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Biology

Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57164
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,5,6,7
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Summary

Anticorpos que se ligam a receptores de alvo na superfície da pilha podem conferir alterações clusterização e conformação. Estas mudanças dinâmicas têm implicações para caracterizar o desenvolvimento de drogas em células-alvo. Este protocolo utiliza a microscopia confocal e espectroscopia de correlação de imagem através do ImageJ/FIJI para quantificar a extensão do receptor na superfície das células de clustering.

Abstract

Microscopia confocal fornece uma metodologia acessível para capturar sub celulares interações críticas para a caracterização e desenvolvimento de agentes pré-clínicos rotulado com sondas fluorescentes. Com recentes avanços em drogas citotóxicas anticorpo com base em sistemas de distribuição, compreendendo as alterações induzidas por esses agentes dentro do Reino da agregação do receptor e internalização é de importância crítica. Este protocolo utiliza a metodologia bem estabelecida de imunocitoquímica fluorescente e a distribuição de FIJI de fonte aberta do ImageJ, com sua inerente autocorrelação e funções matemáticas de imagem, para realizar a correlação espacial de imagem espectroscopia (ICS). Este protocolo dosa a intensidade fluorescente de receptores rotuladas como uma função da área do feixe do microscópio confocal. Isto fornece uma medida quantitativa do estado de agregação de molécula alvo na superfície da célula. Esta metodologia está voltada para a caracterização de estáticas células com potencial para expandir em investigações temporais de agregação do receptor. Este protocolo apresenta uma metodologia acessível para fornecer a quantificação dos eventos que ocorrem na superfície da célula, utilizando bem estabelecida não especializada aparelhos de imagem e técnicas de clustering.

Introduction

O desenvolvimento de anticorpos terapêuticos demonstrou notável sucesso no tratamento de vários tipos de tumor1. Os avanços recentes da droga-anticorpo o cojugado (ADC) como mecanismos de entrega para compostos citotóxicos expandiu-se os requisitos para a compreensão da dinâmica de interações de anticorpo: receptor na célula superfície2. Após a bem sucedida como alvo de um anticorpo para o receptor de superfície celular, estes complexos podem induzir padrões de agregação semelhantes às observadas em ligante: anticorpo interações3. Alterações na agregação do receptor podem induzir alterações da membrana e resultado na internalização do receptor e sua remoção da superfície celular. No contexto de um conjugado anticorpo-droga, esse processo posteriormente libera a carga citotóxica em endossomos interiorizados e, posteriormente, o citoplasma, resultando na morte de célula eficaz.

Microscopia confocal forneceu um meio eficaz de visualizar estes importantes interações de anticorpos e seu alvo receptores4. Para explorar as mudanças da agregação da molécula alvo na superfície da célula, este protocolo utiliza pós-processamento de imagens de microscopia confocal, através de uma imagem espacial correlação espectroscopia (ICS) técnica 5,6,7 .

A base da espectroscopia de correlação de imagem é a observação que as flutuações de intensidade de fluorescência espacial compartilham um relacionamento para o estado de densidade e agregação das estruturas etiquetadas. Essa relação é estabelecida após o cálculo de uma função de autocorrelação espacial de uma imagem capturada5.

Todas as variantes de espectroscopia de correlação de imagem requerem o cálculo de uma imagem de autocorrelação. Isto é seguido por encaixe essa função a uma curva gaussiana bidimensional para a extração de parâmetros de estado de agregação quantitativos contidos dentro da imagem. Em termos simples, o cálculo de uma imagem de autocorrelação envolve comparando todos os pares possíveis pixel contidos em uma imagem e calcular a probabilidade que ambos igualmente tão brilhante quanto o outro. Isto é visualizado como uma função da distância e direções de pixel separação8.

O quadro teórico para a espectroscopia de correlação de imagem foi estabelecido e definido por Petersen e Wiseman et al. 5 , 6. no presente protocolo, os cálculos de autocorrelação serão executados em Fiji/ImageJ, bem como um aplicativo de planilha, a base para a função de autocorrelação espacial de flutuação de intensidade pode ser descrita como (Eq. 1):

Equation 1     

onde F representa a transformada de Fourier; F− 1 a inversa de Fourier transform; F * seu conjugado complexo; e a defasagem espacial variáveis ε e η. Em espacial ICS, conforme descrito no presente protocolo, a função de autocorrelação pode ser calculada usando um 2D fast Fourier transform algoritmo7,9. A autocorrelação no zero separação espacial, também conhecida como zero lag, g11(0,0), fornece o inverso número médio de partículas presentes por área de feixe do microscópio. Pode ser obtido por encaixe a função de autocorrelação espacial para uma função gaussiana bidimensional (Eq. 2):

Equation 3     

Como os pixels capturados dentro de uma imagem estão contidos dentro de uma área definida, e estas medidas não se estendem ao infinito, o termo g∞ é usado como um deslocamento para dar conta de longo alcance correlações espaciais contidas dentro da imagem. Para agregados de tamanho molecular, ω é a função de ponto-propagação do microscópio e descrito pela largura total no metade-máximo da função de autocorrelação espacial. A área contida dentro da função de ponto de espalhar do instrumento pode ser calibrada com o uso de grânulos fluorescentes resolução sub.

Para o protocolo espectroscopia de correlação imagem aqui descrito, a autocorrelação e funções matemáticas necessárias para completar o ICS são executadas usando a plataforma de processamento de imagem de código-fonte aberto, Fiji10, uma distribuição do ImageJ programa11,12. Fiji/ImageJ utiliza a transformação de Fourier rápida pré-instalado na função matemática de FFT. Esta função reduz o tempo de computação necessário deste cálculo, reduzindo o intervalo de dados por um fator de dois em cada dimensão13. Como a função de autocorrelação 2D é aproximadamente simétrica em x, eixo y, uma única linha perfil trama através da imagem de autocorrelação pode ser usada para medir a autocorrelação cru como uma função do GAL espacial. Qualquer ruído zero lag é removido antes da mais cálculo, com a amplitude resultante de autocorrelação (valor de pico, g(0)T) corrigido para plano de fundo com a expressão (Eq. 3):

Equation 4     

onde eub é a intensidade média de uma região de fundo, excluindo a célula. A densidade do aglomerado, ou densidade de objetos fluorescentes, é definida por (Eq. 4):

Equation 5    

O protocolo descrito neste documento, estamos mais simplesmente o cálculo da densidade do aglomerado (CD), com a suposição, baseada na observação de que uma função de autocorrelação normalizado irá decair para um valor de 1.0 com o aumento da defasagem espacial aproximando-se. Com lag espacial máxima, há já não qualquer correlação de fluorescência valores de intensidade e, portanto, sem uma correlação os cálculos nesta região são computação do valor de uma intensidade multiplicada por essa intensidade que é posteriormente dividida pela Praça de que a intensidade, que, por definição, é igual a 1.0. Assim, a densidade do aglomerado de uma função de autocorrelação normalizado pode ser calculada subtraindo 1.0 da função de autocorrelação normalizado antes de tomar sua recíproca (Eq. 5):

Equation 6     

Calibração mais da área do feixe pode ser realizada para quantificar o número de clusters contidas dentro da área da função de ponto de espalhar do instrumento. Esta calibração deve ser executada usando as mesmas condições ópticas usadas durante a análise de espectroscopia de correlação de imagens.

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Protocol

1. semeadura de linhas de células aderentes para experimento de imagem

  1. Semente 10.000 células de carcinoma epidermoide A431 por bem durante a noite (O/N) em 300 µ l de mídia de Dulbecco modificado águia médio/nutriente mistura F-12 (DMEM/F-12) contendo 10% de soro Fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina e 1% GlutaMAX em um 8 compartimentado de imagem slide apropriado para lentes de objetivas de imersão de óleo de alta resolução (por exemplo, laboratório de NuncTM-TekTM septadas lamela).
  2. Estimule a agregação de receptores nas células A431 com adição de ligante de EGF 100 ng/mL na mídia por 10 min à temperatura ambiente (RT).

2. incubação do anticorpo primário

  1. Remova a mídia e lavar as células com 300 µ l de solução salina tampão fosfato de temperatura (RT) (1X PBS) duas vezes.
  2. Consertar as células com 200 µ l de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 minutos a RT
    Nota: Para explorar as mudanças temporais de agregação do alvo, esta etapa de fixação deve ser omitida.
  3. Remover o PFA e lavar as células com 300 µ l de PBS da temperatura de quarto duas vezes.
  4. Incubar as células com 200 µ l de PBS contendo anticorpo primário em uma concentração de 10 µ g/mL pelo menos 2 h a 4 ° C.
    Nota: Para cálculos de ICS seja válida, todos os receptores presentes na superfície da célula devem ser rotulados com o anticorpo primário. Isto requer experimentos preliminares com uma série de diluição de cada anticorpo primário (01:10, 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 500 1:1, 000, etc) a ser executada. Concentração de anticorpo primário ideal é determinada através da análise da intensidade de fluorescência versus densidade do aglomerado. A concentração principal selecionada ocorre quando a densidade do aglomerado platôs com aumentando as concentrações do anticorpo primário antes de um novo aumento na densidade de cluster como resultado da ligação de anticorpo específico. O anticorpo primário pode ser diluído em meios livres de soro se realizando um experimento de tempo-curso de imagem.
  5. Após a conclusão do tempo de incubação desejado, lavam-se células com 300 µ l de PBS RT duas vezes.
  6. Bloquear a amostra com 5% albumina de soro bovino (BSA) em PBS pelo menos 2 h a 4 ° C.
    Nota: Amostras fixas são rotineiramente bloqueadas durante a noite (O/N), a 4 ° C.

3. incubação do anticorpo secundário

  1. Prepare um estoque de µ g/mL 10 de fluorescente etiquetado anticorpo secundário (por exemplo, Alexa Fluor 488 IgG) em PBS. 2 µ g/mL de Hoechst 33342 podem ser incluídos nesta diluição para permitir a descoberta de amostra melhorada no microscópio.
    Nota: Para experimentos de lapso de tempo, PBS podem ser trocados por meios livres de soro.
  2. Remover 5% BSA/PBS a partir das células e incubar com a solução de anticorpo secundário para 2 h a 4 ° C, ao proteger as amostras de luz ambiente.
  3. Após a conclusão do tempo de incubação do anticorpo secundário, lavar as células com 300 µ l de PBS (duas vezes) e armazenar a 4 ° C, proteger da luz ambiente.
  4. Para evitar a evaporação, enrole as bordas do slide câmara com parafilme.

4. confocal microscopia de amostras

Nota: As configurações usadas para análise confocal serão diferente dependendo do equipamento e fluorophores usado na experiência individual. Instrumentos confocal modernos fornecem mecanismos para salvar todos os parâmetros de imagem utilizados no experimento no formato de arquivo de imagem nativa do instrumento. É importante que essas configurações são gravadas para fornecer para replicação apropriada das condições experimentais em diferentes períodos de aquisição de dados.

  1. Durante a imagem latente de sinais fluorescentes, evite excesso de saturação. Usar uma imagem procure tabela fornece uma representação falsa cor de saturação de pixel e reduzir o ganho de detector e poder do laser em conformidade. Mais confocal instrumentos incluem uma configuração "indicador de intervalo" ou a opção análoga do software de aquisição para este.
  2. Minimize a exposição do fluoróforo de interesse para o poder do laser. O uso de uma mancha de DNA-rotulagem como Hoechst 33342 fornece um mecanismo fácil para detectar e posicionar a amostra no campo de visão antes da coleta.
  3. Executar os exames iniciais da amostra em uma resolução baixa e se o software permite uma rápida velocidade de digitalização. Isto limitará o fotobranqueamento possível da amostra.
  4. Aumentar a resolução de captura e diminuem a velocidade de varredura quando estiver pronto para coletar dados de imagem.
  5. Se o instrumento confocal permite, colete dados usando um fóton de modo a contar.
    Nota: Se a contagem de fótons não está disponível no instrumento: Certifique-se de níveis de cinza são lineares durante a aquisição de imagens.
  6. Defina o pinhole para cada linha de laser usada para 1 unidade arejada (AU).
  7. Linha de uso ou o quadro em média durante a aquisição de imagens (x4) para reduzir o detector associado ruído.
    Nota: Nesta variante de ICS como é capturado apenas um ponto do tempo-tempo de aquisição não é experimental fator de limitação.
  8. Para selecionar de coleção de imagem uma alta ampliação, objectivo de abertura numérica elevada, tais como um objectivo de plano-Apochromat, para fornecer a máxima resolução e correção de aberrações esféricas e cromáticas (exemplos incluem plano-Apochromat 100x ou 63 X /1.40 Objectivos de óleo).
  9. Oversample o tamanho dos pixels capturados contido dentro da imagem. É recomendável cada pixel capturar uma região de nm 50 x 50. Para ICS eficaz, tamanho do pixel deve ser menos de 0,1 x 0,1 µm2 por pixel. Isto é conseguido por uma combinação de aumentar o zoom em uma área relativamente pequena de digitalização e selecionar um formato de imagem relativamente grande (por exemplo, 1024 x 1024 ou 2048 x 2048 pixels).
  10. Concentre-se na superfície apical ou basal da célula em uma região tão plana quanto possível. Várias células podem ser coletadas nas regiões de interesse processados individualmente durante a análise ICS e uma imagem.
  11. Capture uma região de fundo livre de célula usando as mesmas configurações do instrumento a ser utilizado para normalização de amostra.

5. cálculo de espectroscopia de correlação de imagem

Nota: A plataforma de processamento de imagens open-source, Fiji, uma distribuição do programa ImageJ, é necessário para executar a autocorrelação e funções matemáticas essenciais para ICS. Esta distribuição de ImageJ é recomendada, pois inclui inúmeros plugins pré-instalados e uma arquitetura de atualização mais fácil que pode executar operações em várias experiências de imagens.

  1. Instale o programa de Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Carrega os conjuntos de dados adquiridos.
  3. Identifica a região de superfície da membrana apical ou basal da célula de interesse e duplicar de tamanho de pixel de 2n (256x256, 128x128, 64x64). "Menu de: imagem > Duplicar..."
  4. Calcular a intensidade média da área recortada de interesse "Menu: analisar > medidas."
  5. Identificar uma região de fundo e duplicar para o mesmo tamanho de pixel da superfície da membrana celular de captura (2n: 256x256, 128x128, 64x64). "Menu de: imagem > Duplicar..."
  6. Calcule a intensidade média do fundo cortada a área de interesse. "Menu de: analisar > medidas."
  7. Subtrai a intensidade média do plano de fundo da imagem que contém a região de interesse. "Processo > Calculadora de imagem > subtrair."
  8. Execute cálculos de autocorrelação. Este cálculo está contido dentro da estrutura de Menu: "processo > FTT > FD matemática."
    1. Na matemática a FD de diálogo caixa selecione: imagem 1: nome da imagem recortada, operação como correlação, imagem 2: nome da imagem recortada, transformação inversa na.
  9. Normalize a imagem resultante dividindo pelo número total de pixels. "Menu de: processo > matemática > dividir..." (ou seja: 64 x 64 pixéis = 4096)
  10. Normalize novamente dividindo pela intensidade média do normalizado cortadas ao quadrado de área. "Menu de: processo > matemática > dividir..."
    Nota: Isto pode ser conseguido, dividindo a imagem pelo valor de intensidade média, duas vezes.
  11. Desenhe uma linha através da função de ponto de espalhar.
  12. Traça o perfil desta linha para calcular o valor de pico. "Menu de: analisar > traçar perfil."
  13. Calcular os clusters por área do feixe, transferindo o valor de pico (resultado de 5.12) para uma planilha e executar o seguinte cálculo (Eq 6):
    Equation 7

6. processamento de conjuntos de dados ICS em lotes

Nota: Recomenda-se a criação de uma macro de FIJI/ImageJ para replicar os procedimentos descritos no protocolo acima. Isto permite a análise rápida e consistente de vários arquivos de imagem durante a análise de espectroscopia de correlação de imagens.

  1. Estabelecer um fluxo de trabalho do ICS de macro gravando cada comando de menu no protocolo ICS
    "Menu de: Plugins > Macros > registro...".
  2. Selecione "Criar" para gerar a Macro.
  3. Selecione "Language > Macro IJ1."
  4. Salve a Macro.
  5. Adicione caixas de diálogo para várias etapas da macro, fornecendo lembretes para os operadores de cada função. Caixas de diálogo também servem como um método para pausar o processo de análise para permitir seleções apropriadas ser feita antes do tratamento subsequente (i.e., região de cultura)
    1. Código de Macro de caixa de diálogo
      title = "Título da caixa de diálogo";
      MSG = "Mensagem de passo de protocolo/caixa de diálogo";
      waitForUser (título, msg);
      Nota: Eficiências adicionais podem ser estabelecidas, assinando o site de atualização do BAR dentro o Atualizador de FIJI (instruções https://imagej.net/BAR). Isto fornece FIJI com "uma coleção de rotinas amplamente aplicáveis" 14. Um tal rotina é encontrar picos. Estrutura de menus: "BAR > análise de dados > localizar picos." Esse script fornece que um rápido meio de calcular que o valor de pico no perfil do ponto de espalhar a função.

7. protocolo extensões: Cálculo da área do feixe do microscópio

Nota: A função de transferência óptica do microscópio garante que objetos de mesmo tamanho molecular aparecem como imagens com um raio de aproximadamente 200-300 nm no plano x-y. O protocolo ICS permite a determinação da função de ponto-propagação, realizando as etapas 4 a 5 em grânulos fluorescentes resolução sub. Especificamente:

  1. Montar a resolução sub (ou seja, < 100 nm de diâmetro) grânulos fluorescentes para um 8 de câmara slide de imagens.
  2. Grânulos de imagem conforme protocolo descrito usando microscópio confocal utilizado para experiências ICS.
  3. Calcule a função do ICS da imagem resultante como por etapas protocolo 5.1-5.13.
  4. Do perfil plotado, calcule o raio de raio (r) como a largura total a metade do valor máximo da função ICS.
  5. Calcule a área do feixe (BA) como (Eq 7):Equation 8

8. protocolo extensões: Cálculo de agregados por unidade de área

  1. Calcule a densidade do aglomerado (CD) por unidade de área como (Eq 8):
    Equation 9
    Equation 10
  2. Divida os clusters por área de feixe (resultado de 5.13) pela área do feixe (resultado de 7.5).

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Representative Results

Um experimento de espectroscopia de correlação de imagem bem sucedida é dependente a correcta aplicação dos controles de tratamento. Estes grupos de tratamento incluem a análise da fluorescência em nenhum anticorpo primário e nenhum grupo de tratamento do anticorpo secundário. Uma vez que as configurações do laser confocal ideal são estabelecidas para um experimento, imagens devem ser capturadas desses grupos de controle para confirmar a ausência de fluorescência não-específica dentro da amostra. Para muitas linhas de células de câncer aderentes, a identificação das regiões apropriadas para ICS é limitada pela falta de superfícies planas. Isto é compensado pela capacidade de capturar um grande campo de visão de várias células de câncer em uma única imagem confocal. Isto fornece a capacidade de gerar a amostragem necessária para executar comparações estatísticas entre grupos de tratamento.

Neste experimento representativos, células de carcinoma epidermoide positivo A431 EGFR, foram estimulados com 100ng/mL de ligante de EGF durante 10 minutos à temperatura ambiente para induzir EGFR de clustering. Análise ICS foi executada em ambos os EGF estimulada (figura 1A) e unstimulated células (Figura 1), após incubação com o EGFR direcionamento anticorpo monoclonal humanizado, de cetuximab. Posteriormente, uma colheita de 64x64 pixels de uma região (caixa amarela) contido dentro da membrana celular (figura 1B e 1E) foi processada utilizando a função de autocorrelação foi contido na plataforma de processamento de imagem de código-fonte aberto, FIJI. Esta imagem de autocorrelação resultante foi normalizada subtraindo-se a fluorescência de fundo antes da divisão por ambos o quadrado da intensidade média da região normalizada de interesse, bem como o quadrado do número de pixels na região recortada ( Figura 1 e 1F). A ferramenta de linha de função foi usada para traçar o perfil da função de ponto-propagação desta imagem (Figura 1 e 1h). O valor de pico desses perfis foram transpostas para um aplicativo de planilha para processamento de dados ainda mais. Uma macro de FIJI foi gerada para replicar estas etapas de processamento de FIJI para processamento rápido de uma série de células (n = 6) dos dois grupos de tratamento seguindo imunocitoquímica cetuximab (Figura 1I). Neste experimento, o receptor EGFR foi identificado em 5,84 clusters ± 0,85 por área do feixe na superfície de células estimuladas versus 14.94 ± 1,62 clusters por área do feixe nas populações de células unstimulated o A431. Com a suposição de que as condições experimentais utilizadas para esta análise limite rápida do receptor volume de negócios, a densidade de cluster do EGFR em células de A431 estimuladas diminuíram 2.56-fold. Quando as condições são comparadas para o estado de agregação da mesma molécula alvo em condições quando alvo molécula turn-over é limitado, um número menor de clusters por área de feixe indica maior alvo de agregação. Seguindo a agregação de EGFR EGF ligante estimulação aumenta 2.56-fold como esperado neste sistema. A geração de uma macro de FIJI usando as etapas descritas neste protocolo permite a comparação estatística de tratamentos variados ou diferenças ambientais e seus efeitos sobre a agregação do receptor.

Figure 1
Figura 1: espectroscopia de correlação de imagem para detectar fluorescente etiquetado aglomerados na superfície celular de células cancerosas aderentes. Imagem de microscopia confocal de representante EGF estimulado (A) ou unstimulated células de carcinoma epidermoide A431 aderentes (D) rotulado com cetuximabe anticorpo primário como alvo receptor EGFR superfície de células com Alex Fluor 488 secundário anticorpo. As células estimuladas foram tratadas com 100 ng/mL EGF durante 10 minutos à temperatura ambiente para induzir EGFR cluster antes da fixação e imunocitoquímica. Regiões de recorte contendo membrana celular (caixa amarela) com dimensões de pixel (64 x 64 [2n]) foram usadas para realizar a análise ICS (B e E). Após a normalização da função de autocorrelação em FIJI/ImageJ, a ferramenta de linha (amarelo) foi usada para medir a função de ponto de espalhar (C e F) o perfil desta função de linha é plotado para detectar o valor de pico (G e H de ). Estimulação de EGF foi observada induzir uma 2.56-fold diminuição detectado clusters de EGFR por feixe área 5.84 ±0.85 comparado com 5±1.62 14.9 unstimulated células (n = 6) (I). Com o pressuposto, as condições experimentais utilizadas nesta análise mantida um constante número de receptores de membrana celular, isto representa um aumento na agregação de EGFR após estimulação EGF. Barras de escala = 10 µm (A e D); 1 µm (B-C e E-F). Caixa de trama exibida usando o estilo de Tukey com bigodes que representam valores máximos e mínimos observados não mais de 1,5 × intervalo interquartil (IQR). Agrupamentos por feixe área ± erro padrão do dizer (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A técnica de espectroscopia de correlação de imagem (ICS) que descrevemos neste protocolo usa microscópios confocal padrão sem a necessidade de detectores especializados. A técnica ICS descrita utiliza métodos de imunocitoquímica bem estabelecida para fornecer para amostragem rápida de várias condições de tratamento para a análise estatística aumentada. Esta metodologia faz isso com uma ligeira diminuição absoluta precisão em comparação com técnicas de molécula única alternativa com base na correlação das flutuações de fluorescência de moléculas móveis difusão através de um volume confocal, tais como fluorescência correlação de espectroscopia (FCS)15. A abordagem mais especializada de FCS também requer fotão de alta sensibilidade, contando detectores como fotodiodo avalanche (APD) ou detectores de GaAsP em conjunto com software especializado dedicado que não é rotineiramente disponível no padrão instrumentos confocal. Uma análise abrangente da precisão da ICS determinou que essa técnica pode medir com precisão o número de clusters onde > 1 partícula está presente dentro o ponto focal do feixe do laser scanning microscópio7.

A coleção de imagens fluorescentes adequadas é de fundamental importância para uma análise bem sucedida do ICS. A região de interesse deve conter um sinal elevado à relação de fundo fluorescente com laser e ganhar intensidades ajustadas para remover qualquer sinal de saturação. A região celular capturada deve ser oversampled com um tamanho de pixel de aproximadamente 50 nm. Esta região deve ser homogênea, com atenção cuidadosa pagou para evitar arestas celulares ou entroncamentos que podem aumentar os artefatos no cálculo autocorrelação. Uma das principais armadilhas de uma abordagem ICS é a sensibilidade para superfícies celulares heterogêneas. Assim, limitar a região capturada para a máxima superfície plana, independentemente da forma da célula irá melhorar a precisão de qualquer análise ICS.

Múltiplas modalidades de imagem tem sido exploradas para estudar a agregação dos complexos do receptor. Microscopia de elétron (EM) fornece avaliação espacial de alta resolução de proteínas agregadas, mas opera sob vácuo extremamente elevado e não é aplicável aos estudos que exigem resolução temporal. EM que é ainda mais limitado como sua preparação de amostra dura é proibitiva para viver tecido investigações5. Para superar as limitações inerentes de resolução da microscopia confocal padrão, transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) pode ser usado para calcular a organização espacial das estruturas rotulado com sobreposição de doador e aceptor fluorophores pares16 . Apesar de sua sensibilidade, traste não no entanto fornece informações sobre o tamanho dos agregados sob investigação6. O desenvolvimento de vários métodos de microscopia de fluorescência de super resolução fornecem oportunidades emocionantes para resolver celulares objetos não é possíveis com resolução padrão métodos confocal17,18. A despesa e o conhecimento necessário de tais tecnologias e instrumentos, limita sua atual disponibilidade comum.

Com o aumento da sensibilidade e baixa foto-toxicidade em instrumentação confocal, espectroscopia de correlação de imagem pode ser expandida para explorar mudanças temporais de agregação do receptor em células vivas, em experimentos de lapso de tempo. Isto pode ser justaposto com aumentando a potência do laser usada para induzir deliberadamente foto branqueamento de amostras individuais com posterior avaliação de ICS (pbICS) para arreliar distante a agregação de ordem superior presente em alguns receptores complexos9. Uma adaptação mais, espectroscopia de correlação cruzada de imagem (CIEC) fornece uma análise da localização de duas proteínas de membrana com base através da análise de pares de imagem para cada proteína fluorescente etiquetadas19co. A força desta metodologia de espectroscopia de correlação de imagem é que ele utiliza técnicas bem estabelecidas no campo e fornece um gasoduto livremente disponível de análise quantitativa os eventos altamente dinâmicos que ocorrem na membrana celular.

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Disclosures

Andrew M Scott tem pesquisa apoio financeiro de AbbVie Pharmaceutics, EMD Serono e Daiichi Sankyo Co e tem uma consultoria e posse conservada em estoque de produtos farmacêuticos de Ciências da vida. Os autores não têm outras filiações pertinentes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com um interesse financeiro em ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito para além dos divulgados.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o apoio financeiro de NHMRC (1084178 de bolsa de estudo e subsídios 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), câncer Austrália, Ludwig Cancer Research, John T Reid confia, cura cérebro Cancer Foundation, La Trobe University e a agência de câncer Victoria. Financiamento do programa de infra-estrutura de apoio operacional fornecido pelo governo de Victorian, Austrália também é reconhecida.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well ThermoFisher Scientific 155409
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red ThermoFisher Scientific 12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm ThermoFisher Scientific T7279
Cetuximab Merck Serono 3023715501
Parafilm M 38mx100mm Merck Millipore BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ProSciTech C004
Recombinant Human EGF R&D System 236-EG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem
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Parslow, A. C., Clayton, A. H. A., Lock, P., Scott, A. M. Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57164, doi:10.3791/57164 (2018).

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