Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

फोकल माइक्रोस्कोपी छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिका सतह रिसेप्टर एकत्रीकरण का पता चलता है

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57164
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,5,6,7
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Summary

एंटीबॉडी कि बाँध सेल सतह पर रिसेप्टर्स लक्ष्य करने के लिए अनुरूप और क्लस्टरिंग परिवर्तन प्रदान कर सकते हैं. इन गतिशील परिवर्तन निस्र्पक दवा के विकास के लिए लक्ष्य कोशिकाओं में निहितार्थ है । इस प्रोटोकॉल ImageJ/फिजी के माध्यम से फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का इस्तेमाल करता है कोशिका सतह पर रिसेप्टर क्लस्टरिंग की हद तक बढ़ाता है ।

Abstract

फोकल माइक्रोस्कोपी उप सेलुलर बातचीत के लक्षण वर्णन और पूर्व नैदानिक फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल एजेंटों के विकास के लिए महत्वपूर्ण पर कब्जा करने के लिए एक सुलभ पद्धति प्रदान करता है । एंटीबॉडी आधारित साइटोटोक्सिक दवा वितरण प्रणाली में हाल ही में प्रगति के साथ, रिसेप्टर एकत्रीकरण और internalization के दायरे के भीतर इन एजेंटों द्वारा प्रेरित परिवर्तन को समझना महत्वपूर्ण महत्व का है. इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट immunocytochemistry की अच्छी तरह से स्थापित पद्धति और ImageJ के मुक्त स्रोत फिजी वितरण leverages, अपनी इनबिल्ट सहसंबंध और छवि गणितीय कार्यों के साथ, के लिए स्थानिक छवि सहसंबंध प्रदर्शन स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीएस) । इस प्रोटोकॉल फोकल माइक्रोस्कोप की किरण क्षेत्र के एक समारोह के रूप में लेबल रिसेप्टर्स की फ्लोरोसेंट तीव्रता quantitates. यह सेल सतह पर लक्ष्य अणु एकत्रीकरण की स्थिति का एक परिमाणात्मक उपाय प्रदान करता है । इस पद्धति की क्षमता के साथ स्थिर कोशिकाओं के लक्षण वर्णन पर केंद्रित है रिसेप्टर एकत्रीकरण के लौकिक जांच में विस्तार करने के लिए । यह प्रोटोकॉल एक सुलभ पद्धति प्रस्तुत करने के लिए क्लस्टरिंग घटनाओं की ठहराव प्रदान करने के लिए सेल की सतह पर होने वाली, अच्छी तरह से स्थापित तकनीक और गैर विशेष इमेजिंग उपकरण का उपयोग ।

Introduction

चिकित्सीय एंटीबॉडी के विकास के कई ट्यूमर प्रकार के उपचार में उल्लेखनीय सफलता दिखाया गया है1. एंटीबॉडी के हाल ही में प्रगति-ड्रग conjugates (ADC) साइटोटोक्सिक यौगिकों के लिए वितरण तंत्र के रूप में एंटीबॉडी की गतिशीलता को समझने के लिए आवश्यकताओं का विस्तार किया गया है: सेल सतह2पर रिसेप्टर बातचीत. सेल सतह रिसेप्टर के लिए एक एंटीबॉडी के सफल लक्ष्यीकरण के बाद, इन परिसरों ligand में मनाया उन लोगों के लिए समान एकत्रीकरण पैटर्न पैदा कर सकते हैं: एंटीबॉडी बातचीत3. रिसेप्टर एकत्रीकरण में परिवर्तन झिल्ली और रिसेप्टर के internalization में परिणाम और सेल सतह से हटाने के लिए बदलाव पैदा कर सकते हैं. एक एंटीबॉडी के संदर्भ में दवा संयुग्मी, इस प्रक्रिया को बाद में आंतरिक endosomes में साइटोटोक्सिक पेलोड विज्ञप्ति और बाद में कोशिका द्रव्य, प्रभावी कोशिका हत्या में जिसके परिणामस्वरूप ।

फोकल माइक्रोस्कोपी एंटीबॉडी के इन महत्वपूर्ण बातचीत visualizing और उनके लक्ष्य रिसेप्टर्स4की एक प्रभावी साधन प्रदान की गई है । सेल सतह पर लक्ष्य अणु के एकत्रीकरण के परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एक स्थानिक छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीएस) तकनीक 5,6,7 के माध्यम से फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के प्रसंस्करण के बाद .

छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी की नींव अवलोकन है कि स्थानिक प्रतिदीप्ति तीव्रता उतार चढ़ाव लेबल संरचनाओं के घनत्व और एकत्रीकरण राज्य के लिए एक रिश्ता साझा है । यह संबंध एक कैप्चर की गई छवि5के एक स्थानिक सहसंबंध फ़ंक्शन की गणना के बाद स्थापित किया गया है ।

छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के सभी वेरिएंट एक छवि के संबंध की गणना की आवश्यकता होती है । यह इस फ़ंक्शन के लिए एक दो-आयामी गाऊसी वक्र छवि के भीतर निहित मात्रा एकत्रीकरण स्थिति पैरामीटर्स के निष्कर्षण के लिए ढाले द्वारा फ़ॉलो किया जाता है । सरल शब्दों में एक छवि की गणना एक छवि के भीतर निहित सभी संभव पिक्सेल जोड़े तुलना शामिल है और संभावना है कि दोनों समान रूप से एक दूसरे के रूप में उज्ज्वल की गणना । यह दूरी और पिक्सेल जुदाई8की दिशाओं के एक समारोह के रूप में visualized है ।

छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए सैद्धांतिक ढांचे की स्थापना की और पीटरसन और ज्ञानी एट अलद्वारा परिभाषित किया गया था । 5 , 6. इस प्रोटोकॉल में, ImageJ में एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, तीव्रता उतार-चढ़ाव स्थानिक सहसंबंध फ़ंक्शन के लिए आधार (Eq 1)के रूप में वर्णित किया जा सकता है, तो सहसंबंध परिकलन किया जाता है:

Equation 1     

जहां च रूपान्तर रूपांतर का प्रतिनिधित्व करता है; F− 1 विलोम रूपान्तर रूपांतरित; च * इसकी जटिल संयुग्मी; आणि स्थानिक क्षेत्रातही चर ε आणि η. स्थानिक आईसीएस में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, सहसंबंध फ़ंक्शन एक 2d तेजी रूपान्तर रूपांतरण एल्गोरिथ्म7,9का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता है । शूंय स्थानिक अंयथा शूंय-अंतराल, जी11(0, 0), के रूप में जाना जाता जुदाई में सहसंबंध माइक्रोस्कोप की किरण क्षेत्र प्रति वर्तमान कणों के व्युत्क्रम मतलब की संख्या प्रदान करता है । यह एक दो आयामी गाऊसी समारोह (Eq 2)के लिए स्थानिक सहसंबंध समारोह फिटिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है:

Equation 3     

के रूप में पिक्सल एक छवि के भीतर कब्जा कर लिया एक सेट क्षेत्र के भीतर समाहित कर रहे है और इन माप अनंत को विस्तार नहीं है, शब्द जी ∞ एक ऑफसेट के रूप में प्रयोग किया जाता है के लिए लंबी दूरी की स्थानिक सहसंबंध के लिए खाते में निहित छवि । आणविक आकार समुच्चय के लिए, ω माइक्रोस्कोप की बात फैलाने के समारोह और स्थानिक सहसंबंध समारोह की आधी अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई द्वारा वर्णित है है । साधन के बिंदु प्रसार समारोह के भीतर निहित क्षेत्र उप संकल्प फ्लोरोसेंट मोतियों के उपयोग के माध्यम से जांच कर सकते हैं ।

यहां वर्णित छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटोकॉल के लिए, एकीकृत परिपथों को पूरा करने के लिए आवश्यक सहसंबंध और गणितीय फ़ंक्शंस खुले स्रोत इमेजिंग-प्रोसेसिंग प्लेटफ़ॉर्म, फिजी10, ImageJ के वितरण का उपयोग कर रहे हैं । कार्यक्रम११,१२. फिजी/ImageJ FFT मठ समारोह में पूर्व स्थापित तेजी से रूपान्तर परिवर्तन का इस्तेमाल करता है । यह फ़ंक्शन प्रत्येक आयाम13में दो के एक फ़ैक्टर द्वारा डेटा की श्रेणी को कम करके इस परिकलन की आवश्यक गणना समय को कम करता है. के रूप में 2 डी सहसंबंध समारोह एक्स में लगभग सममित है, वाई धुरी, एक एकल रेखा प्रोफ़ाइल साजिश के माध्यम से सहसंबंध छवि के लिए स्थानिक अंतराल के एक समारोह के रूप में कच्चे सहसंबंध उपाय किया जा सकता है । किसी भी शूंय-अंतराल शोर आगे परिकलन करने से पहले निकाल दिया जाता है, परिणामी के साथ सहसंबंध आयाम (पीक मान, g(0)T) अभिव्यक्ति के साथ पृष्ठभूमि के लिए सही (Eq 3):

Equation 4     

जहां मैंबी एक पृष्ठभूमि क्षेत्र से मतलब है तीव्रता कोशिका को छोड़कर । क्लस्टर घनत्व, या फ्लोरोसेंट वस्तुओं के घनत्व, (Eq 4)द्वारा परिभाषित किया गया है:

Equation 5    

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल में, हम आगे बस क्लस्टर घनत्व की गणना (सीडी), अवलोकन के आधार पर धारणा के साथ कि एक सामान्यीकृत सहसंबंध समारोह में वृद्धि के साथ एक १.० आ मूल्य के लिए क्षय होगा स्थानिक अंतराल । अधिकतम स्थानिक अंतराल के साथ, वहां अब प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के किसी भी संबंध है और इस तरह एक सहसंबंध के बिना इस क्षेत्र में गणना कर रहे है एक तीव्रता इस तीव्रता जो बाद में से विभाजित है द्वारा गुणा के मूल्य कंप्यूटिंग कर रहे है उस तीव्रता का वर्ग है, जो परिभाषा के द्वारा १.० के बराबर है । इस प्रकार, एक सामान्यीकृत सहसंबंध समारोह से क्लस्टर घनत्व सामान्यीकृत से १.० अपने पारस्परिक (Eq 5)लेने से पहले अपने सहसंबंध समारोह से घटाया जा सकता है:

Equation 6     

इसके अलावा बीम क्षेत्र के अंशांकन साधन के बिंदु फैले समारोह के क्षेत्र के भीतर निहित समूहों की संख्या quantitate करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । इस अंशांकन छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया एक ही ऑप्टिकल स्थितियों का उपयोग किया जाना चाहिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. इमेजिंग प्रयोग के लिए अनुयाई सेल लाइनों की सीडिंग

  1. बीज १०,००० A431 epidermoid कार्सिनोमा प्रति अच्छी तरह से रात (O/N) ३०० µ में Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम/पोषक तत्वों के मिश्रण एफ 12 (DMEM/एफ-12) मीडिया युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन-Streptomycin और 1% GlutaMAX में एक 8 चैम्बर्ड इमेजिंग उच्च संकल्प तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस के लिए उपयुक्त स्लाइड (जैसे, NuncTM लैब-TekTM चेंबर्स coverglass) ।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए मीडिया में १०० एनजी/एमएल EGF ligand के अलावा के साथ A431 कोशिकाओं पर रिसेप्टर एकत्रीकरण को उत्तेजित ।

2. प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन

  1. मीडिया निकालें और कक्ष के तापमान के ३०० µ l के साथ कोशिकाओं को धोने (आरटी) फास्फेट खारा (1x पंजाबियों) दो बार ।
  2. आरटी में 10 मिनट के लिए पंजाब में 4% paraformaldehyde के २०० µ एल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
    नोट: लक्ष्य एकत्रीकरण के लौकिक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए, यह निर्धारण चरण छोड़ा जाना चाहिए.
  3. पीएफए निकालें और कक्ष तापमान पंजाब के ३०० µ एल के साथ कोशिकाओं को धो दो बार ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 ज के लिए 10 µ जी/एमएल की एकाग्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त पंजाब के २०० µ एल के साथ कोशिकाओं को गर्मी ।
    नोट: आईसीएस गणना के लिए मान्य होना करने के लिए, सभी रिसेप्टर्स सेल सतह पर मौजूद प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाना चाहिए. यह प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी की एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के साथ प्रारंभिक प्रयोगों की आवश्यकता है (1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500 1:1000, आदि) के लिए प्रदर्शन किया जाएगा । इष्टतम प्राथमिक एंटीबॉडी एकाग्रता प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम क्लस्टर घनत्व के विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किया जाता है । चयनित प्राथमिक एकाग्रता तब होती है जब प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता बढ़ाने के साथ क्लस्टर घनत्व पठारों गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी का एक परिणाम के रूप में क्लस्टर घनत्व में एक और वृद्धि करने से पहले. प्राथमिक एंटीबॉडी सीरम मुक्त मीडिया में पतला किया जा सकता है अगर एक समय पाठ्यक्रम इमेजिंग प्रयोग प्रदर्शन ।
  5. वांछित मशीन समय के पूरा होने के बाद, दो बार आर टी पंजाब के ३०० µ एल के साथ धो कोशिकाओं ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए पंजाब में 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ नमूना ब्लॉक ।
    नोट: फिक्स्ड नमूनों नियमित रूप से रात भर अवरुद्ध कर रहे हैं (O/N) 4 ° c.

3. माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन

  1. एक 10 µ जी/मिलीलीटर के शेयर फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (उदा ) पंजाबियों में Alexa Fluor ४८८ आईजीजी । 2 µ g/Hoechst ३३३४२ के एमएल इस कमजोर पड़ने में खुर्दबीन पर बेहतर नमूना खोज के लिए अनुमति देने के लिए शामिल किया जा सकता है ।
    नोट: समय चूक प्रयोगों के लिए, पंजाब सीरम मुक्त मीडिया के लिए विमर्श किया जा सकता है ।
  2. कोशिकाओं से 5% BSA/पंजाबियों निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ मशीन, जबकि परिवेश प्रकाश से नमूनों की रक्षा.
  3. माध्यमिक एंटीबॉडी मशीन समय के पूरा होने पर, पंजाब के ३०० µ एल के साथ कोशिकाओं को धोने (दो बार) और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान, परिवेश प्रकाश से रक्षा.
  4. वाष्पीकरण को रोकने के लिए, parafilm के साथ चैंबर स्लाइड के किनारों लपेटें.

4. नमूनों की फोकल माइक्रोस्कोपी

नोट: फोकल विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स उपकरण और व्यक्तिगत प्रयोग में इस्तेमाल किया fluorophores के आधार पर अलग होगा । आधुनिक फोकल उपकरणों उपकरण के मूल छवि फ़ाइल स्वरूप में प्रयोग में इस्तेमाल सभी इमेजिंग मापदंडों को बचाने के लिए तंत्र प्रदान करते हैं । यह महत्वपूर्ण है कि इन सेटिंग्स को डेटा प्राप्ति के विभिंन अवधियों में प्रयोगात्मक शर्तों के उपयुक्त पुनरावृत्ति के लिए प्रदान करने के लिए रिकॉर्ड किया गया है ।

  1. फ्लोरोसेंट संकेतों की इमेजिंग के दौरान, से अधिक संतृप्ति से बचें । एक छवि का प्रयोग करें तालिका ऊपर देखो कि पिक्सेल संतृप्ति का एक झूठा रंग प्रतिनिधित्व प्रदान करता है और डिटेक्टर लाभ और लेजर शक्ति तदनुसार कम । सबसे फोकल उपकरणों एक "रेंज संकेतक" स्थापना या इस के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में अनुरूप विकल्प शामिल हैं ।
  2. लेजर शक्ति के लिए ब्याज की fluorophore के जोखिम को कम । एक डीएनए का उपयोग लेबलिंग दाग ऐसे Hoechst ३३३४२ के रूप में एक आसान प्रणाली का पता लगाने और संग्रह से पहले देखने के क्षेत्र में नमूना स्थिति प्रदान करता है ।
  3. नमूना के प्रारंभिक स्कैन एक कम रिज़ॉल्यूशन पर निष्पादित करें और यदि सॉफ़्टवेयर एक तेज गति स्कैन अनुमति देता है । इस नमूने के संभावित photobleaching की सीमा होगी ।
  4. कैप्चर रिज़ॉल्यूशन बढ़ाएँ और छवि डेटा एकत्रित करने के लिए तैयार करते समय स्कैन गति धीमी है ।
  5. यदि फोकल उपकरण की अनुमति देता है, एक फोटॉन गिनती मोड का उपयोग कर डेटा इकट्ठा ।
    नोट: यदि फोटॉन गिनती साधन पर उपलब्ध नहीं है: सुनिश्चित ग्रे स्तर छवि अधिग्रहण के दौरान रैखिक रहे हैं.
  6. प्रत्येक लेजर लाइन के लिए pinhole सेट 1 हवादार इकाई (AU) के लिए इस्तेमाल किया ।
  7. उपयोग लाइन या फ्रेम छवि अधिग्रहण (x4) के दौरान औसत डिटेक्टर जुड़े शोर को कम करने के लिए ।
    नोट: केवल एक समय-बिंदु के रूप में आईसीएस के इस संस्करण में अधिग्रहण समय पर कब्जा कर लिया है प्रयोगात्मक सीमित कारक नहीं है.
  8. छवि संग्रह के लिए एक उच्च आवर्धन का चयन करें, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य, इस तरह के एक योजना के रूप में-Apochromat उद्देश्य, गोलाकार और रंगीन विचलन के लिए अधिकतम संकल्प और सुधार प्रदान करने के लिए (उदाहरण योजना शामिल हैं-Apochromat 100X या 63X/१.४० तेल उद्देश्य) ।
  9. कब्जा कर लिया पिक्सल के आकार का नमूना छवि के भीतर समाहित । यह प्रत्येक पिक्सेल एक ५० x ५० एनएम क्षेत्र पर कब्जा करने की सिफारिश की है । प्रभावी ICS के लिए, पिक्सेल आकार ०.१ x ०.१ µm2 प्रति पिक्सेल से कम होना चाहिए । यह एक अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्र को स्कैन करने और एक अपेक्षाकृत बड़ी छवि प्रारूप (जैसे १०२४ x १०२४ या २०४८ x २०४८ पिक्सल) का चयन करने के लिए ज़ूम इन करने का एक संयोजन द्वारा प्राप्त की है ।
  10. संभव के रूप में फ्लैट के रूप में एक क्षेत्र में सेल के शिखर या बेसल सतह पर ध्यान दें । आईसीएस विश्लेषण के दौरान व्यक्तिगत रूप से संसाधित एक छवि और ब्याज के क्षेत्रों में एकाधिक कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है ।
  11. नमूना सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक ही साधन सेटिंग्स का उपयोग कर एक सेल मुक्त पृष्ठभूमि क्षेत्र पर कब्जा.

5. छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी की गणना

नोट: ओपन-सोर्स इमेजिंग-प्रोसेसिंग प्लेटफॉर्म, फिजी, ImageJ प्रोग्राम का वितरण, आईसीएस के लिए आवश्यक सहसंबंध और गणितीय कार्यों को करने के लिए आवश्यक है । ImageJ के इस वितरण की सिफारिश की है के रूप में यह कई पूर्व स्थापित प्लग इन और एक आसान अद्यतन वास्तुकला है कि कई इमेजिंग प्रयोगों के पार आपरेशन प्रदर्शन कर सकते हैं शामिल हैं ।

  1. फिजी प्रोग्राम (http://fiji.sc/Downloads) स्थापित करें ।
  2. प्राप्त किए गए डेटासेट लोड ।
  3. ब्याज की शिखर या बेसल कोशिका सतह झिल्ली क्षेत्र की पहचान और 2एन (२५६ x २५६, १२८ x १२८, ६४ एक्स ६४) के पिक्सेल आकार करने के लिए डुप्लिकेट । "मेनू: छवि > डुप्लिकेट..."
  4. ब्याज की फसली क्षेत्र की औसत तीव्रता की गणना करें "मेनू: विश्लेषण > माप."
  5. पृष्ठभूमि क्षेत्र की पहचान करें और कैप्चर सेल सरफ़ेस झिल्ली (2n: 256x256, 128x128, 64x64) के समान पिक्सेल आकार में डुप्लिकेट करें । "मेनू: छवि > डुप्लिकेट..."
  6. ब्याज की पृष्ठभूमि फसली क्षेत्र की औसत तीव्रता की गणना । "मेनू: विश्लेषण > माप."
  7. रुचि के क्षेत्र वाली छवि से पृष्ठभूमि की औसत तीव्रता घटाना. "प्रक्रिया > छवि कैलक्यूलेटर > घटाना."
  8. स्वयं सहसंबंध परिकलन निष्पादित करें । इस गणना मेनू संरचना के भीतर समाहित है: "प्रक्रिया > FTT > एफडी मठ."
    1. एफडी मैथ संवाद बॉक्स का चयन करें: छवि 1: फसली छवि नाम, सहसंबंध के रूप में आपरेशन, छवि 2: फसली छवि नाम, पर व्युत्क्रम परिवर्तन ।
  9. परिणामी छवि को पिक्सेल्स की कुल संख्या के अनुसार विभाजित कर सामान्य करना. "मेनू: प्रक्रिया > मठ > फूट डालो..." (यानी: 64x64 पिक्सल = ४०९६)
  10. सामान्य फसली क्षेत्र की औसत तीव्रता चुकता द्वारा विभाजित करके फिर से सामान्य । "मेनू: प्रक्रिया > मठ > फूट डालो..."
    नोट: इस छवि को दो बार औसत तीव्रता मान के द्वारा विभाजित करके प्राप्त किया जा सकता है ।
  11. बिंदु प्रसार समारोह के माध्यम से एक लाइन ड्रा ।
  12. इस पंक्ति के प्रोफ़ाइल को पीक मान की गणना करने के लिए प्लॉट करें । "मेनू: विश्लेषण > भूखंड प्रोफ़ाइल."
  13. एक स्प्रेडशीट के लिए पीक मूल्य (५.१२ का परिणाम) स्थानांतरित करने और निम्नलिखित गणना (Eq 6) प्रदर्शन करके बीम क्षेत्र प्रति क्लस्टर्स की गणना:
    Equation 7

6. आईसीएस डेटासेट के बैच प्रसंस्करण

नोट: एक फिजी/ImageJ मैक्रो की स्थापना के ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित कार्यविधियों को दोहराने के लिए अनुशंसित है । यह छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के दौरान कई छवि फ़ाइलों के अनुरूप और तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।

  1. ics प्रोटोकॉल में प्रत्येक मेनू आदेश रिकॉर्ड करके कोई मैक्रो ICS वर्कफ़्लो स्थापित करना
    "मेनू: प्लगइंस > मैक्रोज़ > रिकॉर्ड..." ।
  2. मैक्रो उत्पंन करने के लिए "बनाएं" चुनें ।
  3. "भाषा > IJ1 मैक्रो" का चयन करें ।
  4. मैक्रो सहेजें ।
  5. प्रत्येक फ़ंक्शन के ऑपरेटर्स को अनुस्मारक प्रदान करते हुए, मैक्रो के विभिंन चरणों में संवाद बक्से जोड़ें । संवाद बक्से भी एक विधि के रूप में काम करने के लिए उपयुक्त चयन के लिए अनुमति देने के लिए आगे की प्रक्रिया से पहले किया जा करने के लिए (यानी, फसल को क्षेत्र) को थामने
    1. संवाद बॉक्स मैक्रो कोड
      शीर्षक = "संवाद बॉक्स शीर्षक";
      संदेश = "संवाद बॉक्स/प्रोटोकॉल चरण संदेश";
      waitForUser (शीर्षक, msg);
      नोट: अतिरिक्त क्षमता के लिए फिजी updater (निर्देश https://imagej.net/BAR) के भीतर बार अद्यतन साइट की सदस्यता से स्थापित किया जा सकता है । यह "मोटे तौर पर लागू दिनचर्या का एक संग्रह" 14के साथ फिजी प्रदान करता है । ऐसी ही एक दिनचर्या है चोटियों पर लगनी । मेनू संरचना: "बार > डेटा विश्लेषण > चोटियों खोजें." यह स्क्रिप्ट बिंदु प्रसार समारोह के प्रोफ़ाइल में पीक मूल्य की गणना का एक त्वरित साधन प्रदान करता है ।

7. प्रोटोकॉल एक्सटेंशन: माइक्रोस्कोप की बीम क्षेत्र की गणना

नोट: माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल स्थानांतरण समारोह सुनिश्चित करता है कि यहां तक कि आणविक आकार की वस्तुओं एक्स-वाई विमान में के बारे में 200-300 एनएम के एक त्रिज्या के साथ छवियों के रूप में दिखाई देते हैं । आईसीएस प्रोटोकॉल उप संकल्प फ्लोरोसेंट मोतियों पर 4-5 कदम प्रदर्शन से बिंदु-प्रसार समारोह के निर्धारण की अनुमति देता है । विशेष:

  1. माउंट उप संकल्प (यानी < 100 एनएम व्यास) एक 8 चैंबर इमेजिंग स्लाइड पर फ्लोरोसेंट मोती ।
  2. आईसीएस प्रयोगों के लिए उपयोग फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार छवि मोतियों.
  3. परिणामी छवि से ICS फ़ंक्शन प्रोटोकॉल चरण 5.1-5.13 के अनुसार परिकलित करें ।
  4. प्लॉट किए गए प्रोफ़ाइल से, ICS फ़ंक्शन के आधे अधिकतम मान पर पूर्ण चौड़ाई के रूप में बीम त्रिज्या (r) की गणना करें.
  5. (Eq 7) के रूप में बीम क्षेत्र (BA) की गणना:Equation 8

8. प्रोटोकॉल एक्सटेंशन: क्षेत्र के प्रति इकाई समूहों की गणना

  1. (Eq 8) के रूप में क्षेत्र के प्रति इकाई क्लस्टर घनत्व (सीडी) की गणना:
    Equation 9
    Equation 10
  2. बीम के क्षेत्र (७.५ के परिणाम) द्वारा बीम क्षेत्र (५.१३ के परिणाम) प्रति क्लस्टर विभाजित ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक सफल छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग उपचार नियंत्रण के उचित अनुप्रयोग पर निर्भर है । इन उपचार समूहों कोई प्राथमिक एंटीबॉडी और कोई माध्यमिक एंटीबॉडी उपचार समूहों में प्रतिदीप्ति की परीक्षा शामिल हैं । एक बार इष्टतम फोकल लेजर सेटिंग्स एक प्रयोग के लिए स्थापित कर रहे हैं, छवियों इन नियंत्रण समूहों के नमूने के भीतर गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति की कमी की पुष्टि करने के लिए कब्जा किया जाना चाहिए । कई अनुयाई कैंसर सेल लाइनों के लिए, आईसीएस के लिए उपयुक्त क्षेत्रों की पहचान फ्लैट सतहों की कमी के द्वारा सीमित है । यह एक एकल फोकल छवि में एकाधिक कैंसर कोशिकाओं के दृश्य के एक बड़े क्षेत्र पर कब्जा करने की क्षमता से मुआवजा दिया है । यह उपचार समूहों के बीच सांख्यिकीय तुलना करने के लिए आवश्यक नमूना जनरेट करने की क्षमता प्रदान करता है ।

इस प्रतिनिधि प्रयोग में, A431 EGFR सकारात्मक epidermoid कार्सिनोमा कोशिकाओं, 100ng के साथ उत्तेजित थे/एमएल EGF ligand के 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर EGFR clustering प्रेरित करने के लिए । आईसीएस विश्लेषण दोनों EGF उत्तेजित (आंकड़ा 1a) और उत्तेजित (चित्रा 1 डी) EGFR मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, सेटुक्सीमब लक्ष्यीकरण के साथ मशीन निंनलिखित कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया । बाद में, एक क्षेत्र (पीला बॉक्स) की एक 64x64 पिक्सेल फसल कोशिका झिल्ली के भीतर समाहित (आंकड़ा 1b और 1E) के लिए सहसंबंध समारोह का उपयोग संसाधित किया गया था मुक्त स्रोत छवि प्रसंस्करण मंच, फिजी में निहित था । इसके परिणामस्वरूप होने वाली सहसंबंध छवि को पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति द्वारा विभाजित करने से पहले सामान्यीकृत किया गया था, जो कि दोनों वर्ग के औसत तीव्रता के ब्याज के साथ-साथ फसली क्षेत्र में पिक्सेल्स की संख्या का वर्ग ( चित्रा 1C और 1F) । इस लाइन समारोह उपकरण के लिए इस छवि (चित्रा 1G और एक) के बिंदु-प्रसार समारोह के प्रोफ़ाइल साजिश किया गया था । आगे डेटा संसाधन के लिए एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग के लिए इन प्रोफ़ाइल का पीक मान स्थानांतरित किए गए थे । एक फिजी मैक्रो इन फिजी प्रक्रिया कक्षों की एक श्रृंखला (n = 6) के सेटुक्सीमब immunocytochemistry (चित्रा 1I) निंन दोनों उपचार समूहों से तीव्र प्रक्रिया के लिए कदम दोहराने के लिए उत्पंन किया गया था । इस प्रयोग में, EGFR रिसेप्टर की पहचान की थी ५.८४ ± ०.८५ क्लस्टर प्रति बीम क्षेत्र में A431 उत्तेजित कोशिकाओं की सतह पर १४.९४ ± १.६२ समूहों के प्रति उत्तेजित कोशिकाओं आबादी में बीम क्षेत्र. इस धारणा है कि प्रयोगात्मक इस विश्लेषण सीमा तेजी से रिसेप्टर कारोबार के लिए इस्तेमाल किया शर्तों के साथ, उत्तेजित A431 कोशिकाओं में EGFR क्लस्टर घनत्व में कमी आई २.५६-गुना. जब शर्तों में एक ही लक्ष्य अणु के एकत्रीकरण राज्य के लिए स्थितियों की तुलना कर रहे है जब लक्ष्य अणु बारी-over सीमित है, बीम क्षेत्र प्रति समूहों की एक कम संख्या में वृद्धि लक्ष्य एकत्रीकरण इंगित करता है । निम्न EGF ligand उत्तेजना EGFR एग्रीगेट बढ़ाता है २.५६-गुना के रूप में इस प्रणाली में अपेक्षित. एक फिजी इस प्रोटोकॉल में वर्णित कदम का उपयोग स्थूल की पीढ़ी के विभिंन उपचार या पर्यावरणीय मतभेदों और रिसेप्टर एकत्रीकरण पर उनके प्रभाव की सांख्यिकीय तुलना के लिए अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्रा 1: अनुयाई कैंसर कोशिकाओं के सेल सतह पर फ्लोरोसेंट लेबल समूहों का पता लगाने के लिए छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी । प्रतिनिधि EGF की फोकल माइक्रोस्कोपी छवि उत्तेजित (क) या उत्तेजित (घ) अनुयाई A431 epidermoid कार्सिनोमा सेटुक्सीमब प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल सेल सतह EGFR रिसेप्टर एलेक्स Fluor के साथ ४८८ माध्यमिक एंटीबॉडी. उत्तेजित कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया १०० एनजी/एमएल EGF 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर EGFR निर्धारण और immunocytochemistry से पहले clustering प्रेरित करने के लिए । पिक्सेल आयामों (६४ x ६४ [2n]) के साथ फसल क्षेत्रों (पीला बॉक्स) वाले कक्ष झिल्ली का उपयोग आईसीएस विश्लेषण (बी और ई) करने के लिए किया गया । फिजी/ImageJ में स्वत सहसंबंध फ़ंक्शन के निम्न सामांयीकरण, रेखा उपकरण (पीला) बिंदु फैलाओ फ़ंक्शन को मापने के लिए उपयोग किया गया था (C और F) इस पंक्ति फ़ंक्शन का प्रोफ़ाइल पीक मान (G और H का पता लगाने के लिए प्लॉट की गई है ). EGF उत्तेजना के लिए प्रेरित करने के लिए मनाया गया था २.५६-प्रकिया में कमी का पता लगाया EGFR क्लस्टर प्रति बीम क्षेत्र ५.८४ ± ०.८५ की तुलना में १४.९ 5 ± 1.62 को उत्तेजित कोशिकाओं (n = 6) (I) । इस धारणा के साथ, प्रयोगात्मक इस विश्लेषण में प्रयुक्त शर्तों कोशिका झिल्ली रिसेप्टर्स की एक निरंतर संख्या बनाए रखा, यह EGF उत्तेजना के बाद EGFR एकत्रीकरण में वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है. स्केल बार्स = 10 µm (A और D); 1 µm (बी-सी और ई-एफ) । बॉक्स प्लॉट अधिकतम और न्यूनतम का प्रतिनिधित्व करने वाली मूंछों के साथ Tukey शैली का उपयोग कर प्रदर्शित किया मानों कोई १.५ से अधिक × interquartile रेंज (IQR) । बीम क्षेत्र ± माध्य (SEM) के मानक त्रुटि प्रति क्लस्टर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी की तकनीक (आईसीएस) है कि हम इस प्रोटोकॉल में वर्णन विशेष डिटेक्टरों के लिए की आवश्यकता के बिना मानक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है । आईसीएस तकनीक का इस्तेमाल अच्छी तरह से स्थापित immunocytochemistry तरीकों की वृद्धि हुई सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कई उपचार शर्तों के तेजी से नमूने के लिए प्रदान करने के लिए । इस पद्धति निरपेक्ष परिशुद्धता में एक मामूली कमी के साथ ऐसा करता है के रूप में वैकल्पिक एकल अणु एक फोकल मात्रा, जैसे प्रतिदीप्ति के माध्यम से फैलाना मोबाइल अणुओं के प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव के संबंध पर आधारित तकनीक की तुलना में सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS)15. अधिक विशिष्ट FCS दृष्टिकोण भी उच्च संवेदनशीलता ऐसे हिमस्खलन photodiode (APD) या GaAsP डिटेक्टरों के रूप में एक साथ समर्पित विशेष सॉफ्टवेयर है कि नियमित रूप से मानक फोकल उपकरणों पर उपलब्ध नहीं है के साथ डिटेक्टरों गिनती फोटॉन की आवश्यकता है । आईसीएस की परिशुद्धता के एक व्यापक विश्लेषण इस तकनीक सही क्लस्टर की संख्या जहां > 1 कण लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप7के बीम फोकल स्थान के भीतर मौजूद है माप सकते है निर्धारित किया है ।

उपयुक्त फ्लोरोसेंट छवियों का संग्रह एक सफल आईसीएस विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है । ब्याज के क्षेत्र लेजर के साथ पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट अनुपात के लिए एक उच्च संकेत होते है और लाभ तीव्रता किसी भी संकेत संतृप्ति को दूर करने के लिए समायोजित होना चाहिए । सेलुलर क्षेत्र पर कब्जा कर लिया जाना चाहिए लगभग ५० एनएम के एक पिक्सेल आकार के साथ नमूना । इस क्षेत्र में सजातीय होना चाहिए, सावधान ध्यान payed के साथ सेलुलर किनारों या जंक्शनों जो कि एक सहसंबंध गणना में कलाकृतियों को बढ़ा सकते है से बचने के लिए । एक आईसीएस दृष्टिकोण के प्रमुख नुकसान में से एक विषम सेलुलर सतहों के लिए संवेदनशीलता है । इस प्रकार, अधिकतम सपाट सतह पर कब्जा कर लिया क्षेत्र सीमित, सेल आकार की परवाह किए बिना किसी भी आईसीएस विश्लेषण की सटीकता में सुधार होगा ।

रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स के एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एकाधिक इमेजिंग मोडलों का पता लगाया गया है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) प्रदान करता है उच्च संकल्प स्थानिक प्रोटीन के आकलन clustering लेकिन अत्यंत उच्च शूंय के तहत संचालित है और लौकिक संकल्प की आवश्यकता के अध्ययन के लिए लागू नहीं है । EM आगे अपनी कठोर नमूना तैयारी के रूप में सीमित है ऊतक जांच के रहने वाले5के लिए निषेध है । मानक फोकल माइक्रोस्कोपी के निहित संकल्प सीमाओं को दूर करने के लिए, Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) अतिव्यापी दाता और स्वीकारकर्ता fluorophores जोड़े 16 के साथ लेबल संरचनाओं के स्थानिक संगठन की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता . अपनी संवेदनशीलता के बावजूद, झल्लाहट हालांकि जांच6के तहत समुच्चय के आकार के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है । विभिंन सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तरीकों के विकास के लिए मानक संकल्प फोकल विधि17,18के साथ संभव नहीं सेलुलर वस्तुओं को हल करने के लिए रोमांचक अवसर प्रदान करते हैं । खर्च और विशेषज्ञता ऐसी प्रौद्योगिकियों और उपकरणों की आवश्यकता है, उनके वर्तमान आम उपलब्धता को सीमित करता है ।

फोकल इंस्ट्रूमेंटेशन में संवेदनशीलता और कम तस्वीर विषाक्तता में वृद्धि के साथ, छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी समय चूक प्रयोगों में जीवित कोशिकाओं में रिसेप्टर एकत्रीकरण के अस्थायी परिवर्तन का पता लगाने के लिए विस्तारित किया जा सकता है. इस लेजर को जानबूझकर बाद आईसीएस आकलन (pbICS) के साथ व्यक्तिगत नमूनों के फोटो ब्लीचिंग के अलावा कुछ रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स9में मौजूद उच्च आदेश एकत्रीकरण चिढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया शक्ति बढ़ाने के साथ झकझोरता किया जा सकता है । एक और अनुकूलन, छवि पार सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (ICCS) प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन19के लिए छवि जोड़े के विश्लेषण के माध्यम से दो झिल्ली आधारित प्रोटीन के सह स्थानीयकरण का एक विश्लेषण प्रदान करता है । इस छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी पद्धति की ताकत यह है कि यह अच्छी तरह से क्षेत्र में स्थापित तकनीक leverages और मात्रात्मक अत्यधिक गतिशील कोशिका झिल्ली पर होने वाली घटनाओं के लिए एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध विश्लेषण पाइपलाइन प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एंड्रयू एम स्कॉट AbbVie Pharmaceutics, EMD सेरोनो और डायची-Sankyo Co से अनुसंधान अनुदान सहायता है, और जीवन विज्ञान फार्मास्यूटिकल्स के एक परामर्श और शेयर स्वामित्व है । लेखक कोई अंय प्रासंगिक संबद्ध या किसी भी संगठन या संस्था या विषय के साथ वित्तीय संघर्ष में एक वित्तीय हित के साथ वित्तीय भागीदारी या पांडुलिपि में चर्चा की सामग्री के अलावा उन लोगों से खुलासा किया है ।

Acknowledgments

लेखक NHMRC (फैलोशिप १०८४१७८ और अनुदान १०८७८५०, १०३०४६९, १०७५८९८ (एम्स)), कैंसर ऑस्ट्रेलिया, लुडविग कैंसर अनुसंधान, जॉन टी रीड ट्रस्ट, इलाज ब्रेन कैंसर फाउंडेशन, ला Trobe विश्वविद्यालय और विक्टोरिया कैंसर एजेंसी से धन समर्थन स्वीकार करते हैं । विक्टोरियन सरकार द्वारा प्रदत्त प्रचालनात्मक अवसंरचना सहायता कार्यक्रम से धन, ऑस्ट्रेलिया को भी स्वीकार किया जाता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well ThermoFisher Scientific 155409
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red ThermoFisher Scientific 12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm ThermoFisher Scientific T7279
Cetuximab Merck Serono 3023715501
Parafilm M 38mx100mm Merck Millipore BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ProSciTech C004
Recombinant Human EGF R&D System 236-EG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14 (2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801 (2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7 (2007).

Tags

जीवविज्ञान अंक १३८ फोकल माइक्रोस्कोपी छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीएस) एंटीबॉडी: रिसेप्टर बातचीत एंटीबॉडी-औषध-संयुग्मी (एडीसी) imageJ फिजी छवि प्रसंस्करण clustering एकत्रीकरण
फोकल माइक्रोस्कोपी छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिका सतह रिसेप्टर एकत्रीकरण का पता चलता है
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A.,… More

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A., Lock, P., Scott, A. M. Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57164, doi:10.3791/57164 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter