Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57164
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,5,6,7
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Summary

Hedef reseptörleri hücre yüzeyinde bağlanan antikorlar uyum ve küme değişikliklerini görüşmek. Bu dinamik değişiklikler ilaç geliştirme hedef hücrelerdeki karakterize konusunda da etkileri vardır. Bu iletişim kuralı confocal mikroskobu ve görüntü korelasyon spektroskopisi ile hücre yüzeyinde kümeleme reseptör kapsamını ölçmek için ImageJ/FIJI kullanır.

Abstract

Confocal mikroskobu alt hücresel etkileşimlerin karakterizasyonu ve daha da geliştirilmesi ile floresan problar etiketli önceden klinik ajanların kritik yakalamak için erişilebilir bir yöntem sağlar. Antikor dayalı sitotoksik ilaç son gelişmeler ile dağıtım sistemleri, reseptör toplama ve içselleştirilmesi bölge içindeki Bu aracılar tarafından indüklenen değişiklikler anlama kritik öneme sahiptir. Floresan immunocytochemistry köklü metodolojisi ve ImageJ, açık kaynak FIJI dağıtım dahili otokorelasyon ve resim matematiksel işlevler kayma görüntü korelasyon gerçekleştirmek için bu iletişim kuralını güçlendirir spektroskopisi (ICS). Bu iletişim kuralı etiketli reseptörleri floresan yoğunluğu confocal mikroskop ışını alan bir fonksiyonu olarak quantitates. Bu hücre yüzeyinde niceliksel ölçüsüdür hedef molekül toplama durumunu sağlar. Bu metodoloji genişletin zamansal reseptör toplama soruşturmalar için potansiyeli statik hücrelerin karakterizasyonu odaklanmıştır. Bu protokolü de kullanan teknikleri ve görüntüleme cihazları-İhtisas kurulan hücre yüzeyde oluşan olaylar kümeleme miktar sağlamak için erişilebilir bir metodoloji sunar.

Introduction

Terapötik antikorlar gelişimi birden fazla tümör tip1tedavisinde olağanüstü başarı göstermiştir. Antikor: reseptör etkileşimleri hücreden dinamiklerini anlamak için gereksinimleri sitotoksik bileşikler için teslimat mekanizmalarını genişletti sıra antikor-uyuşturucu conjugates (ADC) son gelişmeler2yüzey. Başarılı bir antikor hücre yüzey reseptör için hedefleme takiben, bu komplekslerin olanlara ligand: antikor etkileşimleri3' te gözlemlenen benzer toplama modeller tetikleyebilir. Reseptör toplama içinde değişiklikler hücre yüzeyinden membran ve içselleştirilmesi sonucu reseptör ve onun kaldırma için değişiklikleri tetikleyebilir. Bir antikor-uyuşturucu eşlenik bağlamında, bu işlemi daha sonra içine içselleştirilmiş endosomes ve daha sonra etkili hücre öldürme kaynaklanan sitoplazma, sitotoksik yükü serbest bırakır.

Confocal mikroskobu antikorlar ve onların hedef reseptörleri4önemli bu etkileşimleri görselleştirmek için etkili bir yol sağlamıştır. Toplama hedef molekülün hücre yüzeyinde değişiklikler keşfetmek için bir kayma görüntü korelasyon spektroskopisi (ICS) tekniği 5,6,7 ile confocal mikroskobu görüntülerin işlem sonrası bu protokolü kullanır .

Görüntü korelasyon spektroskopisi kayma floresan yoğunluğu dalgalanmaları etiketli yapıları yoğunluğu ve toplama durumunu arasında bir ilişki paylaşmak gözlem temelidir. Bu ilişki bir kayma otokorelasyon işlev yakaladığınız görüntüyü5hesaplanması aşağıdaki kurulur.

Tüm değişik-in resim korelasyon spektroskopisi bir görüntü otokorelasyon hesaplanması gerekir. Bu iki boyutlu bir Gauss eğrisi görüntü içinde bulunan nicel toplama durumu parametreleri çıkarım için bu işleve yaklaştırarak takip ediyor. Tek bir görüntü içinde bulunan ve olasılığını hesaplamak mümkün piksel ikili karşılaştırma bir görüntü otokorelasyon hesaplanması açısından basit içerir bu ikisi de eşit diğer her kadar parlak. Bu işlev mesafe ve yön piksel ayrılık8görüntülenir.

Kuramsal çerçeve resim korelasyon spektroskopisi için kurulan ve Petersen ve Wiseman ve arktarafından tanımlanan. 5 , 6. bu protokol için otokorelasyon hesaplamalar Fiji/ImageJ gibi bir elektronik tablo uygulaması yapılır, yoğunluk dalgalanma kayma otokorelasyon fonksiyonu için temel (Eq 1)tarif edilebilir:

Equation 1     

Burada F Fourier dönüşümü gösterir; F– 1 ters Fourier dönüşümü; F * onun karmaşık eşleniği; ve kayma gecikme değişkenleri ε ve η. Kayma ICS bu protokol için açıklandığı gibi otokorelasyon işlevi bir 2D hızlı Fourier dönüşümü algoritma7,9kullanılarak hesaplanabilir. Aksi halde sıfır-lag, g11(0,0) bilinen sıfır kayma ayırma, otokorelasyon parçacıklar mikroskop ışını alan mevcut ters ortalama sayısını sağlar. İki boyutlu bir Gauss işlev (Eq 2)kayma otokorelasyon işleve yaklaştırarak elde edilebilir:

Equation 3     

Bir görüntü içinde çekilen piksel ayarlama alanı içinde bulunan ve bu ölçümler sonsuza kadar uzatmak değil gibi dönem g∞ görüntü içinde bulunan uzun menzilli uzamsal ilişkiler için hesap için bir mahsup hesabı kullanılır. İçin toplamları, moleküler büyüklükteki ω mikroskop noktası yayıldı fonksiyonu ve yarı-maksimum kayma otokorelasyon işlevinin tam genişlikte tarafından açıklanan. Araç noktaya yayılmış işlev içinde yer alan alt çözünürlük floresan boncuklar kullanılarak kalibre edilmesi.

Burada açıklanan resim korelasyon spektroskopisi için protokol, otokorelasyon ve ICS tamamlamaya yönelik matematik fonksiyonları kullanarak açık kaynak görüntüleme-işlem platformu, Fiji10, ImageJ bir dağıtım gerçekleştirilir Program11,12. Fiji/ImageJ önceden yüklenmiş hızlı Fourier dönüşümü FFT matematik işlev kullanır. Bu işlev her boyut13' te ikinin katları tarafından veri aralığını azaltarak bu hesaplanması gereken compute süreyi azaltır. 2D otokorelasyon işlev yaklaşık x, y ekseni, simetrik olduğu gibi bir tek satır profil Arsa otokorelasyon görüntü yoluyla ham otokorelasyon kayma gecikme bir fonksiyonu olarak ölçmek için kullanılabilir. Herhangi bir sıfır-lag gürültü ifade (Eq 3)ile arka plan için düzeltilmiş daha fazla hesaplama, elde edilen otokorelasyon genlik (en yüksek değer, g(0)T) ile önce kaldırılır:

Equation 4     

nerede benb hücre hariç bir arka plan bölgeden gelen ortalama yoğunluğu olduğunu. Küme yoğunluğu veya floresan nesneleri, yoğunluğu (Eq 4)tarafından tanımlanır:

Equation 5    

Burada açıklanan protokolünde bir normalleştirilmiş otokorelasyon işlevi artan kayma lag ile 1.0 yaklaşan bir değere çürüme gözlem temel varsayımı ile küme yoğunluğu (CD), sade bir şekilde hesaplanması daha ayrıntılı. Maksimum kayma gecikme ile yoğunluk değerleri floresans artık herhangi bir korelasyon yoktur ve böylece bir korelasyon hesaplamalar bu bölge, daha sonra bölünür Bu yoğunluğu ile çarpılır bir yoğunluk değerini bilgisayar Meydanı 1.0 için eşit olan tanımı gereği bu yoğunluk. Böylece, küme yoğunluğu bir normalleştirilmiş otokorelasyon işlevden 1.0 önce onun karşılıklı (Eq 5)alarak normalleştirilmiş otokorelasyon işlevden çıkararak hesaplanabilir:

Equation 6     

Eni çevrenin daha da kalibrasyon enstrümanın noktaya yayılmış işlev alanı içinde bulunan küme sayısı quantitate için gerçekleştirilebilir. Bu kalibrasyon görüntü korelasyon spektroskopisi çözümleme sırasında kullanılan aynı optik koşullar kullanarak gerçekleştirilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. deney görüntüleme için yapisan hücre satırlarını tohumlama

  1. İyi geceleme (O/N) 300 µL % 10 içeren Dulbecco'nın modifiye kartal orta/besin karışımı F-12 (DMEM/F-12) medya başına 10.000 A431 epidermoid Karsinomu Hücre tohum Fetal sığır Serum, 1 penisilin-streptomisin ve % %1 GlutaMAX bir 8 odalı görüntüleme slayt için yüksek çözünürlüklü yağı daldırma objektif lens uygun (Örneğin, NuncTM laboratuar-TekTM odalı coverglass).
  2. Reseptör toplama 100 ng/mL EGF ligand medya (RT) Oda sıcaklığında 10 dakika ilavesi ile A431 hücreleri üzerinde teşvik.

2. birincil antikor kuluçka

  1. Medyayı çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu tuz (1 x PBS) 300 µL hücrelerle iki kez yıkayın.
  2. PBS içinde % 4 paraformaldehyde 10 dk RT. az için 200 µL ile hücreleri tamir
    Not: geçici değişiklikler hedef toplama keşfetmek için bu fiksasyon adımı ihmal gerekir.
  3. İngiltere'de yılın kaldırmak ve oda sıcaklığında PBS 300 µL hücrelerle iki kez yıkayın.
  4. 10 µg/mL için en az 2 h 4 ° C'de bir konsantrasyon, birincil antikor içeren PBS 200 µL hücrelerle kuluçkaya
    Not: ICS hesaplamaları geçerli olması için tüm reseptörleri hücre yüzeyi mevcut birincil antikor ile etiketlenmesi gerekir. Bu birincil her antikor seyreltme dizi ile ön deneyler gerektirir (1:10, 1:50, 1: 100, 1: 200, 1:500 1:1, 000, vb) gerçekleştirilecek. Optimum birincil antikor konsantrasyon küme yoğunluğu karşı Floresan Yoğunluk Analizi ile belirlenir. Küme yoğunluğu yaylalar küme yoğunluğu non-spesifik antikor bağlama bir sonucu olarak bir artış daha önce birincil antikor konsantrasyonları artan ile seçilen birincil konsantrasyonu oluşur. Birincil antikor serum ücretsiz medyada bir zaman ders görüntüleme deneyi gerçekleştirmek Eğer seyreltilmiş.
  5. İstenen kuluçka süresi tamamlanmasını takiben, RT PBS 300 µL hücrelerle iki kez yıkayın.
  6. %5 Sığır serum albümin (BSA) PBS içinde en az 2 h 4 ° C'de için örnekle engellemek
    Not: Sabit örnekleri rutin olarak engellenir gecelik (O/N) 4 ° C'de

3. ikincil antikor kuluçka

  1. 10 µg/mL stokunun fluorescently PBS ikincil antikor (Örneğin Alexa 488 Fluor IgG) etiketli hazırlayın. Höchst 33342 2 µg/mL mikroskop gelişmiş örnek keşif için izin vermek için bu seyreltme eklenebilir.
    Not: hızlandırılmış deneyler için PBS serum boş ortam için değiştirilebilir.
  2. %5 kaldırmak BSA/PBS hücrelerden ve ortam ışığı örnekleri koruyarak 4 ° C'de 2 h için ikincil antikor çözüm ile kuluçkaya.
  3. İkincil antikor kuluçka süresi tamamlandığında, PBS (iki kez), 300 µL hücrelerle yıkayın ve ortam ışığı koruma 4 ° C'de depolayın.
  4. Buharlaşma önlemek için parafilm odası slaytla kenarlarını sarın.

4. confocal mikroskobu örnekleri

Not: confocal analiz için kullanılan ayarları ekipman ve fluorophores bireysel deneyde kullanılan bağlı olarak farklı olacaktır. Modern confocal aletleri enstrümanın yerel görüntü dosyası biçiminde deneyinde kullanılan tüm görüntüleme parametreler kaydetmek için mekanizmalar kullanır. Bu ayarlar veri toplama farklı dönemleri arasında deneysel koşullar uygun çoğaltma için sağlamak için kaydedilir önemlidir.

  1. Floresan sinyallerini görüntüleme sırasında aşırı doygunluk kaçının. Piksel doygunluk yanlış renk gösterimini sağlar tablo bir resim arama kullanın ve dedektör kazanç azaltmak ve buna göre güç lazer. En confocal aletleri bir "aralığı göstergesi" ayarını veya benzer seçenek satın alma yazılım bunun için içerir.
  2. Fluorophore güç lazer ilgi pozlandırmayı en aza indirmek. Höchst 33342 gibi DNA etiketleme leke kullanımını algılamak ve örnek koleksiyon önce görüş alanı yerleştirmek için kolay bir mekanizma sağlar.
  3. Düşük çözünürlükte örnek ilk taramalar gerçekleştirmek ve yazılım hızlı izin verir Eğer tarama hızı. Bu örnek mümkün photobleaching sınırlar.
  4. Yakalama çözünürlüğünü artırmak ve hazır olduğunuzda görüntü verilerini toplamak tarama hızı yavaş.
  5. Confocal enstrüman izin veriyorsa, bir foton modu sayma kullanarak veri toplamak.
    Not: foton sayma araç üzerinde kullanılabilir değilse: gri düzeyleri doğrusal resim alma sırasında olduğundan emin olun.
  6. İğne deliği ve sondaj 1 havadar birimine (AU) kullanılan her lazer çizgi için ayarlayın.
  7. Kullanım satır veya çerçeve dedektörü azaltmak için resim alma sırasında (x4) ortalama gürültü ilişkili.
    Not: yalnızca bir zaman noktası yakalanır gibi ICS bu varyant edinme zaman deneysel değil faktörü sınırlama.
  8. Resim koleksiyonu seçin yüksek büyütme maksimum çözünürlük ve düzeltme için küresel ve kromatik aberasyonları (planı-Apochromat 100 X veya 63 X /1.40 örnekler sağlamak için bir Plan-Apochromat amaç gibi yüksek sayısal diyafram amaç için Petrol hedefleri).
  9. Görüntüyü içinde yakalanan piksellerin boyutunu oversample. Her piksele bir 50 x 50 nm bölge yakalama önerilir. Etkili ICS için piksel boyutu 0.1 x 0,1 µm2 piksel başına daha az olmalıdır. Bu nispeten küçük bir alanda taramak için yakınlaştırma ve nispeten büyük resim biçimi (Örneğin 1024 x 1024 veya 2048 x 2048 piksel) seçerek bir kombinasyonu tarafından gerçekleştirilir.
  10. Hücre bir bölge gibi dümdüz, apikal veya bazal yüzeyi odak. Birden fazla hücreyi tek bir görüntü ve bölgelerde ayrı ayrı ICS çözümleme sırasında işlenen ilgi toplanabilir.
  11. Örnek normalleştirme için kullanılan aynı araç ayarları kullanarak bir hücre ücretsiz arka plan bölge yakalamak.

5. resim korelasyon spektroskopisi hesaplanması

Not: Açık kaynak görüntüleme-işlem platformu, Fiji, bir dağıtım ImageJ programının otokorelasyon ve matematiksel işlevler ICS için temel gerçekleştirmek için gereklidir. Çok sayıda önceden yüklenmiş eklentiler ve birden çok görüntüleme deneyler işlemleri yapabilirsiniz daha kolay bir güncelleştirme mimari içerir bu şekilde dağıtılması, ImageJ önerilir.

  1. Fiji programı (http://fiji.sc/Downloads) yükleyin.
  2. Alınan veri yükleyin.
  3. Faiz ve yinelenen piksel boyutunu 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64) için apikal veya bazal hücre yüzey membran bölgesi tanımlayın. "Menü: görüntü > yinelenen..."
  4. Kırpılan alanı ilgi ortalama yoğunluğunu hesaplamak "menü: Analiz > ölçümleri."
  5. Bir arka plan bölge tanımlamak ve yinelenen yakalama hücre yüzey membran aynı piksel boyutunu (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menü: görüntü > yinelenen..."
  6. İlgi alanı kırpılmış arka plan ortalama yoğunluğunu hesaplamak. "Menü: Analiz > ölçümleri."
  7. Görüntü faiz bölge içeren kökenli ortalama yoğunluğu çıkarma. "İşlem > görüntü hesap makinesi > çıkarın."
  8. Otokorelasyon hesaplama gerçekleştirmek. Bu hesaplama menü yapısı içinde yer alıyor: "işlem > FTT > FD matematik."
    1. FD Math'kutusunu seçin iletişim: görüntü 1: kırpılmış görüntü adı, işlem olarak korelasyon, resim 2: kırpılmış görüntü adı, ters dönüşüm üzerinde.
  9. Ortaya çıkan görüntü piksel toplam sayısına bölerek normalize. "Menü: işlem > Matematik > bölmek..." (yani: 64 x 64 piksel 4096 =)
  10. Tekrar normalleştirilmiş ortalama yoğunluğu tarafından bölünmesi ile kare alan kırpılmış normalleştirmek. "Menü: işlem > Matematik > bölmek..."
    Not: Bu görüntü ortalama yoğunluk değeri tarafından iki kez bölerek elde edilebilir.
  11. Noktaya yayılmış işlevi bir çizgi çizin.
  12. Tepe değeri hesaplamak için bu satırı profil çiz. "Menü: Analiz > Arsa profil."
  13. Bir e-tabloya tepe değeri (5.12 sonucu) aktararak ışını alan başına kümeleri hesaplamak ve (Eq 6) aşağıdaki hesaplama:
    Equation 7

6. toplu işleme ICS veri kümeleri

Not: FIJI/ImageJ makro kurulması yukarıdaki iletişim kuralında tanımlanan yordamlar çoğaltmak için önerilir. Bu görüntü korelasyon Spektroskopi analiz sırasında birden fazla resim dosyaları tutarlı ve hızlı analiz için sağlar.

  1. ICS protokolünde her menü komutu kaydederek bir makro ICS iş akışı kurmak
    "Menü: Eklentiler > makrolar > kayıt...".
  2. "Makro oluşturmak için Oluştur" seçeneğini belirleyin.
  3. Seçin "dil > IJ1 makro."
  4. Makroyu kaydedin.
  5. Makronun her işlev işleçleri için anımsatıcılar sağlayan çeşitli adımlar için iletişim kutuları eklemek. İletişim kutuları da daha fazla işlem (Örneğin, bölge kırpmak için) önce yapılması uygun seçimler için izin vermek için analiz süreci duraklatmak için bir yöntem olarak hizmet.
    1. İletişim kutusu makro kodu
      Başlık = "İletişim kutusu başlığı";
      msg = "İletişim kutusu/iletişim kuralı adım iletisi";
      waitForUser (başlık, msg);
      Not: Ek verimliliği FIJI Güncelleyici (yönergeler https://imagej.net/BAR) içinde BAR update sitesine abone olarak kurulabilir. Bu "geniş ilgili yordamları topluluğu" 14ile FIJI sağlar. Böyle bir rutin bul tepeler var. Menü yapısı: "BAR > Veri Analizi > bul tepeler." Bu komut dosyasını hızlı bir nokta profilde tepe değeri işlev yaymak hesaplama araçları sunmaktadır.

7. iletişim kuralı uzantıları: Hesaplama mikroskop ışın alanının

Not: Mikroskop optik transfer fonksiyonu bile moleküler büyüklükteki nesneler hakkında yarıçaplı görüntü olarak görüntülenir sağlar x-y uçaktaki 200-300 nm. ICS iletişim kuralı alt çözünürlük floresan boncuk üzerinde 4-5 adımları gerçekleştirerek noktası yayıldı fonksiyonu tayini sağlar. Özellikle:

  1. Alt çözünürlük monte (yani < 100 nm çapında) üzerine 8 floresan boncuk Oda görüntüleme slayt.
  2. Başı olarak açıklanan protokol ICS deneyler için kullanılan confocal mikroskop kullanarak görüntü boncuk.
  3. Ortaya çıkan görüntü Protokolü adımları 5.1-5.13 göre ICS işlevinden hesaplayın.
  4. Çizilen profilden ışın RADIUS (r) ICS işlevinin yarım maksimum değeri tam genişlikte olarak hesaplayın.
  5. Işın alan (BA) (Eq 7) hesaplamak:Equation 8

8. iletişim kuralı uzantıları: Hesaplama alanının birim kümelerinin

  1. Küme yoğunluğu (CD) alan adedi (Eq 8olarak) hesaplamak:
    Equation 9
    Equation 10
  2. Işın alan (5.13 sonucu) başına kümeleri (7,5 sonuç) kiriş alanına göre bölün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Başarılı görüntü korelasyon spektroskopisi deney tedavi denetimleri düzgün uygulama üzerinde bağlıdır. Bu tedavi grupları floresans incelenmesi yok birincil antikor ve hiçbir ikincil antikor tedavi gruplarını içerir. Kez optimum confocal lazer ayarları bir deney için kurulan örnek içinde non-spesifik floresans eksikliği onaylamak için bu denetim grupların görüntüleri yakalanması gerekir. Birçok yapisan kanser hücre hatlarında bölgeleri ICS için uygun tanımlaması düz yüzeyler eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Bu büyük bir görüş alanı tek bir confocal görüntüde birden çok kanser hücrelerinin yakalama yeteneği tarafından telafi olduğu. Bu tedavi gruplar arasında istatistiksel karşılaştırmaları yapmak için gerekli örnekleme oluşturma yeteneği sağlar.

Temsilcisi bu deneyde A431 EGFR olumlu epidermoid Karsinomu Hücre, 100ng/mL EGF ligand kümeleme EGFR ikna etmek için oda sıcaklığında 10 dakika ile teşvik. ICS çözümlemesi her iki EGF üzerinde yapılan uyarılmış (Şekil 1A) ve unstimulated (Şekil 1 d) hücreleri kuluçka insanlaşmış monoklonal antikor, cetuximab hedefleme EGFR ile takip. Daha sonra 64 x 64 piksel kırpma bölgesinin (sarı kutu) hücre zarı içinde yer alan (Şekil 1B ve 1E) işlendiği otokorelasyon işlevi kullanmak açık kaynak görüntü işleme platformu, FIJI bulunan. Ortaya çıkan bu otokorelasyon görüntü Ortalama Yoğunluk ilgi normalleştirilmiş bölge hem de kırpılmış bölge ( piksel sayısını kare kare her iki bölme önce arka plan floresans çıkararak normalleştirilmiş yapıldı. Şekil 1 c ve 1F). Satır işlevi aracı bu görüntü noktası yayıldı fonksiyonu profil çizmek için kullanılmıştır (Şekil 1G ve 1 H). Bu profilleri en yüksek değerini daha fazla veri işleme için bir elektronik tablo uygulaması için aktarılmış. FIJI makro hücreler bir dizi hızlı işleme için FIJI işleme adımları çoğaltmak için oluşturulan (n = 6) cetuximab immunocytochemistry (Şekil 1I) aşağıdaki her iki tedavi gruplardan. Bu deneyde, kümelerde 5,84 ± 0,85 ışını alan başına 14.94 ± 1,62 karşı uyarılmış hücre kümeleri ışını alan unstimulated hücreleri nüfus başına A431 yüzeyinde EGFR reseptör tespit edilmiştir. Deneysel koşullar bu analiz sınırı hızlı reseptör ciro için kullanılan varsayımı ile 2.56-fold uyarılan A431 hücreleri EGFR küme dansitesi azalmıştır. Hedef molekül dönüş-over sınırlı olduğunda koşulları için aynı hedef molekül koşullarında toplama durumunu karşılaştırıldığında daha düşük bir sayı kümelerinin ışını alan başına artan hedef toplama gösterir. EGF ligand stimülasyon EGFR toplama takip 2.56-fold bu sistemde beklendiği gibi artırır. Bu protokol için açıklanan adımları kullanarak bir FIJI makro nesil çeşitli tedaviler veya çevre farklılıklar ve reseptör toplama üzerindeki etkileri istatistiksel karşılaştırılması için izin verir.

Figure 1
Şekil 1: görüntü korelasyon spektroskopisi fluorescently algılamak için etiketli hücre yüzeyine yapışık kanser hücrelerinin kümelerde. Confocal mikroskobu görüntüsü temsilcisi EGF uyarılmış(a)veya unstimulated (D) yapisan A431 epidermoid Karsinomu hücre hücre yüzey EGFR reseptör Alex Fluor 488 ikincil ile hedefleme cetuximab birincil antikor taşır antikor. Teşvik hücreleri 100 ng/mL EGF fiksasyon ve immunocytochemistry önce kümeleme EGFR ikna etmek için oda sıcaklığında 10 dakika ile tedavi edildi. Hücre zarı içeren kırpma bölgeleri (sarı kutu) piksel boyutları (64 x 64 [2n]) ile (B ve E) ICS çözümlemeyi gerçekleştirmek için kullanılan. FIJI/ImageJ otokorelasyon işlevinde normalleştirme, çizgi aracını (sarı) yaymak noktası işlevi (C ve F) ölçmek için kullanılan bu bekleme fonksiyonu profil (G ve H en yüksek değeri tespit etmek için çizilen ). EGF stimülasyon gözlenen EGFR kümeleri ışını alan 5,84 ±0.85 unstimulated hücrelere 14.9 5±1.62 göre ücret tespit 2.56-fold bir düşüş ikna etmek için (n = 6) (I). Varsayım, hücre membran reseptörleri, sabit bir sayı tutulan bu analizde kullanılan deneysel koşullar ile bu EGF stimülasyon takip EGFR toplama bir artış gösterir. Ölçek çubukları = 10 µm (A ve D); 1 µm (B-C ve E-F). Arsa ile en çok 1.5 × interquartile aralığı (IQR) maksimum ve minimum gözlenen değerleri temsil eden bıyık Tukey stil kullanılarak görüntülenen kutu. Kümeleri ışını alan ± standart hata, yani (SEM) başına. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz bu protokol için tarif görüntü korelasyon spektroskopisi (ICS) Teknik uzman Dedektörleri için gerek kalmadan standart confocal mikroskoplar kullanır. Açıklanan ICS tekniği artan istatistiksel analiz için birden fazla tedavi koşullardan hızlı örnekleme sağlamak için köklü immunocytochemistry yöntemleri kullanır. Bu metodoloji kadar tam olarak floresans dalgalanmaları floresans gibi confocal bir birim aracılığıyla difüzyon mobil moleküllerin korelasyon dayalı alternatif tek molekül teknikleri ile karşılaştırıldığında hafif bir azalma yok korelasyon spektroskopisi (FCS)15. Daha özel FCS yaklaşım aynı zamanda yüksek hassasiyet foton dedektörler çığ fotodiyot (APD) gibi veya GaAsP dedektörleri ile birlikte düzenli olarak standart confocal aletleri üzerinde kullanılamaz adanmış özel yazılım sayım gerektirir. Bu teknik doğru küme sayısını ölçmek ICS duyarlığını kapsamlı bir analizini tespit nerede > 1 parçacık mikroskop7tarama lazer ışını odak nokta içinde mevcuttur.

Başarılı bir ICS analiz için kritik öneme sahip uygun floresan görüntüleri koleksiyonudur. Bölgenin ilgi arka plan floresan oranı yüksek bir sinyal lazer ile içerir ve herhangi bir sinyal doygunluk kaldırmak için ayarlanmış yoğunluklarda kazanmak gerekir. Yakalanan hücresel bölge yaklaşık 50 piksel boyutu ile oversampled nm. Bu bölge dikkat hücresel kenarları veya otokorelasyon hesaplama aktarımında artırabilir kavşak önlemek için ödenir ile homojen olması gerekir. Türdeş olmayan hücresel yüzeyler için duyarlılık bir ICS yaklaşım büyük tuzaklar biridir. Böylece, en fazla düz yüzeye yakalanan bölge sınırlama, hücre şekli ne olursa olsun herhangi bir ICS Analizi doğruluğunu artıracaktır.

Birden çok görüntüleme yöntemleri reseptör kompleksi Toplama çalışmaya incelemiş bulunuyoruz. Elektron mikroskobu (EM) protein kümeleme yüksek çözünürlüklü mekansal değerlendirmesi sağlar ama son derece yüksek vakum altında çalışır ve zamansal çözünürlük gerektiren çalışmalar için geçerli değildir. EM daha da sert örnek hazırlık yaşamak için engelleyici olduğu gibi sınırlı doku araştırmalar5. Standart confocal mikroskobu, Förster rezonans enerji transferi doğal çözünürlük sınırlamaları aşmak için (FRET) donör ve alıcısı fluorophores çiftleri16 örtüşen ile etiketli yapıları mekansal organizasyonu hesaplamak için kullanılabilir . Hassasiyeti rağmen FRET ancak soruşturma6altında toplamları boyutu ile ilgili bilgi sağlamaz. Çeşitli Süper çözünürlük floresans mikroskobu Yöntem geliştirme hücresel nesneleri ile standart çözünürlük confocal yöntemleri17,18mümkün değil çözmek için heyecan verici fırsatlar sağlar. Gider ve bu teknolojileri ve aletleri, gereken uzmanlık sınırlar geçerli sıradan kullanılabilirliklerini.

Duyarlılık artar ve düşük fotoğraf-toksisite confocal araçları ile görüntü korelasyon spektroskopisi reseptör toplama hızlandırılmış deneyler canlı hücrelerde geçici değişiklikler keşfetmek için genişletilebilir. Bu ayrı üst düzey toplama bazı reseptör kompleksleri9' mevcut kızdırmak için kasten sonraki ICS değerlendirme sistemi (pbICS) ile bireysel örneklerinin fotoğraf ağartma ikna etmek için kullanılan lazer gücü artan ile bitişik. Başka bir adaptasyon, görüntü çapraz korelasyon spektroskopisi (ICCS) iki esaslı membran proteinlerinin görüntü çiftleri her fluorescently etiketli protein19analizi ile ortak lokalizasyonu analizi sağlar. Bu iyi alanında kurulmuş teknikleri güçlendirir ve serbestçe kullanılabilir analiz boru hattı için nicel hücre zarının oluşan son derece dinamik olaylar sağlar bu görüntü korelasyon Spektroskopi yöntemi gücüdür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Andrew M Scott AbbVie ilaç sanayii, EMD Serono ve Daiichi Sankyo Co destek finansman araştırma ve bir danışmanlık ve Yaşam Bilim İlaç hisse senedi sahipliğini vardır. Yazarlar hiçbir diğer ilgili üyelikler veya herhangi bir organizasyon ile mali müdahalesi veya mali ilgi ile varlık ya da konu veya el yazması bu ifşa dışında ele malzemeleri mali çatışma var.

Acknowledgments

Çekmek--dan NHMRC (arkadaş grubu 1084178 ve hibe 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), fon yazarlar kabul kanser Avustralya, Ludwig kanser araştırmaları, John Reid T güvenir, tedavi beyin kanseri Vakfı, La Trobe Üniversitesi ve Victoria kanser Ajansı. Operasyonel altyapı destek programı Victoria Hükümeti tarafından sağlanan fon, Avustralya da kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well ThermoFisher Scientific 155409
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red ThermoFisher Scientific 12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm ThermoFisher Scientific T7279
Cetuximab Merck Serono 3023715501
Parafilm M 38mx100mm Merck Millipore BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ProSciTech C004
Recombinant Human EGF R&D System 236-EG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14 (2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801 (2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7 (2007).

Tags

Biyoloji sayı 138 Confocal mikroskobu görüntü korelasyon spektroskopisi (ICS) antikor: reseptör etkileşimleri antikor-uyuşturucu-eşlenik (ADC) imageJ Fiji görüntü işleme kümeleme toplama
Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A.,… More

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A., Lock, P., Scott, A. M. Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57164, doi:10.3791/57164 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter