En metod för att definiera effekterna av miljömässiga berikning på kolon mikrobiomet biologisk mångfald i en musmodell kolon tumör
Summary
Miljömässiga anrikning (EE) är en djurstallar-miljö som används för att avslöja mekanismer som ligger bakom sambanden mellan livsstil, stress och sjukdom. Det här protokollet beskriver en procedur som använder en musmodell av kolon uppkomst och EE att specifikt definiera förändringar i biologisk mångfald bakterieflora som kan påverka djurens dödlighet.
Abstract
Flera färska studier har illustrerat de positiva effekterna av att leva i en berikad miljö för att förbättra mänskliga sjukdomar. I möss, miljömässiga anrikning (EE) minskar uppkomst genom att aktivera musen immunförsvaret eller påverkar tumören uthärda djurens överlevnad genom att stimulera såret reparation svaret, inklusive förbättrad mikrobiomet mångfald, i den tumör mikromiljö. Här är ett detaljerat förfarande att bedöma effekterna av miljömässiga berikning på den biologiska mångfalden av mikrobiomet i en musmodell kolon tumör. Försiktighetsåtgärder avseende djur avel och överväganden för djurs genotyp och mus kolonin integration beskrivs, som slutligen påverkar mikrobiell biologisk mångfald. Akta dessa försiktighetsåtgärder kan tillåta mer enhetlig mikrobiomet överföring, och följaktligen kommer att lindra icke-beroende behandlingseffekter som kan förvirra studie resultaten. Vidare i den här proceduren karakteriseras bakterieflora förändringar med hjälp av 16S rDNA sekvensering av DNA isolerade från avföring samlas in från distala kolon efter långsiktiga miljömässiga anrikning. Gut bakterieflora obalans är associerade med patogenesen av upphetsande läkt sjukdom och kolon cancer, men också av fetma och diabetes bland andra. Allt kan detta protokoll för EE och mikrobiomet analys användas för att studera roll mikrobiomet patogenes över en mängd olika sjukdomar där robust musmodeller finns som kan sammanfatta mänskliga sjukdomar.
Introduction
Miljömässiga anrikning (EE) studier använda komplex bostäder parametrar för att påverka social stimulering (stora bostäder burar, större grupper av djur), kognitiv stimulering (hyddor, tunnlar, häckande material, plattformar) och fysisk aktivitet (löpande hjul). EE har utnyttjats av många labs att förstå effekterna av ökad aktivitet och förbättrade sociala och kognitiva interaktioner på sjukdom initiering och progression med en rad olika mus-modeller, inklusive barbering inducerad alopeci, Alzheimers sjukdom, Rett syndrom och flera tumör och mag sjukdom modeller1,2,3,4,5,6.
Flera musmodeller har utvecklats för att studera kolon uppkomst hos möss. Kanske är den mest väldefinierade modellen ApcMin musen. ApcMin musen utvecklades i laboratorium av William duva i 19907, och har använts som en musmodell av mutationer i APC genen som vanligen förknippas med mänskliga kolorektal cancer. I motsats till människor som härbärgerat APC mutationer, ApcMin möss primärt utveckla små intestinala tumörer, med mycket sällsynta förekomsten av kolontumörer. En Tcf4Het allel med en enda knockin-knockout heterozygot mutation i Tcf4, ökar dock kraftigt kolon tumourigenesis när den kombineras med ApcMin allel8. Nyligen, denna musmodell av kolon uppkomst har använts för att fastställa effekterna av EE på kolon tumourigenesis6. I den Bice et al. studera, fysiologiska och fenotypiska effekterna av EE på hanar och honor av fyra olika mus linjer (vildtyp (WT), Tcf4Het / + Apc+/ +, Tcf4+/ + ApcMin / +, och Tcf4 Het / + APCMin / +)) definierades. Kanske var det mest intressant fyndet att EE signifikant ökar livslängden på både manliga och kvinnliga kolon tumör-bärande djur. Detta visade att EE kan åtminstone minska några av symptomen associerade med kolon uppkomst och förbättra djurhälsan. Anmärkningsvärt, detta förbättrad livslängd hos hanar är inte ett direkt resultat av minskad uppkomst, och istället var kopplad till inledandet av en tumör sårläkning svar, inklusive förbättrad mikrobiomet biologisk mångfald6.
Flera EE särskilda studier har publicerats med intressanta resultat. Ur en teknisk synvinkel är viktiga resultat dock ofta inte översättas till andra laboratorier. Att upprätthålla identiska EE metoder mellan olika laboratorier är en otroligt komplicerad fråga, inte bara på grund av anrikning enheter och bostäder används, men också sängkläder, mat, ventilation, avel, genetik, aktivitet i rummet, och djurs protokoll krav, bland annat9,10,11. Ett exempel är animaliska integration, där djur måste vara stabilt integreras i mus kolonin, därför normalisera genetisk bakgrund och kost sammansättning, för att undvika icke-behandling relaterade effekter. Vidare, många EE studier har slutförts före förverkligandet av vikten av mikrobiomet i sjukdomen, och sättet att vanliga mus djurhållningspraxis kan påverka sammansättningen av gut mikrobiomet10,12.
Avel strategi och djur placering i EE kan öka stress om inte utförts korrekt. Eftersom EE studier utnyttja stora mängder både manliga och kvinnliga djur och flera genotyper, kan experiment vara svårt med tanke på kravet på djur från flera kullar kombineras. Därför utvecklades en avel och avvänjning strategi att för att kombinera avvanda djur av rätt genotypen från olika kullar. Den primära grunden för detta var att normalisera bakterieflora bland kullar och minska stress när djuren flyttades till experimentella miljön. Mikrobiomet överfördes från dam10. För att ge mikrobiell mångfald till kolonin, honor köptes från Jackson Labs och integrerat in i kolonin för en månad innan experimentet började9,10,12. För att ytterligare normalisera mikrobiomet biologisk mångfald mellan djur, var kvinnor samtidig inhysta före avel. Efter avel, kommunala bostäder under uppfödning och förmågan att fly förbättrad omvårdnad pups stressnivån mödravård13,14, eventuellt främja mikrobiomet normalisering. För att förhindra icke-EE relaterade effekter på microbiom, denna gemensamma bostäder av alla experimentella djur förhindras kämpar och ytterligare stress som inträffade när du kombinerar flera hanar från olika kullar i en experimentell bur. Slutligen ingick lika antal djur av alla genotyper i burarna. Detta gav möjligheten för förbättrad bakterieflora biologisk mångfald över genotyper, och bort bidrag coprophagia (djurets tendens att konsumera avföring) eller möjligt genotyp-specifik beteendemässiga skillnader till den övergripande studien.
Detta protokoll ger en strategi som expanderar tidigare EE studier att omfatta kända aspekter av mikrobiomet forskning, inklusive bakterieflora överföring och djur kolonin integration för bakterieflora normalisering, aktivera mer enhetlig mikrobiomet populationer mellan försöksdjur. Akta dessa försiktighetsåtgärder är nödvändiga på grund av icke-behandling relaterade bakterieflora skillnader förmåga att blanda ihop studie resultaten. Att eliminera icke-EE relaterade bakterieflora förändringar kommer att göra det möjligt för forskare att specifikt definiera rollen som EE på bakterieflora sammansättning under sjukdomsutvecklingen och progression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta förfarande möjliggör för analys av bakterieflora som isolerats från pall efter miljömässiga anrikning av normal eller tumör med djur. Eftersom dessa är stora experiment som inbegriper avel för att få många djur av olika kön och genotyper, normalisera mikrobiomet mellan djur före påbörjandet av experimentet är viktigt att undvika icke-EE relaterade effekter på mikrobiomet biologisk mångfald.
För konsekvens mellan NE och EE villkor genomförs avel processen för att sä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar B. Dalley i University of Utah genomik kärnan för bibliotek sekvensering och K. Boucher i University of Utah biostatistik kärna för statistisk rådgivning och tillgång till dessa tekniska kärnor stöds av National Cancer Institute award P30 CA042014. Projektet beskrivs stöddes av National Cancer Institute bidrag P01 CA073992 och K01 CA128891 och Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Teklad Diets/Harlan Labs Chow | Harlan Labs | 3980X | Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs. |
| Cell-Sorb Plus bedding | Fangman Specialties | 82010 | Autoclave prior to use. |
| AIMS Tattooing System For Neonates | AIMS | NEO-9 | https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system | Lab Products | 82120ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device | Lab Products | 82109ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth | Lab Products | 82100ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top | Lab Products | 82101ZF | Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side. |
| Tunnel | Bio-Serv | K3323 or K3332 | Connect cages together and use for enrichment |
| Grommet to connect Tunnel to cages | Fabricated by the University of Utah Machine Shop | n/a | Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable |
| Fast-track wheel | Bio-Serv | K3250 or K3251 | Use with mouse igloo and floor |
| Mouse Igloo | Bio-Serv | K3328, K3570 or K3327 | Use with Fast-track wheel and floor |
| Mouse Igloo floor | Bio-Serv | K3244 | Use with mouse Igloo and Fast-Track |
| Mouse Hut | Bio-Serv | K3272, K3102 or K3271 | |
| Crawl Ball | Bio-Serv | K3330 or K3329 | |
| Bio-hut | Bio-Serv | K3352 | Wood pulp hut used for sheltering and nesting |
| Adhesive film | VWR | 60941-072 | Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping |
| Laminar Flow Ventilated Rack | Techniplast | Bio-C36 | The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar. |
| 1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free | Any supplier | ||
| QIAamp DNA Stool MiniKit | Qiagen | 51504 | This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE |
| Waterbath (capable of heating to 95) | Any supplier | For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells. | |
| Waterbath (capable of heating to 70 degrees) | Any supplier | For 70 degree incubation of stool samples | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fluorometer: Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA broad Range Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5 | Qiagen | 19086 | |
| Experiment specific primers | Any Supplier | ||
| PCR grade water | Any supplier | ||
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | Kapa Biosystems | KK2601 | For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns). |
| Agarose for running diagnostic gels | Any supplier | ||
| TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace | Agilent | 5067-5583 | TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used. |
| Agencourt AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| Library Preparation Guide | Illumina | Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf. | |
| Unique Dual Indexing | Illumina | Illumina Experiment Manager Software | Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html |
| Nextera XT 96 Index Kit | Illumina | FC-131-1002 | Used to add barcodes to amplicons |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems/ThermoFisher | N8010560 | |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina | FC-130-1005 | |
| Adhesive clear plate seal | Applied Biosystems /ThermoFisher | 4360954 | Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film |
| Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads | Illumina | MS-102-3003 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | |
| Proteinase K (600 mAU/ml) | Qiagen | 19131 | Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit |
| Data Analysis Tools | Qiime | QIIME software Tools | Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime |
| Step 13.2. | Qiime | FastQ Join method | (http://code.google.com/p/ea-utils ). For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011). |
| Step 13.3. | Qiime | De-Novo OTU picking protocol | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html. |
| Step 13.3.1. | Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust | Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010). | |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast | Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). |
| Step 13.3.1. | Pynast | Pynast_Greengenes | DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Multiple Split Libraries | http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html. |
| 13.3.1. Note: | Qiime | Pick de novo OTUs script | http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html |
| Step 13.2.2. | Qiime | Create a mapping file | http://qiime.org/documentation/file_formats.html. |
| Step 13.2.2. | Qiime | Validate a mapping file | http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html. |
| Step 13.3.3. | Qiime | Link the OTU to sample description to mapping file | http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html. |
| Step 13.3.4. | Qiime | Summarize Taxa through plots | http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html. |
| Step 13.3.5. | Qiime | Biome Summarize table | http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME. |
References
- Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
- Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
- Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome–Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
- Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811 (2013).
- Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
- Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
- Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
- Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
- Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
- Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
- Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25 (2009).
- National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , 220 (2011).
- Silver, L. M. . Mouse genetics : concepts and applications. , (1995).
- Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
- Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, 1263-1266 (2002).
- Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743 (2012).
- 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017)
- Illumina Experiment Manager. Illumina Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017)
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
- Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
- Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849 (2014).
- Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193 (2014).
