Een methode om de effecten van milieu verrijking op de dikke darm Microbiome biodiversiteit in een muismodel van het Colon-Tumor definiëren
Summary
Milieu verrijking (EE) is een dierverblijven omgeving die wordt gebruikt voor het onthullen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verbindingen tussen de levensstijl, stress en ziekte. Dit protocol beschrijft een procedure maakt die gebruikmaakt van een muismodel van dikke darm tumorvorming en EE aan wijzigingen in microbiota biodiversiteit die mogelijk van invloed op dierlijke sterfte specifiek te definiëren.
Abstract
Verschillende recente studies hebben laten zien dat de gunstige effecten van het leven in een verrijkte omgeving op het verbeteren van ziekten bij de mens. Bij muizen, milieu verrijking (EE) tumorvorming vermindert door het activeren van het immuunsysteem van de muis, of tumor invloed dieren overleven beïnvloedt door het stimuleren van de wond reparatie reactie, met inbegrip van verbeterde microbiome diversiteit, in de communicatie van de tumor. Voorwaarde hier een gedetailleerde procedure is voor het beoordelen van de effecten van milieu verrijking op de biodiversiteit van de microbiome in een muismodel van de dikke darm-tumor. Voorzorgsmaatregelen met betrekking tot het fokken van dieren en overwegingen voor dierlijke genotype en muis integratie van de kolonie zijn beschreven, die uiteindelijk van invloed zijn op microbiële biodiversiteit. Acht te slaan op deze voorzorgsmaatregelen kan toestaan meer uniforme microbiome transmissie, en bijgevolg niet-behandeling afhankelijke effecten die studie bevindingen verwarren kunnen zal verlichten. Verder in deze procedure, worden microbiota wijzigingen gekenmerkt met behulp van 16S rDNA rangschikken van DNA geïsoleerd uit ontlasting verzameld van de distale dubbelpunt na lange termijn milieu verrijking. Gut microbiota onbalans wordt geassocieerd met de pathogenese van de ziekte en dikke darm kanker ontstoken darm, maar ook van obesitas en diabetes o.a.. Nog belangrijker is, kan dit protocol voor EE en microbiome analyse worden gebruikt om de rol van microbiome pathogenese te bestuderen in een verscheidenheid van ziekten waar de robuuste Muismodellen bestaan die ziekten bij de mens kan recapituleren.
Introduction
Milieu verrijking (EE) studies maken gebruik van complexe huisvesting parameters om sociale stimulatie (grote behuizing kooien, grotere groepen van dieren), cognitieve stimulatie (hutten, tunnels, nesten materialen, platformen) en fysieke activiteit (running wielen). EE is gebruikt door vele labs te begrijpen van de effecten van verhoogde activiteit en verbeterde sociale en cognitieve interacties op de inleiding van de ziekte en de progressie met behulp van een breed scala aan muismodellen, met inbegrip van knippen geïnduceerde alopecia, Alzheimer’s disease, Rett syndroom, en verschillende tumor en spijsverterings ziekte modellen1,2,3,4,5,6.
Verschillende Muismodellen zijn ontwikkeld om te bestuderen van de dikke darm tumorvorming bij muizen. Misschien is het meest duidelijk omschreven model de ApcMin muis. De ApcMin muis werd ontwikkeld in het laboratorium van William duif in 19907, en is gebruikt als een muismodel van mutaties in het gen van de APC die vaak gekoppeld aan menselijke colorectaal carcinoom zijn. In tegenstelling tot mensen herbergen APC mutaties, ApcMin muizen voornamelijk kleine intestinale tumoren, met zeer zelden van dikke darm tumoren te ontwikkelen. Een Tcf4Het allel met een enkele knockin-knock-out heterozygote mutatie in Tcf4, verhoogt echter enorm dikke darm tumorvorming in combinatie met de ApcMin allel8. Deze muismodel van dikke darm tumorvorming is onlangs gebruikt om te bepalen van de effecten van EE op dikke darm tumorvorming6. In de Bice et al. studie, de fysiologische en fenotypische effecten van EE op mannetjes en vrouwtjes van vier verschillende muis lijnen (wild-type (WT), Tcf4Het / + Apc+/ +, Tcf4+/ + ApcMin / +, en Tcf4 Het / + APCMin / +)) zijn gedefinieerd. Misschien was het meest interessante bevinding dat EE aanzienlijk de levensduur van zowel mannelijke als vrouwelijke dikke darm tumor-dragende dieren verhoogt. Dit aangetoond dat EE ten minste verminderen kan enkele van de symptomen dubbelpunt tumorvorming is gekoppeld, en dierlijke gezondheid te verbeteren. Opmerkelijk, deze verbeterde levensduur bij mannen is niet een direct gevolg van de verminderde tumorigenesis, en in plaats daarvan was gekoppeld aan de opening van een tumor wond genezing reactie, met inbegrip van verbeterde microbiome biodiversiteit6.
Verschillende EE specifieke studies zijn gepubliceerd met interessante resultaten. Vanuit technisch oogpunt zijn belangrijke resultaten echter vaak niet vertaalbaar naar andere laboratoria. Handhaving van identieke EE methodologieën tussen verschillende laboratoria is een ongelooflijk complexe zaak, niet alleen als gevolg van verrijking apparaten en huisvesting gebruikt, maar ook beddengoed, voedsel, ventilatie, fokken, genetica, activiteit in de kamer, en dierlijke protocol eisen, o.a.9,10,11. Een voorbeeld is de integratie van het dier, waar dieren moeten worden stabiel geïntegreerd in de kolonie van de muis, dus het normaliseren van genetische achtergrond en dieet samenstelling, ter vermijding van gerelateerde effecten van de niet-behandeling. Verder veel EE studies zijn afgerond vóór de realisatie van het belang van de microbiome in de ziekte en de manier waarop dat gemeenschappelijke muis veehouderijpraktijken kunnen invloed hebben op de samenstelling van de gut microbiome10,12.
Fok strategie en dier plaatsing in EE stress kan verhogen als niet naar behoren uitgevoerd. Sinds EE studies gebruik maken van grote aantallen van zowel mannelijke en vrouwelijke dieren en meerdere genotypen, kunnen experimentele opzet moeilijk gezien de behoefte van de dieren uit verschillende nesten worden gecombineerd. Daarom werd een fok- en spenen strategie ontwikkeld zodat voor het combineren van de juiste genotype uit verschillende nesten gespeende dieren. De primaire reden hiervoor was te normaliseren van de microbiota onder nesten en ter vermindering van stress bij de dieren werden verplaatst naar de experimentele omgeving. De microbiome werd overgebracht van de dam10. Om microbiële diversiteit naar de kolonie, werden vrouwtjes gekocht van Jackson Labs en geïntegreerd in de kolonie voor één maand voordat het experiment begon9,10,12. Als u wilt verder normaliseren microbiome biodiversiteit tussen dieren, waren vrouwen mede gehuisvest vóór fokken. Zogende pups verbeterd na fokken, gemeenschappelijke huisvesting tijdens het fokken en de mogelijkheid om te ontsnappen aan de stress niveaus van maternale zorg13,14, eventueel microbiome normalisatie te bevorderen. Om te voorkomen dat niet-EE gerelateerde effecten op de microbiome, deze gemeenschappelijke huisvesting van alle proefdieren voorkomen vechten en extra stress dat is opgetreden toen het combineren van verschillende mannen uit verschillende nesten in een experimentele kooi. Tot slot, gelijke aantallen dieren van alle genotypen werden opgenomen in de kooien. Dit bood de gelegenheid voor verbeterde microbiota biodiversiteit over genotypen, en verwijderd van de bijdrage van Coprofagie (van het dier de neiging om te consumeren kruk) of mogelijke genotype-specifiek gedrags verschillen aan de algemene studie.
Dit protocol biedt een strategie die vorige EE studies breidt tot bekende aspecten van microbiome onderzoek, met inbegrip van de integratie van de microbiota transmissie en dier de kolonie voor microbiota normalisatie, om meer uniforme microbiome populaties tussen de proefdieren. Acht te slaan op deze voorzorgsmaatregelen is van essentieel belang als gevolg van het vermogen van de niet-behandeling verwante microbiota verschillen te beschamen van de bevindingen van de studie. Elimineren van niet-EE gerelateerde microbiota wijzigingen zullen onderzoekers specifiek de rol te definiëren van EE op microbiota samenstelling tijdens de ontwikkeling van de ziekte en de progressie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze procedure kan voor de analyse van microbiota geïsoleerd uit ontlasting na milieu verrijking van normaal of tumor met dieren. Omdat dit grote experimenten waarbij fokken voor veel dieren van verschillende geslachten en genotypen, het normaliseren van de microbiome tussen de dieren vóór de aanvang van het experiment is essentieel om te voorkomen dat niet-EE gerelateerde effecten op microbiome biodiversiteit.
Voor consistentie tussen NE en EE voorwaarden geschiedt de kweek proces om ervoo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken B. Dalley in de kern van de Universiteit van Utah Genomics voor bibliotheek sequencing en K. Boucher in de kern van de Universiteit van Utah Biostatistiek voor statistisch advies en toegang tot deze technische kernen ondersteund door de National Cancer Institute award P30 CA042014. Het project beschreven werd gesteund door het nationaal kanker instituut subsidies P01 CA073992 en K01 CA128891 en de jager-Stichting tegen kanker.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
