Konfokal mikroskopi afslører celle overflade Receptor sammenlægning gennem billedet korrelation spektroskopi

Summary

Antistoffer, der binder til at målrette receptorer på cellens overflade kan tillægge kropsbygning og klyngedannelse ændringer. Disse dynamiske ændringer har konsekvenser for kendetegner stof udvikling i target-cellerne. Denne protokol udnytter Konfokal mikroskopi og billede korrelation spektroskopi gennem ImageJ/FIJI at opgøre omfanget af receptor klynger på cellens overflade.

Abstract

Konfokal mikroskopi giver en tilgængelig metode til at fange subcellulære interaktioner kritisk til karakterisering og videreudvikling af prækliniske agenter mærket med fluorescerende sonder. Med de seneste fremskridt i antistof baseret cytotoksiske medicin er leveringssystemer, forstå de ændringer, der er fremkaldt af disse agenter i realm af receptor sammenlægning og internalisering af afgørende betydning. Denne protokol udnytter den veletablerede metode af fluorescerende immuncytokemi og open source FIJI distribution af ImageJ, med dens indbyggede autokorrelation og billede matematiske funktioner, til at udføre fysisk billede korrelation spektroskopi (ICS). Denne protokol quantitates fluorescerende intensiteten af mærket receptorer som en funktion af området stråle af en Konfokal mikroskop. Dette giver en kvantitativ måling af target molekyle sammenlægning sundhedstilstand på cellens overflade. Denne metode er fokuseret på karakterisering af statisk celler med potentiale til at udvide til tidsmæssige undersøgelser af receptor sammenlægning. Denne protokol udgør en tilgængelig metode til at give kvantificering af klyngedannelse hændelser, som forekommer på celleoverfladen, udnytte godt etableret teknikker og ikke-specialiserede imaging apparater.

Introduction

Udviklingen af terapeutiske antistoffer har vist bemærkelsesværdige succes i behandling af flere tumor typer¹. De seneste fremskridt for antistof-drug konjugater (ADC) overflade som gennemførelsesmekanismer for cytotoksiske stoffer har udvidet krav for at forstå dynamikken i antistof: receptor interaktioner på cellen². Efter den vellykkede målretning af et antistof til celle overflade receptor, kan disse komplekser fremkalde lignende sammenlægning mønstre til dem, der observeres i ligand: antistof interaktioner³. Ændringer i receptor sammenlægning kan fremkalde ændringer i membranen og resultat i internaliseringen af receptor og dens fjernelse fra cellens overflade. Inden for rammerne af en antistof-drug konjugat udgivelser denne proces efterfølgende cytotoksiske nyttelast i internaliseret endosomes og efterfølgende cytoplasma, hvilket resulterer i effektiv celle drab.

Konfokal mikroskopi har givet et effektiv middel til at visualisere disse vigtige interaktioner af antistoffer og deres mål receptorer⁴. For at undersøge ændringer af sammenlægning af target molekyle på celleoverfladen udnytter denne protokol efterbehandling af konfokalmikroskopi billeder via en rumlig billede korrelation spektroskopi (ICS) teknik ^5,6,7 .

Grundlaget for billede korrelation spektroskopi er den observation at rumlige fluorescens intensitet udsving deler en relation til tilstanden tæthed og sammenlægning af mærket strukturer. Dette forhold er etableret efter beregning af en rumlig autokorrelation funktion af en fanget billed⁵.

Alle varianter af billede korrelation spektroskopi kræver beregning af et billede autokorrelation. Dette er efterfulgt af montering denne funktion til en todimensional Gaussisk kurve til udvinding af kvantitative sammenlægning stat parametre indeholdt i billedet. I enkle vendinger beregningen af et billede autokorrelation indebærer sammenligne alle de mulige pixel par indeholdt i et billede og beregning af sandsynligheden for at begge lige så lyse som hinanden. Dette er visualiseret som funktion af afstanden og retninger af pixel adskillelse⁸.

Den teoretiske ramme for billede korrelation spektroskopi var etableret og defineret af Petersen og Wiseman mfl. ^{5 , 6}. i denne protokol, autokorrelation beregningerne udføres i Fiji/ImageJ samt et regnearksprogram, grundlaget for intensitet udsving rumlige autokorrelation funktion kan betegnes som (Eq 1):

     

hvor F repræsenterer Fouriertransformation; F¹ inverse Fourier transform; F * dens komplekse konjugation; og den rumlige lag variabler ε og η. I rumlige ICS, som beskrevet i denne protokol, kan funktionen autokorrelation beregnes ved hjælp af en 2D fast Fourier transform algoritme^7,9. Autokorrelation på nul rumlig adskillelse ellers kendt som nul-lag, g₁₁(0,0), giver det inverse gennemsnitlige antal partikler stede pr. stråle område af mikroskopet. Det kan opnås ved at montere den rumlige autokorrelation funktion til en todimensional Gaussisk funktion (Eq 2):

     

Som pixels fanget i et billede er indeholdt i et sæt område og disse målinger ikke strækker til uendeligt, bruges udtrykket g∞ en modpostering for at tage højde for langtrækkende rumlige sammenhænge indeholdt i billedet. For Molekylær-størrelse aggregater, ω er funktionen punkt-udbredelsen af mikroskopet og beskrevet af fuld bredde på halv-maksimalt rumlige autokorrelation funktion. Det område, der er indeholdt i funktionen punkt spredt af instrumentet kan kalibreres ved hjælp af sub opløsning fluorescerende perler.

Billede korrelation spektroskopi-protokollen beskrevet heri udføres autokorrelation og matematiske funktioner, der kræves for at fuldføre ICS ved hjælp af open source imaging databehandlingssystemer platform, Fiji¹⁰, en fordeling af ImageJ program^11,12. Fiji/ImageJ udnytter den forudinstallerede hurtig Fourier transformation i funktionen FFT Math. Denne funktion reducerer den compute tid, der kræves af denne beregning ved at reducere vifte af data med en faktor på to i hver dimension¹³. Da funktionen 2D autokorrelation er ca symmetrisk i x, y-aksen, kan en enkelt linje profil plot gennem autokorrelation billede bruges til at måle den rå autokorrelation som en funktion af den rumlige lag. Nul-lag støj er fjernet inden yderligere beregning, med den deraf følgende autokorrelation amplitude (peak værdi, g(0)_T) korrigeret for baggrund med udtryk (Eq 3):

     

hvor jeg_b er den gennemsnitlige intensitet fra en baggrund region bortset fra cellen. Klynge massefylde eller densitet af fluorescerende objekter, er defineret af (Eq 4):

    

I den protokol, der er beskrevet heri, yderligere vi simpelthen beregningen af klynge tæthed (CD), med den antagelse, baseret på den iagttagelse, at et normaliseret autokorrelation funktion vil henfalde til en værdi nærmer 1,0 med stigende fysisk lag. Med maksimal fysisk lag, der er ikke længere nogen korrelation af fluorescens intensitetsværdierne og dermed uden en korrelation beregninger på denne region computing værdien af en intensitet ganget med denne intensitet, som er derefter divideret med den kvadratet på denne intensitet, som pr. definition er lig med 1,0. Klynge tæthed fra en normaliseret autokorrelation funktion kan således beregnes ved at fratrække 1.0 fra funktionen normaliseret autokorrelation før tager sin gensidige (Eq 5):

     

Yderligere kalibrering af området beam kan udføres for at kvantificere antallet af klynger indeholdt inden for apparatets punkt spredt funktion. Denne kalibrering skal udføres ved hjælp af de samme optiske betingelser anvendes under korrelations-spektroskopi billedanalyse.

Protocol

1. såning af vedhængende cellelinjer til Imaging eksperiment Seed 10.000 A431 epidermoid karcinom celler pr godt overnatning (O/N) i 300 µL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium/næringsstof blanding F-12 (DMEM/F-12) medier indeholdende 10% føtal bovint Serum, 1% Penicillin-Streptomycin og 1% GlutaMAX i en 8 chambered imaging slide egnet til høj opløsning olie fordybelse målet linser (f.eks., NuncTM Lab-TekTM chambered daekglas). Stimulere receptor aggregering på A431 celler med tils…

Representative Results

En vellykket billede korrelation spektroskopi eksperiment er afhængig af en korrekt anvendelse af behandling kontrol. Disse behandlingsgrupper omfatte en undersøgelse af fluorescens i ingen primære antistof og ingen sekundær antistof behandlingsgrupper. Når indstillingerne for optimal Konfokal laser er oprettet for et eksperiment, skal blive fanget billeder af gruppernes kontrol at bekræfte manglen på ikke-specifik fluorescens i prøven. For mange vedhængende kræft cellelinjer, e…

Discussion

Teknik af billede korrelation spektroskopi (ICS) som vi beskriver i denne protokol bruger standard Konfokal mikroskoper uden behov for specialiserede detektorer. ICS teknik beskrevet udnytter veletablerede immuncytokemi metoder til at give for hurtig prøvetagning af flere behandling betingelser for øget statistisk analyse. Denne metode gør det med en lille reduktion i absolutte præcision i forhold til alternative enkelt molekyle teknikker baseret på korrelation af fluorescens udsving af mobile molekyler spreder genn…

Materials

Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass – 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG