearksprogram, grundlaget for intensitet udsving rumlige autokorrelation funktion kan betegnes som (Eq 1):

     

hvor F repræsenterer Fouriertransformation; F¹ inverse Fourier transform; F * dens komplekse konjugation; og den rumlige lag variabler ε og η. I rumlige ICS, som beskrevet i denne protokol, kan funktionen autokorrelation beregnes ved hjælp af en 2D fast Fourier transform algoritme^7,9. Autokorrelation på nul rumlig adskillelse ellers kendt som nul-lag, g₁₁(0,0), giver det inverse gennemsnitlige antal partikler stede pr. stråle område af mikroskopet. Det kan opnås ved at montere den rumlige autokorrelation funktion til en todimensional Gaussisk funktion (Eq 2):

     

Som pixels fanget i et billede er indeholdt i et sæt område og disse målinger ikke strækker til uendeligt, bruges udtrykket g∞ en modpostering for at tage højde for langtrækkende rumlige sammenhænge indeholdt i billedet. For Molekylær-størrelse aggregater, ω er funktionen punkt-udbredelsen af mikroskopet og beskrevet af fuld bredde på halv-maksimalt rumlige autokorrelation funktion. Det område, der er indeholdt i funktionen punkt spredt af instrumentet kan kalibreres ved hjælp af sub opløsning fluorescerende perler.

Billede korrelation spektroskopi-protokollen beskrevet heri udføres autokorrelation og matematiske funktioner, der kræves for at fuldføre ICS ved hjælp af open source imaging databehandlingssystemer platform, Fiji¹⁰, en fordeling af ImageJ program^11,12. Fiji/ImageJ udnytter den forudinstallerede hurtig Fourier transformation i funktionen FFT Math. Denne funktion reducerer den compute tid, der kræves af denne beregning ved at reducere vifte af data med en faktor på to i hver dimension¹³. Da funktionen 2D autokorrelation er ca symmetrisk i x, y-aksen, kan en enkelt linje profil plot gennem autokorrelation billede bruges til at måle den rå autokorrelation som en funktion af den rumlige lag. Nul-lag støj er fjernet inden yderligere beregning, med den deraf følgende autokorrelation amplitude (peak værdi, g(0)_T) korrigeret for baggrund med udtryk (Eq 3):

     

hvor jeg_b er den gennemsnitlige intensitet fra en baggrund region bortset fra cellen. Klynge massefylde eller densitet af fluorescerende objekter, er defineret af (Eq 4):

    

I den protokol, der er beskrevet heri, yderligere vi simpelthen beregningen af klynge tæthed (CD), med den antagelse, baseret på den iagttagelse, at et normaliseret autokorrelation funktion vil henfalde til en værdi nærmer 1,0 med stigende fysisk lag. Med maksimal fysisk lag, der er ikke længere nogen korrelation af fluorescens intensitetsværdierne og dermed uden en korrelation beregninger på denne region computing værdien af en intensitet ganget med denne intensitet, som er derefter divideret med den kvadratet på denne intensitet, som pr. definition er lig med 1,0. Klynge tæthed fra en normaliseret autokorrelation funktion kan således beregnes ved at fratrække 1.0 fra funktionen normaliseret autokorrelation før tager sin gensidige (Eq 5):

     

Yderligere kalibrering af området beam kan udføres for at kvantificere antallet af klynger indeholdt inden for apparatets punkt spredt funktion. Denne kalibrering skal udføres ved hjælp af de samme optiske betingelser anvendes under korrelations-spektroskopi billedanalyse.

Protocol

1. såning af vedhængende cellelinjer til Imaging eksperiment

1. Seed 10.000 A431 epidermoid karcinom celler pr godt overnatning (O/N) i 300 µL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium/næringsstof blanding F-12 (DMEM/F-12) medier indeholdende 10% føtal bovint Serum, 1% Penicillin-Streptomycin og 1% GlutaMAX i en 8 chambered imaging slide egnet til høj opløsning olie fordybelse målet linser (f.eks., NuncTM Lab-TekTM chambered daekglas).
2. Stimulere receptor aggregering på A431 celler med tilsætning af 100 ng/mL EGF ligand i medierne i 10 min. ved stuetemperatur (RT).

2. primære antistof inkubation

1. Fjerne medier og vaske cellerne med 300 µL af stuetemperatur (RT) fosfatbufferet saltopløsning (1 x PBS) to gange.
2. Fix cellerne med 200 µL af 4% PARAFORMALDEHYD i PBS for 10 min på RT.
   Bemærk: For at udforske de tidsmæssige ændringer af mål sammenlægning, denne fiksering skridt skal udelades.
3. Fjerne PFA og vaske cellerne med 300 µL af stuetemperatur PBS to gange.
4. Inkuber celler med 200 µL af PBS, som indeholder primære antistof i en koncentration på 10 µg/mL i mindst 2 timer ved 4 ° C.
   Bemærk: For ICS beregninger skal være gyldig, alle receptorer på cellens overflade skal være mærket med primær antistof. Dette kræver forudgående eksperimenter med en fortyndingsrække af hver primære antistof (1:10, 1:50, 1: 100, 1:200, 1: 500 1:1, 000, osv.) skal udføres. Optimal primære antistof koncentrationen bestemmes ved analyse af fluorescens intensitet versus klynge tæthed. Den valgte primære koncentration opstår, når klynge tæthed plateauer med stigende primære antistof koncentrationer inden en yderligere stigning i klynge tæthed som følge af ikke-specifikke antistof bindende. Den primære antistof kan fortyndes i serum frie medier, hvis udfører et tidsforløb imaging eksperiment.
5. Efter afslutningen af ønskede inkubationstiden, vaske cellerne med 300 µL af RT PBS to gange.
6. Blokere prøve med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i mindst 2 timer ved 4 ° C.
   Bemærk: Fast prøver blokeres rutinemæssigt overnatning (O/N) på 4 ° C.

3. sekundær antistof inkubation

1. Forberede en 10 µg/mL bestand af fluorescently mærket sekundær antistof (fx Alexa Fluor 488 IgG) i PBS. 2 µg/mL af Hoechst 33342 kan medtages i denne fortynding til forbedret prøve opdagelse på mikroskopet.
   Bemærk: For time-lapse eksperimenter, PBS kan veksles til serum frie medier.
2. Fjern 5% BSA/PBS fra cellerne og inkuberes med sekundær antistof løsning i 2 timer ved 4 ° C, mens beskytte prøverne fra omgivende lys.
3. Efter afslutningen af sekundær antistof inkubationstiden, cellerne vaskes med 300 µL af PBS (to gange) og opbevares ved 4 ° C, beskytte fra omgivende lys.
4. For at undgå fordampning, wrap kanterne af diasset kammer med parafilm.

4. Konfokal mikroskopi prøver

Bemærk: Indstillingerne bruges til Konfokal analyse vil variere afhængigt af udstyr og fluorophores anvendes i den enkelte eksperiment. Moderne Konfokal instrumenter har mekanismer til at gemme alle tænkelig parametre, der anvendes i forsøget i native image filformat af instrumentet. Det er vigtigt, at disse indstillinger er optaget for at fastsaette passende replikering af eksperimentelle betingelser på tværs af forskellige perioder af datafangst.

1. Under billeddannelse af fluorescerende signaler, undgå overdreven mætning. Bruge et billede ser op tabel, der giver en falsk farvegengivelse af pixel mætning og mindske detektor gevinst og laser power i overensstemmelse hermed. Mest Konfokal instrumenter omfatter en "rækkevidde indikator" indstilling eller tilsvarende indstilling i erhvervelse software til dette.
2. Minimere eksponeringen af fluorophore af interesse for laser power. Brug af en DNA-mærkning plet som Hoechst 33342 leverer en nem mekanisme for at opdage og Anbring prøven i synsfelt før samling.
3. Udføre de første scanninger af prøven med en lav opløsning og hvis software tillader en hurtig scan hastighed. Dette vil begrænse de mulige photobleaching af prøven.
4. Øge opløsning billedoptagelse og langsom scanning hastighed når du er klar til at indsamle billeddata.
5. Hvis den Konfokal instrument tillader, indsamle data ved hjælp af en foton optælling mode.
   Bemærk: Hvis photon optælling ikke er tilgængelig på instrumentet: sikre grå niveauer er lineær under image erhvervelse.
6. Indstille pinhole for hver laser linje bruges til 1 luftige enhed (AU).
7. Brug linie eller ramme gennemsnit under image erhvervelse (x4) at reducere detektor forbundet støj.
   Bemærk: I denne variant af ICS som eneste tidspunkt er fanget erhvervelse tid er ikke eksperimentelle begrænsende faktor.
8. For billede indsamling Vælg en høj forstørrelse, høj numerisk blænde mål, såsom en Plan-Apochromat formål, at yde maksimal opløsning og korrektion for sfæriske og kromatisk aberration (eksempler omfatter Plan-Apochromat 100 X eller 63 X /1.40 Olie mål).
9. Oversample størrelse i de indsamlede pixel indeholdt i billedet. Det anbefales, hver pixel fange et 50 x 50 nm region. For effektiv ICS, skal pixelstørrelse være mindre end 0,1 x 0,1 µm² pr. pixel. Dette opnås ved en kombination af zoomer at scanne et relativt lille område og vælge et relativt stort billedformat (f.eks. 1024 x 1024 eller 2048 x 2048 pixels).
10. Fokusere på den apikale eller basal overfladen af cellen i en region så fladt som muligt. Flere celler kan afhentes i ét billede og områder af interesse behandles individuelt under ICS analyse.
11. Fange en celle gratis baggrund region ved hjælp af de samme Apparatindstillingen skal bruges til stikprøve normalisering.

5. beregning af billede korrelation spektroskopi

Bemærk: Open source imaging databehandlingssystemer platform, Fiji, en fordeling af programmet ImageJ er forpligtet til at udføre autokorrelation og matematiske funktioner afgørende for ICS. Denne fordeling af ImageJ anbefales det indeholder mange pre-installeret plug-ins og en lettere opdatering arkitektur, der kan udføre handlinger på tværs af flere billeddannelse eksperimenter.

1. Installere programmet Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
2. Indlæse den erhvervede datasæt.
3. Identificere den apikale eller basal celle overflade membran region af interesse og to eksemplarer pixel størrelse af 2ⁿ (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menu: billede > Dubler..."
4. Beregner den gennemsnitlige intensitet af det beskårne område af interesse "Menu: analysere > målinger."
5. Identificere en baggrund region og duplikere til samme pixel størrelsen af opsamling cellens overflade membran (2ⁿ: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menu: billede > Dubler..."
6. Beregn den gennemsnitlige intensitet af baggrunden beskåret område af interesse. "Menu: analysere > målinger."
7. Fratræk den gennemsnitlige intensitet i baggrunden fra det billede, der indeholder regionen af interesse. "Processen > billede regnemaskine > subtrahere."
8. Udføre autokorrelation beregning. Denne beregning er indeholdt i menustrukturen: "processen > FTT > FD Math."
   1. I FD Math dialog boks Vælg: billede 1: beskåret billede navn, Operation som korrelation, billede 2: beskåret billede navn, invers transformation på.
9. Normalisere det resulterende billede ved at dividere med det samlede antal pixel. "Menu: processen > Matematik > opdele..." (dvs.: 64 x 64 pixler = 4096)
10. Normalisere igen ved at dividere med den gennemsnitlige intensitet af de normaliserede beskæringsområde firkant. "Menu: processen > Matematik > opdele..."
    Bemærk: Dette kan opnås ved at dividere billedet af den gennemsnitlige intensitetsværdien to gange.
11. Tegn en linje gennem funktionen punkt spredt.
12. Plot profil for denne linje for at beregne spidsværdien. "Menu: analysere > Plot profil."
13. Beregne klynger pr. stråle område ved at overføre spidsværdien (resultatet af 5.12) til et regneark og udføre den følgende beregning (Eq 6):
    

6. batch behandling af ICS datasæt

Bemærk: Etablering af en FIJI/ImageJ makro anbefales at kopiere de procedurer, der er beskrevet i ovennævnte protokol. Dette giver mulighed for en konsekvent og hurtig analyse af flere billedfiler i billedanalyse korrelations-spektroskopi.

1. Oprette en makro ICS arbejdsproces ved at optage hver menukommando i ICS-protokollen
   "Menu: Plugins > makroer > Record...".
2. Vælg "Opret" til at generere makro.
3. Vælg "sproget > IJ1 makro."
4. Gem makroen.
5. Tilføje dialogbokse til forskellige trin i makro, give påmindelser til operatører af hver funktion. Dialogbokse også tjene som en metode til at holde pause analyse proces at give mulighed for passende valg skal foretages forud for yderligere forarbejdning (dvs. regionen at beskære)
   1. Dialog boks makrokode
      title = "Dialog boksen Titel";
      msg = "Dialog Boks/protokol trin besked";
      waitForUser (titel, msg);
      Bemærk: Yderligere effektivitetsgevinster kan etableres ved at abonnere BAR update websted i FIJI Updater (instruktioner https://imagej.net/BAR). Dette giver FIJI "en samling af generelt gældende rutiner" ¹⁴. En sådan rutine er Find toppe. Menustruktur: "BAR > Data Analysis > Find toppe." Dette script giver en hurtig betyder til beregning af peak værdi i profilen af punkt spredt funktion.

7. protocol Extensions: Beregning af stråle område med mikroskop

Bemærk: Overførselsfunktionen optisk af mikroskop sikrer at selv Molekylær-sized objekter vises som billeder med en radius på omkring 200-300 nm i x-y plane. ICS-protokollen giver mulighed for bestemmelse af funktionen punkt-spredning ved at udføre trin 4-5 på sub opløsning fluorescerende perler. Specifikt:

1. Montere sub opløsning (dvs. < 100 nm diameter) fluorescerende perler på en 8 kammer imaging dias.
2. Billede perler som beskrevet protokol bruger Konfokal mikroskop udnyttet for ICS eksperimenter.
3. Beregne funktionen Deling af internetforbindelse fra det resulterende billede pr protokol trin 5.1-5.13.
4. Profilen plottet beregnes beam radius (r) som den fulde bredde på halv maksimal værdi af funktionen Deling af internetforbindelse.
5. Beregne området beam (BA) som (Eq 7):

8. protokol udvidelser: Beregning af klynger pr. arealenhed

1. Compute cluster tæthed (CD) pr. arealenhed som (Eq 8):
   
   
2. Divider klynger pr. stråle område (resultatet af 5.13) med området af BOM (resultatet af 7.5).

Representative Results

En vellykket billede korrelation spektroskopi eksperiment er afhængig af en korrekt anvendelse af behandling kontrol. Disse behandlingsgrupper omfatte en undersøgelse af fluorescens i ingen primære antistof og ingen sekundær antistof behandlingsgrupper. Når indstillingerne for optimal Konfokal laser er oprettet for et eksperiment, skal blive fanget billeder af gruppernes kontrol at bekræfte manglen på ikke-specifik fluorescens i prøven. For mange vedhængende kræft cellelinjer, er identifikation af områder egnet til ICS begrænset af manglen flade overflader. Dette opvejes af evnen til at fange et stort synsfelt flere kræftceller i et enkelt Konfokal billede. Dette giver mulighed for at generere den krævede prøveudtagning for at udføre statistiske sammenligninger mellem behandlingsgrupper.

I denne repræsentative eksperiment, blev A431 EGFR positive epidermoid karcinom celler, stimuleret med 100ng/mL af EGF ligand i 10 min. ved stuetemperatur til at fremkalde EGFR klyngedannelse. ICS analyse blev udført på begge EGF stimuleret (figur 1A) og unstimulated (figur 1 d) celler efter inkubation med EGFR målretning humaniseret monoklonalt antistof, cetuximab. Efterfølgende, 64 x 64 pixel afgrøde af en region (gul boks) indeholdt i cellemembranen (figur 1B og 1E) var forarbejdet udnytte funktionen autokorrelation var indeholdt i open source billed-oparbejdelse platform, FIJI. Denne resulterende autokorrelation billede var normaliseret ved at fratrække baggrund fluorescens før dividere med kvadratet på gennemsnitlig intensitet af de normaliserede region af interesse samt kvadratet på antallet af pixel i det beskårne område ( Figur 1 c og 1F). Værktøjet streg funktion blev brugt til at plotte funktionen punkt-udbredelsen af dette billede profil (figur 1 g og 1 H). Spidsværdien af disse profiler blev omsat til et regnearksprogram for yderligere databehandling. En FIJI makro blev genereret for at replikere disse FIJI behandlingstrin for hurtig behandling af en række celler (n = 6) fra både behandlingsgrupper efter cetuximab immuncytokemi (figur 1I). I dette eksperiment, blev EGFR receptor identificeret i 5.84 ± 0,85 klynger pr. stråle område på overfladen af A431 stimuleres cellerne versus 14.94 ± 1.62 klynger pr. stråle område i unstimulated celler populationer. Med den antagelse at de eksperimentelle betingelser anvendes til denne analyse grænse hurtige receptor omsætning, EGFR klynge tæthed i stimuleret A431 celler faldt 2.56-fold. Når betingelser sammenlignes for tilstanden sammenlægning af de samme mål molekyle i betingelser, når målet molekyle turn-over er begrænset, angiver en lavere antal klynger pr. stråle område øget target sammenlægning. Efter EGF ligand stimulation EGFR sammenlægning øger 2.56-fold som forventet i dette system. Generation af en FIJI makro ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet i denne protokol giver mulighed for en statistisk sammenligning af varierede behandlinger eller miljømæssige forskelle og deres indvirkning på receptor sammenlægning.

Figur 1: billede korrelation spektroskopi til at opdage fluorescently mærket klynger på cellens overflade af vedhængende kræftceller. Konfokal mikroskopi billede af repræsentant EGF stimuleret (A) eller unstimulated (D) vedhængende A431 epidermoid karcinom celler mærket med cetuximab primære antistof rettet mod celle overflade EGFR receptor med Alex Fluor 488 sekundære antistof. Stimuleret celler blev behandlet med 100 ng/mL EGF i 10 min. ved stuetemperatur til at fremkalde EGFR gruppering fiksation og immuncytokemi. Cellemembranen indeholdende afgrøde regioner (gul boks) med pixeldimensioner (64 x 64 [2ⁿ]) blev brugt til at udføre ICS analyse (B og E). Efter normalisering af funktionen autokorrelation i FIJI/ImageJ, stregværktøjet (gul) blev brugt til at måle funktionen punkt spredt (C og F) profilen af denne linje funktion er afbildet til at registrere spidsværdien (G og H ). EGF stimulation blev observeret at fremkalde et 2.56-fold fald i opdaget EGFR klynger pr. stråle område 5.84 ±0.85 i forhold til 14,9 5±1.62 unstimulated celler (n = 6) (I). Med antagelsen, de eksperimentelle betingelser anvendes i denne analyse, opretholdt et konstant antal cellens membranreceptorer, repræsenterer dette en stigning i EGFR sammenlægning efter EGF stimulation. Skala barer = 10 µm (A og D); 1 µm (B-C og E-F). Box Plot vises ved hjælp af Tukey stil med whiskers repræsenterer maksimum og minimum observeret værdier ikke mere end 1,5 × interkvartil vifte (IQR). Klynger pr. stråle område ± standardafvigelse for mener (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Teknik af billede korrelation spektroskopi (ICS) som vi beskriver i denne protokol bruger standard Konfokal mikroskoper uden behov for specialiserede detektorer. ICS teknik beskrevet udnytter veletablerede immuncytokemi metoder til at give for hurtig prøvetagning af flere behandling betingelser for øget statistisk analyse. Denne metode gør det med en lille reduktion i absolutte præcision i forhold til alternative enkelt molekyle teknikker baseret på korrelation af fluorescens udsving af mobile molekyler spreder gennem en Konfokal volumen, såsom fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)¹⁵. Den mere specialiserede FCS tilgang kræver også høj følsomhed photon tæller detektorer som lavine fotodiode (APD) eller GaAsP detektorer sammen med dedikeret specialiseret software, der ikke findes rutinemæssigt på standard Konfokal instrumenter. En omfattende analyse af præcisionen af ICS bestemmes denne teknik kan præcist at måle antallet af klynger hvor > 1 partikel er til stede i stråle fokale stedet af laser scanning mikroskop⁷.

Indsamling af relevante fluorescerende billeder er af afgørende betydning for en vellykket ICS analyse. Region af interesse skal indeholde et højt signal til baggrunden fluorescerende forholdet med laser og få intensiteter justeret for at fjerne enhver signal mætning. Regionen cellulære fanget skal blive oversamplet med en pixelstørrelse på ca 50 nm. Denne region skal vaere homogen, med omhyggelig opmærksomhed betalt at undgå cellulære kanter eller vejkryds, som kan øge artefakter i beregningen af autokorrelation. En af de store faldgruber af ICS tilgang er følsomheden over for heterogene cellulære overflader. Således vil begrænse regionen fanget at den maksimale flad overflade, uanset celle form forbedre nøjagtigheden af nogen ICS analyse.

Flere billeddiagnostiske modaliteter er udtømt for at studere sammenlægning af receptor komplekser. Elektronmikroskopi (EM) giver høj opløsning rumlige vurdering af protein klyngedannelse, men opererer under ekstremt høje vakuum og gælder ikke for undersøgelser som kræver tidsmæssige opløsning. EM er yderligere begrænset, da dens barske prøveforberedelse er uoverkommelig for levende væv undersøgelser⁵. For at overvinde de iboende opløsning begrænsninger af standard Konfokal mikroskopi, Förster resonans energioverførsel kan (FRET) bruges til at beregne den rumlige organisering af strukturer mærket med overlappende donor og acceptor fluorophores par¹⁶ . Trods sin følsomhed indeholder FRET ikke imidlertid oplysninger vedrørende størrelsen af aggregater under undersøgelsen⁶. Udviklingen af forskellige super opløsning Fluorescens mikroskopi metoder giver spændende muligheder for at løse cellulære objekter ikke muligt med standardopløsning Konfokal metoder^17,18. Regning og ekspertise kræves af sådanne teknologier og instrumenter, begrænser deres nuværende hverdagskost tilgængelighed.

Med stigninger i følsomhed og lave foto-toksicitet i Konfokal instrumentation, kan billede korrelation spektroskopi udvides til at udforske tidsmæssige ændringer af receptor sammenlægning i levende celler i time-lapse eksperimenter. Dette kan være sammenstillet med stigende laser power bruges til bevidst inducerer foto blegning af individuelle prøver med efterfølgende ICS vurdering (pbICS) at drille hinanden højere-ordens sammenlægning til stede i nogle receptor komplekser⁹. En yderligere tilpasning, image cross-korrelations-spektroskopi (ICC) giver en analyse af fælles lokalisering af to membran baseret protein gennem en analyse af billedet par for hver fluorescently mærket protein¹⁹. Styrken af dette billede korrelation spektroskopi metode er at det udnytter teknikker veletableret i feltet og giver en frit tilgængelig analyse rørledning til kvantitative de højdynamiske hændelser, som forekommer på cellemembranen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG