Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

AC confocal mikroskopi avslører cellen overflaten reseptor aggregering gjennom bildet korrelasjon spektroskopi

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57164
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,5,6,7
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Summary

Antistoffer som binder å målrette reseptorer på cellens overflate kan gi conformation og klynging endringer. Disse dynamiske endringer har implikasjoner for å karakterisere narkotika utvikling i målcellene. Denne protokollen bruker AC confocal mikroskopi og bilde korrelasjon spektroskopi gjennom ImageJ/FIJI å kvantifisere omfanget av reseptor klynger på cellens overflate.

Abstract

AC confocal mikroskopi gir en tilgjengelig metode for å fange sub mobilnettet interaksjoner kritisk for karakterisering og videreutvikling av pre-klinisk agenter merket med fluorescerende sonder. Med nylige fremskritt i antistoff basert cytotoksiske narkotika er leveringssystemer, forstå forandringer indusert av disse agentene innan reseptor aggregering og internalisering av avgjørende betydning. Denne protokollen utnytter veletablerte metodikk fluorescerende immunocytochemistry og åpen kildekode FIJI fordelingen av ImageJ, med innebygd autokorrelasjon og bilde matematiske funksjoner, utføre romlige bilde korrelasjon spektroskopi (ICS). Denne protokollen quantitates fluorescerende intensiteten av merket reseptorer som en funksjon av bjelke AC confocal mikroskop. Dette gir et kvantitativt mål av mål molekylet samling på cellens overflate. Denne metodikken er fokusert på karakterisering av statisk celler med potensial til å utvide til timelige undersøkelser av reseptor aggregering. Denne protokollen presenterer en tilgjengelig metode for å gi kvantifisering klynging hendelser på celleoverflaten, utnytte godt etablerte teknikker og ikke-spesialiserte tenkelig apparat.

Introduction

Utviklingen av terapeutiske antistoffer har vist bemerkelsesverdig suksess i behandling av flere svulst typer1. Den nylige fremskritt av antistoff-stoff conjugates (ADC) overflaten som leveringsmekanismer for cytotoksiske forbindelser har utvidet kravene for å forstå dynamikken i antistoff: reseptor interaksjoner i cellen2. Etter vellykket målretting av et antistoff til cellen overflaten reseptoren, kan disse kompleksene indusere lignende aggregering mønstre de observeres i ligand: antistoff interaksjoner3. Endringer i reseptor aggregering kan indusere endringer i membranen og resulterer i internalisering av reseptoren og fjerning fra celleoverflaten. I forbindelse med et antistoff-stoff konjugert utgivelser denne prosessen senere cytotoksiske nyttelast internalisert endosomes og senere cytoplasma, resulterer i effektivt celle drapet.

AC confocal mikroskopi har gitt en effektiv måte å visualisere disse viktige interaksjoner av antistoffer og deres mål reseptorer4. For å utforske endringene av aggregering av mål molekylet på celleoverflaten utnytter denne protokollen etterbehandling av AC confocal mikroskopi bilder via en romlig bilde korrelasjon spektroskopi (ICS) teknikk 5,6,7 .

Grunnlaget for bildet korrelasjon spektroskopi er observasjon at romlig fluorescens intensitet svingninger deler et forhold i tetthet og aggregering delstaten merket strukturer. Dette forholdet er etablert etter av en romlig autokorrelasjon bildet5.

Alle varianter av bildet korrelasjon spektroskopi krever beregning av et bilde autokorrelasjon. Dette etterfølges av passer denne funksjonen til en todimensjonal Gaussisk kurve for utvinning av kvantitative aggregering staten parametere i bildet. Enkelt sagt beregningen av et bilde autokorrelasjon innebærer sammenligne alle mulige pixel parene som finnes i et bilde og beregne sannsynligheten som begge like lyse som hverandre. Dette er visualisert som en funksjon av avstand og retning av pixel separasjon8.

Teoretisk referanseramme for bildet korrelasjon spektroskopi ble opprettet og definert av Petersen og Wiseman et al. 5 , 6. i denne protokollen, autokorrelasjon beregningene utføres i Fiji/ImageJ samt et regnearkprogram, grunnlaget for funksjonen intensitet svingninger romlige autokorrelasjon kan beskrives som (Eq 1):

Equation 1     

der F representerer Fourier transform; F−1 inverse Fourier transform; F * komplekskonjugerte; og romlig lag variabler ε og η. I romlig ICS, som beskrevet i denne protokollen, kan autokorrelasjon funksjonen beregnes ved hjelp av en 2D rask Fourier transform algoritmen7,9. Autokorrelasjon ved null romlige ellers kjent som null-lag, g11(0,0), gir omvendt gjennomsnittlig antall partikler tilstede per strålen område av mikroskopet. Den kan oppnås ved å tilpasse funksjonen romlige autokorrelasjon en todimensjonal Gaussisk funksjon (Eq 2):

Equation 3     

Pikslene fanget i et bilde er innenfor et angitt område og disse målingene forlenger ikke til uendelig, brukes begrepet g∞ som en offset til kontoen langtrekkende romlige sammenhenger i bildet. For molekylær størrelse aggregat, ω spilltilbud funksjon mikroskopet og beskrevet av fullbreddes på halv-maksimale romlige autokorrelasjon funksjonen. Området i funksjonen poenget spredningen av instrumentet kan kalibreres ved hjelp av sub oppløsning fluorescerende perler.

For bildet korrelasjon spektroskopi protokollen beskrevet her, er autokorrelasjon og matematiske funksjoner som kreves for å fullføre ICS utført ved hjelp av åpen kildekode bildebehandling behandling plattformen, Fiji10, en fordeling av ImageJ programmet11,12. Fiji/ImageJ benytter forhåndsinstallert rask Fourier transformasjon i funksjonen FFT matematikk. Denne funksjonen reduserer beregne tiden det tar for denne beregningen ved å redusere dataområdet med en faktor på to i hver dimensjon13. Funksjonen 2D autokorrelasjon er ca symmetrisk i x, y-aksen, kan en enkeltlinje profil tomt gjennom autokorrelasjon bildet brukes til å måle rå autokorrelasjon som en funksjon av romlige lag. Null-lag støy fjernes før videre beregning, med resulterende autokorrelasjon amplituden (toppverdien, g(0)T) korrigert for bakgrunn med uttrykket (Eq 3):

Equation 4     

hvor jegb er mener intensiteten fra en bakgrunn region unntatt cellen. Den klynge tetthet eller tettheten av fluorescerende objekter, defineres av (Eq 4):

Equation 5    

I protokollen beskrevet her, videre vi bare beregningen av klyngen (CD), med forutsetning basert på observasjon som en normalisert autokorrelasjon funksjon vil forfalle til verdien nærmer 1.0 med økende romlige lag. Maksimal romlige lag, det er ikke lenger noen sammenheng av fluorescens intensitetsverdiene og dermed uten en sammenheng beregninger på dette området er databehandling verdien av en intensitet multiplisert med denne intensiteten som deles deretter på kvadratet av at intensitet, som per definisjon er 1.0. Dermed kan klynge tetthet fra en normalisert autokorrelasjon funksjon beregnes ved å trekke 1.0 fra funksjonen normalisert autokorrelasjon før gjensidige (Eq 5):

Equation 6     

Ytterligere kalibrering av området strålen kan utføres for å quantitate antallet klynger i området av funksjonen poenget spredningen av instrumentet. Denne kalibreringen må utføres med samme optiske betingelsene brukes under bildet korrelasjon spektroskopi analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. såing av tilhenger linjer for Imaging eksperiment

  1. Frø 10.000 A431 epidermoid karsinom celler per godt overnatting (O/N) i 300 µL Dulbeccos endret Eagle Medium/næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F-12) medietyper som inneholder 10% fosterets Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin og 1% GlutaMAX i 8 kamret imaging Skyv egnet for høy oppløsning olje nedsenking målet linser (f.eks NuncTM Lab-TekTM kamret coverglass).
  2. Stimulere reseptor Oppsamling på A431 celler med tillegg av 100 ng/mL EGF ligand i media i 10 min ved romtemperatur (RT).

2. primære antistoff inkubasjon

  1. Fjerne media og vask celler med 300 µL romtemperatur (RT) fosfat bufret saltoppløsning (1 x PBS) to ganger.
  2. Fastsette cellene med 200 µL av 4% paraformaldehyde i PBS i 10 min på RT.
    Merk: for å utforske timelige endringene for målet aggregasjon, dette fiksering trinnet må utelates.
  3. Fjerne PFA og vask celler med 300 µL av romtemperatur PBS to ganger.
  4. Inkuber celler med 200 µL av PBS inneholder primære antistoff i en konsentrasjon av 10 µg/mL for minst 2 timer på 4 ° C.
    Merk: For ICS beregninger skal gjelde alle reseptorer tilstede på celleoverflaten må merkes med primære antistoff. Dette krever foreløpige eksperimenter med en fortynning rekke hver primære antistoff (1:10, 1:50, 1: 100, 1:200, 1:500 1:1, 000, etc.) som skal utføres. Optimal primære antistoff konsentrasjon bestemmes gjennom analyse av fluorescens versus klynge tetthet. Valgte primære konsentrasjonen oppstår når klyngen tetthet flyer med økende primære antistoff konsentrasjoner før en ytterligere økning i klyngen tetthet som følge av ikke-spesifikke antistoffer bindende. Primære antistoffer kan bli fortynnet i serum frie medier hvis utfører en tid-retters tenkelig eksperiment.
  5. Etter at ønsket inkubasjonstiden, vask celler med 300 µL av RT PBS to ganger.
  6. Blokkere prøven med 5% bovin serum albumin (BSA) i PBS minst 2 h på 4 ° C.
    Merk: Fast prøver blokkeres rutinemessig overnatting (O/N) på 4 ° C.

3. sekundære antistoff inkubasjon

  1. Forberede en 10 µg/mL lager av fluorescently merket sekundære antistoff (f.eks Alexa Fluor 488 IgG) PBS. 2 µg/mL Hoechst 33342 kan inkluderes i denne fortynning å tillate bedre prøve funnet på mikroskopet.
    Merk: For time-lapse eksperimenter, PBS kan byttes mot serum frie medier.
  2. Fjerne 5% BSA/PBS fra cellene og Inkuber med den sekundære antistoff løsningen for 2t 4 ° c, mens beskytte prøvene fra omgivelseslys.
  3. Ved ferdigstillelse av sekundær antistoff inkubasjon tid, vask cellene med 300 µL av PBS (to ganger) og lagre på 4 ° C, beskytter mot lyset.
  4. For å hindre fordampning, vikle kantene av kammeret lysbildet med parafilm.

4. AC confocal mikroskopi av prøver

Merk: Innstillingene som brukes for AC confocal analyse vil variere avhengig av utstyr og fluorophores brukes i enkelte eksperimentet. Moderne AC confocal instrumenter gir mekanismer for lagring av alle tenkelig parametere brukes i eksperimentet i det innebygde bildefilformatet av instrumentet. Det er viktig at disse innstillingene er registrert for å sørge for riktige replikering av eksperimentelle forhold over forskjellige perioder av datainnsamling.

  1. Under bildebehandling fluorescerende signaler, unngå over metning. Bruke et bilde ser opp tabellen som inneholder en falske farger visning av pixel metning og redusere detektor gevinst og laser makt tilsvarende. Mest AC confocal instrumenter inkluderer en "området indikator" innstilling eller tilsvarende alternativ i oppkjøpet programvaren for dette.
  2. Minimere avsøring av fluorophore interesse laser makt. Bruk av en DNA-merking flekk som Hoechst 33342 gir en enkel mekanisme for å oppdage og plassere prøven i synsfeltet før innsamling.
  3. Utføre den første skanner på utvalget med lav oppløsning og hvis programvaren tillater en rask skanning fart. Dette vil begrense det mulig photobleaching av prøven.
  4. Øke fange oppløsningen og langsom skannehastighet når du er klar til å samle inn bildedataene.
  5. Hvis AC confocal apparatet tillater, innsamling av data via et foton teller modus.
    Merk: Hvis Foton teller ikke er tilgjengelig på instrumentet: sikre gråtoner er lineær under bildeopptak.
  6. Angi hullet for hver laser linje til 1 luftige enhet (AU).
  7. Bruk linje eller ramme snitt under bildeopptak (x4) å redusere detektor tilknyttet støy.
    Merk: I denne varianten av ICS som eneste tidspunkt fanges anskaffet er ikke eksperimentelle begrensende faktor.
  8. For bilde samlingen Velg en høy forstørrelse, høy numeriske blenderåpning mål, for eksempel et Plan-Apochromat mål, å gi maksimal oppløsning og korrigering for sfærisk og kromatiske avvik (eksempler er Plan-Apochromat 100 X eller 63 X /1.40 Olje mål).
  9. Oversample størrelsen på fanget bildepunktene i bildet. Det anbefales hver piksel fange en 50 x 50 nm region. For effektiv ICS må pikselstørrelsen være mindre enn 0,1 x 0,1 µm2 per piksel. Dette oppnås ved en kombinasjon av zoome inn for å skanne et relativt lite område og velge et relativt stort format (f.eks 1024 x 1024 eller 2048 x 2048 piksler).
  10. Fokus på apikale eller basale overflaten av cellen i et område som flat som mulig. Cellene kan samles i ett bilde og regioner rundt behandles individuelt under ICS analyse.
  11. Fange en celle gratis bakgrunnsmateriale region med samme instrument innstillinger som skal brukes for eksempel normalisering.

5. beregning av bildet korrelasjon spektroskopi

Merk: Åpen kildekode bildebehandling behandling plattformen, Fiji, en distribusjon av programmet ImageJ er nødvendig å utføre autokorrelasjon og matematiske funksjoner avgjørende for ICS. Denne fordelingen av ImageJ anbefales som det inkluderer mange pre-installert plug-ins og en enklere oppdateringen arkitektur som kan utføre operasjoner på tvers av flere tenkelig eksperimenter.

  1. Installere programmet Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Last ervervet datasett.
  3. Identifisere regionen apikale eller basal celle overflaten membran av interesse og kopi til pikselstørrelsen 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menyen: bilde > Dupliser..."
  4. Beregne gjennomsnittlig intensiteten av omrσde rundt "menyen: analysere > mål."
  5. Identifisere en bakgrunn region og kopiere til samme pixel størrelse på overflaten cellemembranen fange (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menyen: bilde > Dupliser..."
  6. Beregne gjennomsnittlig intensiteten av bakgrunnen beskjæres interesseområde. "Menyen: analysere > mål."
  7. Trekk gjennomsnittlig intensiteten i bakgrunnen fra bildet som inneholder regionen rundt. "Prosessen > Image kalkulator > trekk."
  8. Utføre autokorrelasjon beregning. Denne beregningen finnes i menystrukturen: "prosessen > FTT > FD Math."
    1. I FD regnestykket dialogboksen boksen Velg: bilde 1: beskåret bilde navn, som korrelasjon, bilde 2: beskåret bilde navn, Inverse transformasjonen på.
  9. Normalisere den resulterende bildet ved å dele antall piksler. "Menyen: prosessen > matematikk > dele..." (dvs.: 64 x 64 bildepunkter = 4096)
  10. Normalisere igjen ved med gjennomsnittlig intensiteten av den normaliserte beskåret området kvadrat. "Menyen: prosessen > matematikk > dele..."
    Merk: Dette kan oppnås ved å dele bildet gjennomsnittlig intensitetsverdien to ganger.
  11. Tegne en linje gjennom funksjonen punktet spredt.
  12. Tegne inn profilen til å beregne toppverdien. "Menyen: analysere > Plot profil."
  13. Beregne klynger per strålen område ved å overføre toppverdien (resultat av 5,12) til et regneark og utføre følgende beregning (Eq 6):
    Equation 7

6. satsvis behandling av ICS datasett

Merk: Etablering av en FIJI/ImageJ makro anbefales å gjenskape fremgangsmåtene i over protokollen. Dette gir konsekvent og rask analyse av flere bildefiler i sammenheng spektroskopi bildeanalyser.

  1. Opprette en makro ICS arbeidsflyt ved hver kommando i ICS-protokollen
    "Menyen: Plugins > makroer > posten...".
  2. Velg "Opprett" generere makro.
  3. Velg "språk > IJ1 makro."
  4. Lagre makro.
  5. Legge til dialogbokser trinnene på makroen, gir påminnelser til operatører av hver funksjon. Dialogboksene også tjene som en metode for å stanse analyseprosessen slik at riktige valg gjøres før videre behandling (dvs. region beskjære)
    1. Dialogboksen makrokoden
      Tittel = "Dialogbokstittelen";
      MSG = "Dialog Box/protokoll trinn beskjed";
      waitForUser (tittel, msg);
      Merk: Ekstra effektivitet kan etableres ved å abonnere til BAR oppdateringsområdet FIJI Updater (instruksjoner https://imagej.net/BAR). Dette gir FIJI "en samling bredt aktuelt rutiner" 14. En slik rutine er finne topper. Menystrukturen: "BAR > analyse > Finn topper." Dette skriptet gir en rask måte å beregne toppverdien i profilen til punkt spredning funksjon.

7.-protokollutvidelser: Beregning av bjelke mikroskopet

Merk: Optisk overføringsfunksjonen av mikroskopet sikrer at selv molekylær størrelse objekter vises som bilder med en radius på ca 200-300 nm i x-y flyet. ICS protokollen tillater fastsetting av spilltilbud funksjonen ved å utføre trinn 4-5 på sub oppløsning fluorescerende perler. Spesielt:

  1. Montere sub oppløsning (dvs. < 100 nm diameter) fluorescerende perler på en 8 kammer tenkelig lysbildet.
  2. Bildet perler som beskrevet protokoll AC confocal mikroskop benyttes for ICS eksperimenter.
  3. Beregne funksjonen ICS fra det resulterende bildet som protokollen trinnene 5.1-5.13.
  4. Fra plottet profilen, beregne strålen radius (r) i full bredde ved halv maksimumsverdi for ICS-funksjonen.
  5. Beregne strålen området (BA) (Eq 7):Equation 8

8.-protokollutvidelser: Beregning av klynger Per enhet av området

  1. Beregne klynge tetthet (CD) per enhet av området som (Eq 8):
    Equation 9
    Equation 10
  2. Dele klynger per strålen område (resultat av 5.13) området strålen (resultat av 7.5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et vellykket bilde korrelasjon spektroskopi eksperiment er avhengig av en korrekt anvendelse behandling kontroller. Disse behandlingsgrupper inkludere undersøkelse av fluorescensen i ingen primære antistoff eller sekundær antistoff behandlingsgrupper. Når innstillingen optimal AC confocal laser er etablert for et eksperiment, må bilder være fanget av disse kontroll grupper å bekrefte mangelen på ikke-spesifikk fluorescens i utvalget. For mange tilhenger kreftcelle linjer, er identifikasjon av områder egnet for ICS begrenset av mangel på flate overflater. Dette er kompensert av evnen til å fange en stor synsfelt av flere kreftceller i et enkelt AC confocal bilde. Dette gir muligheten til å generere nødvendige prøvetaking for å utføre statistiske sammenligninger mellom behandlingsgrupper.

I dette representant eksperimentet, ble A431 EGFR positive epidermoid karsinom celler, stimulert med 100ng/mL EGF ligand i 10 min ved romtemperatur å indusere EGFR klynger. ICS-analyse ble gjennomført på begge EGF stimulert (figur 1A) og unstimulated (figur 1 d) celler etter inkubasjon med EGFR målretting humanized monoklonalt antistoff, cetuximab. Deretter en 64 x 64 pixel avling av en region (gul boks) i cellemembranen (figur 1B og 1E) ble behandlet bruker funksjonen autokorrelasjon var inneholdt i åpen kildekode bildebehandling plattformen, FIJI. Dette resulterende autokorrelasjon bildet var normalisert ved å trekke bakgrunn fluorescens før dele både torget gjennomsnittlig intensitet normalisert regionen rundt samt kvadratet av antall piksler i regionen beskjæres ( Figur 1 c og 1F). Funksjonen linjeverktøyet ble brukt til å plotte profilen til spilltilbud funksjonen av dette bildet (figur 1G og 1 H). Toppverdien disse profilene ble forandret til et regnearkprogram for videre behandling. En FIJI makro ble generert for å replikere fremgangsmåten FIJI behandling for rask behandling av en rekke celler (n = 6) fra begge behandlingsgrupper etter cetuximab immunocytochemistry (figur 1I). I dette eksperimentet, ble EGFR reseptoren identifisert i 5.84 ± 0,85 klynger per strålen område på overflaten av A431 stimulert celler mot 14.94 ± 1.62 klynger per strålen område unstimulated celler bestander. Med forutsetning at eksperimentelle forhold brukt for denne analysen grense rask reseptor omsetning, EGFR klyngen tettheten i stimulert A431 celler redusert 2.56-fold. Når forholdene sammenlignes for aggregering staten samme mål molekylet i forhold når mål molekylet turn-over er begrenset, angir et lavere antall klynger per strålen område økte målet aggregering. Etter EGF ligand stimulering EGFR aggregering øker 2.56-fold som forventet i dette systemet. Generering av FIJI makroer ved hjelp av fremgangsmåten i denne protokollen gir statistisk sammenligning av ulike behandlinger eller miljømessige forskjeller og deres effekter på reseptor aggregering.

Figure 1
Figur 1: bildet korrelasjon spektroskopi å oppdage fluorescently merket klynger på celleoverflaten av tilhenger kreftceller. AC confocal mikroskopi bilde av representant EGF stimulert (A) eller unstimulated (D) tilhenger A431 epidermoid karsinom celler merket med cetuximab primære antistoff målretting celle overflaten EGFR reseptor med Alex Fluor 488 sekundære antistoff. Stimulert celler ble behandlet med 100 ng/mL EGF i 10 min ved romtemperatur å indusere EGFR klynger før fiksering og immunocytochemistry. Cellemembranen som inneholder beskjære regioner (gul boks) med bildepunktdimensjoner (64 x 64 [2n]) ble brukt til å utføre ICS analyse (B og E). Etter normalisering av funksjonen autokorrelasjon i FIJI/ImageJ, linjeverktøyet (gul) ble brukt til å måle funksjonen Poenget spredning (C og F) profilen til denne linjen funksjonen tegnes å oppdage toppverdien (G og H ). EGF stimulering ble observert å indusere en 2.56-fold nedgang i oppdaget EGFR klynger per strålen området 5.84 ±0.85 forhold til 14.9 5±1.62 unstimulated celler (n = 6) (I). Med forutsetningen, eksperimentelle forhold i denne analysen opprettholdt en konstant rekke celle membran reseptorer, representerer dette en økning i EGFR aggregering etter EGF stimulering. Skala barer = 10 µm (A og D); 1 µm (ABC og E-F). Boksen plott vises med Tukey stil med værhår representerer maksimums- og observerte verdier ikke mer enn 1,5 × interquartile rekkevidde (IQR). Klynger per strålen området ± standardfeil av mener (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Teknikken av bildet korrelasjon spektroskopi (ICS) som vi beskriver i denne protokollen bruker standard AC confocal mikroskop uten behov for spesialiserte detektorer. ICS teknikken beskrevet benytter veletablerte immunocytochemistry metoder å gi for rask prøvetaking av flere behandling for økt statistisk analyse. Denne metoden gjør det med en liten reduksjon i nøyaktig presisjon i forhold til alternative ett molekyl teknikker basert på sammenheng fluorescens svingninger av mobile molekyler spre gjennom en AC confocal volumet, for eksempel fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS)15. Mer spesialiserte FCS tilnærming krever også høy følsomhet Foton teller detektorer som skred photodiode (APD) eller GaAsP detektorer sammen med dedikert spesialisert programvare som ikke rutinemessig tilgjengelig på standard AC confocal instrumenter. En omfattende analyse av presisjonen for ICS bestemmes denne teknikken kan måle antallet klynger der > 1 partikkel finnes i strålen fokus stedet av laser skanning mikroskop7.

Samlingen av aktuelle fluorescerende bilder er av avgjørende betydning for en vellykket ICS-analyse. Regionen rundt må inneholde en høy signal bakgrunn fluorescerende forhold med laser og få intensiteter justert for å fjerne alle signal metning. Regionen mobilnettet fanget må være oversamples piksel størrelse på ca 50 nm. Dette området må være homogene, med nøye payed å unngå mobilnettet kanter eller veikryss som kan øke gjenstander i autokorrelasjon beregningen. En av store fallgrubene ICS tilnærming er følsomheten heterogene mobilnettet overflater. Dermed vil begrense regionen fanget til den maksimale flat overflaten, uavhengig av cellen figuren forbedre nøyaktigheten av enhver ICS analyse.

Flere tenkelig modaliteter utforsket for å studere aggregering av reseptor komplekser. Elektronmikroskop (EM) gir høy oppløsning romlig vurdering av protein klynging men opererer under ekstremt høyt vakuum og gjelder ikke for studier som krever midlertidig løsning. EM er ytterligere begrenset tilberedningen hard prøven er uoverkommelige for levende vev undersøkelser5. For å overvinne begrensninger iboende oppløsning standard AC confocal mikroskopi, han selvmord resonans energioverføring kan (bånd) brukes til å beregne romlig organisering av strukturer merket med overlappende giver og acceptor fluorophores par16 . Til tross for sin følsomhet gir bånd men ikke informasjon om størrelsen av aggregater under etterforskning6. Utviklingen av ulike super oppløsning fluorescens mikroskopi metoder gir spennende muligheter til å løse mobilnettet objekter ikke mulig med standardoppløsning AC confocal metoder17,18. Bekostning og ekspertisen som kreves av slike teknologier og instrumenter, begrenser deres gjeldende vanlig tilgjengelighet.

Med økt følsomhet og lav Foto-toksisitet i AC confocal instrumentering, kan bildet korrelasjon spektroskopi utvides for å utforske tidsmessige endringer av reseptor-samling i levende celler time-lapse eksperimenter. Dette kan være sidestilt med laser makt til bevisst indusere Foto bleking av personlige prøver med påfølgende ICS vurdering (pbICS) å erte hverandre høyere orden aggregering i noen reseptor komplekser9. En ytterligere tilpasning, image cross-korrelasjon spektroskopi (ICC) gir en analyse av den co lokaliseringen av to membran basert proteiner gjennom analyse av bildet for hver fluorescently merket protein19. Styrken i dette bildet korrelasjon spektroskopi metodikk er at de benytter teknikker godt etablert i feltet og gir en fritt tilgjengelig analyse rørledning til kvantitative de svært dynamisk hendelsene på cellemembranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Andrew M Scott har forskningsmidler støtte fra AbbVie Pharmaceutics, EMD Serono og Daiichi Sankyo Co, og har et konsulentselskap og lager eierskap av Life Science legemidler. Forfatterne har ingen andre relevante overbevisninger eller økonomiske involvering med organisasjoner eller enhet med en økonomisk interesse i eller finansielle konflikt med emnet eller materialene som omtales i manuskriptet bortsett fra de avslørt.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter finansiering støtte fra NHMRC (fellesskap 1084178 og tilskudd 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), kreft Australia, Ludwig kreftforskning, John T Reid stoler, kur Brain Cancer Foundation, La Trobe University og Victoria kreft byrået. Finansiering fra operative infrastruktur støtteprogrammet levert av den viktorianske regjeringen, er Australia også anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well ThermoFisher Scientific 155409
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red ThermoFisher Scientific 12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm ThermoFisher Scientific T7279
Cetuximab Merck Serono 3023715501
Parafilm M 38mx100mm Merck Millipore BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ProSciTech C004
Recombinant Human EGF R&D System 236-EG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14 (2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801 (2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7 (2007).

Tags

Biologi problemet 138 AC Confocal mikroskopi bilde korrelasjon spektroskopi (ICS) antistoff: reseptor interaksjoner antistoff-narkotika-konjugert (ADC) imageJ Fiji bilde behandling klynger aggregering
AC confocal mikroskopi avslører cellen overflaten reseptor aggregering gjennom bildet korrelasjon spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A.,… More

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A., Lock, P., Scott, A. M. Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57164, doi:10.3791/57164 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter