Summary
Wir haben eine neuartige chirurgische Protokoll für die zwei-Photonen-Bildgebung live Mäuse Leber mit minimaler Invasion. Mit dieser Technik haben wir die detaillierte Struktur der Leber während Lipopolysaccharid-induzierte Endotoxämie identifiziert. Wir erwarten, dass diese Methode verwendet werden, kann um die Wirksamkeit der verschiedenen Reagenzien Behandlung zur hepatischen Leukozyte Migration zu bestimmen.
Abstract
Sepsis ist eine schwere Infektion, die Organversagen und Gewebe verursachen kann Schaden. Obwohl die Mortalität und Morbidität Preise im Zusammenhang mit Sepsis sind extrem hoch, keine direkte Behandlung oder im Zusammenhang mit der Orgel Mechanismus wurde ausführlich in Echtzeit geprüft. Die Leber ist das zentrale Organ, das Gifte und Infektionen im menschlichen Körper steuert. Hier wollten wir intravitalen Bildgebung der Maus Leber nach Induktion der Endotoxämie durchführen, um die Beweglichkeit der Immunzellen, wie Neutrophilen und Leber Kapsel Makrophagen (LCMs) verfolgen. Dementsprechend haben wir eine neuartige Operationsmethode für die Exposition der Leber mit minimal-invasiven Chirurgie entwickelt. Mäuse wurden mit Lipopolysaccharid (LPS), eine gemeinsame Endotoxin intraperitoneal injiziert. Mit unserer neuen chirurgischen Ansatz für Belichtung und intravitalen Bildgebung der Leber, wir fanden, dass die Neutrophilen Maus Rekrutierung in LPS behandelten LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde Maus Leber erhöht im Vergleich mit dem in Phosphat-gepuffert Leber mit Kochsalzlösung behandelt. Nach LPS-Behandlung stieg die Zahl der Neutrophilen deutlich mit der Zeit. Darüber hinaus visualisiert mit Hilfe von CX3Cr1-GFP-Mäusen, wir erfolgreich Leber residente Makrophagen genannt LCMs. Daher kann um die Wirksamkeit der neuen Reagenzien zur Steuerung immun Mobilität in Vivozu untersuchen, Bestimmung der Motilität und Morphologie der Neutrophilen und LCMs in der Leber wir therapeutische Wirkung im Organ Versagen und Gewebe Schäden durch identifizieren können Leukozyten-Aktivierung bei Sepsis.
Introduction
Die Leber ist der großen Stoffwechselorgan bei Säugetieren; Es fungiert als ein Kontrollturm für Energie, Hormone und Entgiftung1. Aufgrund seiner Bedeutung haben Forscher um die Veränderungen in der Leber während einer Entzündung zu erhellen viele in Vitro und in Vivo Experimente durchgeführt. Intravitalen Mikroskopie wurde verwendet, um live-Bilder aus der Leber2 zu erfassen. In der Tat führte verschiedene Leber bildgebende Verfahren wurden2,3,4,5,6. Jedoch um einen vereinfachten chirurgischen Ansatz entwickeln und Stabilisierung der das Zielorgan und die Immunzellen, gestalteten wir ein einfaches Protokoll, das Forscher um minimieren Sie ihren Aufwand für die intravitalen Bildgebung führen können.
In dieser Studie führten wir eine stabile und neuartige bildgebende Kammer und chirurgische Technik, die verwendet werden könnte, um Blutungen und mögliche Infektionen zu minimieren. Wir bestätigen, dass die Leber für mehr als 2 h intakt geblieben. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Morphologien LCMs7 und Neutrophilen unter septischen Zustand identifiziert. Da diese Methode physikalische und biologische Störfaktoren wie Zittern und unerwartete Entzündung während chirurgischen Eingriffs minimiert wird, erwarten wir, dass diese Methode verwendet werden könnte, um akute Reaktionen der immunen Zellen in der Leber als Reaktion auf zu beobachten Reagenzien wie LPS.
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Protocol
Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Yonsei University College of Medicine, Korea durchgeführt. LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP; Gfp / +) Mäuse8 und CX3Cr1-GLP (GLP / +)9 Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen für intravitalen Bildgebung verwendet wurden. Alle chirurgischen Instrumente wurden autoklaviert und mit 70 % Alkohol desinfiziert.
(1) speziell angefertigte Maus Leber Bildgebung Kammer mit Support-tools
- Maus-Leber imaging-Kammer-Konstruktion
- Machen Sie eine Kammer der folgenden Größe für Maus Leber Bildgebung (Abbildung 1): innere Kammer (120 mm Länge × 160 mm Breite × 30 mm Höhe), Außenkammer (100 mm Länge × Breite 100 mm × 24 mm Höhe), Schrauben (Ф 3 mm × 30 mm Höhe), Nüssen (Ф 4 mm) , und Flügel-geformte Muttern (Ф 4 mm).
- Messen Sie die Aushärtung Agent und Elastomer Basis im Verhältnis 1:9 um insgesamt 120 g Silikon zu machen.
- Setzen Sie die Flüssigsilikon-Mischung in einem 250 mL Erlenmeyerkolben und vermischen Sie gut. Dann den Kolben in den Exsikkator gestellt und entfernen Sie Luftblasen für ca. 1 h unter Vakuum durch die Pumpe.
- Gießen Sie flüssiges Silikon-Mischung in eine speziell angefertigte Maus Kammer so hoch wie 10 mm Höhe und lassen Sie es Heilung für ein paar Tage (Abbildung 1A).
- Vorbereitung der Cover-Folien und die Leber Befestigung Bett
- Befestigen Sie an den Metallrahmen das Deckglas mit Silikonkleber. Für 1 Tag (Abbildung 1 b) trocknen lassen.
- Um das destillierte Wasser für das Wasser-Immersion-Objektiv effektiv zu halten, ist eine semipermanente Wasser blockierende Struktur unerlässlich. 1 mm Rundung Silikonkleber zu machen und über Nacht aushärten.
- Mischen Sie die Aushärtung Agent und Elastomer Basis und dann gießen Sie sie in eine 6-Well-Platte in einer Höhe von ca. 8-10 mm. Perform Aushärtung wie in 1.1.2-1.1.4 beschrieben.
2. Vorbereitung des LPS
- Bereiten Sie steril 1 × Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die LPS-Pulver von Salmonella Enterica Serotyp Enteritidis zu verdünnen. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).
- Heizen Sie PBS im Wasserbad bei 37 ° C vor, und öffnen Sie vorsichtig die LPS Pulver Flasche (25 mg).
- Mit eine Pipettieren Hilfe, Gießen Sie sterilen PBS (5 mL) in die LPS Pulver Flasche und umrühren Sie vorsichtig oder auszusetzen Sie, die Lösung um die Stammlösung vorbereiten.
Hinweis: Nach LPS Pulver verflüssigt wird, kann harte vortexen Luftblasen verursachen. Verhindern Sie, dass Luftblasen um Verlust zu minimieren, wenn Aliquote in 1,5 mL Röhrchen. - Speichern Sie der LPS-Stammlösung bei −20 ° C und in LPS Injektionslösung ein 1 mg/mL zu verdünnen.
- Injizieren Sie 1 mg/mL-LPS-Lösung (20 mg/kg) in das Peritoneum nicht narkotisierten Maus mit einer 1-mL-Spritze. Injizieren Sie für das Tier Kontrolle die gleiche Menge an PBS.
- Warten Sie, bis 2 h für ausreichende Entzündungsreaktion.
3. Vorbereitung des Texas-rot Dextran, Blutgefäße zu beflecken
- Bereiten Sie zwei konische Rohre 15 mL und 10 mL sterile PBS.
- Texas-rot Dextran Pulver (25 mg) in 3 mL PBS verdünnen und gut vermischen. Übertragen Sie die Mischung auf eine leere 15 mL konische Rohr.
- Übertragen Sie die restlichen PBS (7 mL) auf die 15 mL konische Röhrchen mit Dextran-Mischung (3 mL).
- Verbinden Sie einen 0,45 µm-Spritze-Filter an der Spitze einer 10 mL Spritze. Die Spritze sollte die Nadel Filterwechsel.
- Filtern Sie die Dextran-Mischung (10 mL). Drücken Sie die Spritze gleichmäßig um Verschütten zu vermeiden.
- 500 µL 2,5 mg/mL Dextran-Lösung in das Licht blockiert 1,5-mL-Tube zu verzichten und bei −20 ° c lagern Einmal aufgetaut, Lagern Sie es bei 4° C.
4. chirurgische Verfahren
- Desinfizieren Sie den OP-Tisch und alle Instrumente, die mit 70 % Alkohol vor der Operation. Dann legen Sie die Werkzeuge für die Leberchirurgie und passen Sie die Heizplatte auf 37 ° C (Abb. 2A, B).
- Für die Anästhesie intraperitoneal Spritzen Sie die Mäuse mit 30 mg/kg Tiletamin/Zolazepam und 10 mg/kg Xylazin. Diese Lösungen können gemischt und verdünnt mit PBS-Puffer für die gleichzeitige Injektion. Bestätigen Sie Anesthetization durch leichtes Drücken der Zehe der Maus. Gehen Sie als nächstes, wenn es keine Reflex gibt.
- Tragen Sie kleine Menge Augensalbe, die Trockenheit der Maus der Netzhaut zu verhindern.
- Entfernen von Körperbehaarung rund um den Bauchbereich mit Enthaarungscreme (Abbildung 2).
- 200 µL Texas Red Dextran-Lösung (Konzentration von 2,5 mg/mL) über das Heck Vene oder Retro-Orbital-Injektion mit einer Insulin-Spritze (Abb. 2D) zu injizieren.
- Markieren Sie den rechts subcostal Bereich mit einem Marker. Die Linie sollte vom Xiphoid bis zum Ende der Rippe gezeichnet. Schneiden Sie die Epidermis mit Zange und Schere (Abbildung 2E, F).
- Öffnen der Bauchhöhle mit Mikro-Schere und Zange, und setzen die Leber vorsichtig. Der linke seitliche Lappen sollte mit Wattestäbchen (Abbildung 2, H) ausgerollt werden.
- Gießen Sie 500 µL steriler PBS auf die Bauchhöhle, Trockenheit der Leber zu verhindern.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in der rechts-Dekubitus-Position in eine speziell angefertigte Kammer, und wenden Sie eine kleine Menge von Gewebekleber auf dem Silizium-Bett an. Dann befestigen Sie vorsichtig die Leber mit Wattestäbchen (Abbildung 2I).
Hinweis: Da das Lebergewebe extrem brüchig ist, nicht mechanisch herausziehen der Leberzellkrebs. Rollen sie mit Wattestäbchen sanft aus. - Wenige Sekunden später, nass die Leber wieder mit 500 µL steriler PBS, Austrocknung von der Leber zu vermeiden. Den Metallrahmen auf die Leber und befestigen Sie es fest mit Nüssen (Abbildung 2J).
5. intravitalen Bildgebung der Leber mit zwei-Photonen-Mikroskopie
- Führen Sie ZEN Software (Carl Zeiss), schalten Sie den Laser, setzen die Wellenlänge 880 nm, und grün, und rot-Kanäle. Stellen Sie Laserleistung nach Fluoreszenzintensität (Abb. 3A). Emission Filterinformationen lautet wie folgt: grün/Alexa488, 500-550 nm und rot/Alexa 555, 575-610 nm.
- Die Kammer auf der bildgebenden Bühne legen Sie und 20 X eintauchen in Wasser Objektiv in der Nähe das Deckglas.
- Befestigen Sie die Silikon Kautschuk Heizung unter der Maus Körper, seine Körpertemperatur (Abb. 3 b).
- Drop 500 µL destilliertes Wasser auf den Metallrahmen, und ziehen Sie dann das Objektiv in der Nähe der Leber (Abbildung 3).
- Stellen Sie den Fokus und bestimmen Sie die Tiefe und die imaging-Bereich zu.
- Führen Sie Bildgebung.
- Injizieren Sie für die langfristige Bildgebung halbe Dosis von Tiletamin/Zolazepam und Xylazin-Gemisch pro Stunde während der Bildgebung. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur der Mäuse bei 37 ° C ist in dieser Phase wichtig. Halten Sie immer auf Auge an der Maus seit Anesthetization Zeit von jeder Maus unterscheidet.
Hinweis: Diese Methode eignet sich nicht für die Erholung nach der Operation und Bildgebung. Wir opfern ethisch die Maus unmittelbar nach der Operation. - Überprüfen Sie das Pedal Reflexe für alle 30 min für stabile Anesthetization.
(6) Datenanalyse
- Öffnen Sie die Daten-Analyse-Software Volocity und dann importieren Sie die Rohdaten in der Bibliothek in die Software.
- Entfernen Sie Rauschen aus dem Bild die Situation zu entsprechen und eine Momentaufnahme.
Hinweis: Um glatte Bilder zu erhalten, verwenden Sie den "Fine" oder "Median" Filter. Darüber hinaus verwenden Sie die "Kontrastverstärkung"-Funktion, um dunkle oder unscharfe Bilder klarer zu machen. - Passen Sie die bearbeiteten Artikel zu 100 % und Export als JPEG oder TIFF-Dateien für Schnappschüsse und AVI-Dateien für Filme.
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Representative Results
Eine einfache und sehr stabile bildgebende Kammer wurde entwickelt. Der Boden der Kammer wurde mit Silikon, die verhindert Verrutschen der Maus Körper und Organe abgedeckt. Zusätzlich, da Silizium die richtige Menge an Elastizität aufweist, könnte dies induziert durch den Druck der Abdeckung Folie (Abbildung 1A, C) zu erwartenden Schaden verhindern. Zweite, Gewebe-Safe Kleber (Vet-Anleihe) wurde angewandt, um die extrahierten Leber auf dem kreisförmigen Silikon-Bett zu fixieren. Diese Methode konnten wir zittern, verursacht durch Herzschlag oder Atemsystem Bewegung zu vermeiden. Schließlich wurde eine Metallabdeckung Folie platziert und durch Schrauben und Muttern, die anhand der Körpergröße der Mäuse und die Position der hervorstehenden Leber (Abbildung 1 b–D) behoben. Wenn Sie Anästhesie richtig durchgeführt wurde, konnte diese bildgebenden Einstellungen länger als 6 h dauern.
Vor Beginn der Operation, war die Körpertemperatur der Mäuse gesteuert, indem das Tier auf eine Heizkammer, die auf 37 ° C (Abbildung 2A) voreingestellt wurde. Als nächstes um Sekundärinfektion zu vermeiden, wurden alle notwendigen Werkzeuge für die Maus Chirurgie und Bildgebung mit 70 % Alkohol sterilisiert und/oder autoklaviert Sekundärinfektion (Abbildung 2 b) zu verhindern. Dann war Maus Körperbehaarung entfernt, insbesondere aus dem Bauchbereich mit einem Haarentfernungs-Creme (Abbildung 2). Bevor Sie sich des Schnittes, wurde die Haut mit Povidon-Jod sterilisiert. Die Durchblutung wurde mit Texas-rot Dextran über Vene Injektion (Abb. 2D) gekennzeichnet. Eine Linie, die am Xiphoid Prozeß begann und endete in der rechten Rippen wurde gezogen. Dieses Recht subcostal Schnittführung half Blutung zu minimieren. Mit einem Skalpell oder Mikro-Schere begann die Dissektion; der Bauch war nicht zuviel geöffnet, um Vertreibung des Darms aus der Bauchhöhle (Abbildung 2E, F) zu vermeiden. Fett und Gewebe Schichten wurden mit Zange und Schere Mikro-Dissektion entfernt, und der Schnitt-Bereich wurde mit sterilisierten PBS und Baumwolle Tupfer (Abbildung 2) gereinigt. Der linken seitlichen Lappen, die größte der vier Leber Lappen, war mit Wattestäbchen herausgenommen und dann an das Silizium-Bett mit einer Gewebe-Anleihe (Vet-Anleihe). Da das Lebergewebe extrem brüchig war, war die Leber ausgezogen mit Wattestäbchen (Abbildung 2 H, ich). Nach dem Auftragen Metall Abdeckung Glas, wurde die Leber Bildgebung unterzogen. Um Trockenheit zu verhindern, wurde sterilisiert PBS auf den Raum zwischen der Leber und Deckglas (Abbildung 2J) angewendet. Die Höhe der Glasabdeckung wurde mit Nüssen bei Bedarf angepasst.
Zwei-Photonen-Mikroskopie war ausgestattet mit X, Y und Z Achsen Mikrometer Controller und mit schwarzen Vorhang (Abbildung 3A) abgeschirmt. Der Laser war stabil modengekoppelten auf der Zen-Software. Stabile Bildgebung zu erwerben, sollte der Zielorgan driften verhindert werden. Daher waren die Drähte des elektronischen Heizkissens neben bildgebenden Kammer und Operationsmethode, bildgebenden Bühnenpause gesichert und gut organisierte von klebrigen Bänder (Abb. 3 b). Zu guter Letzt wurde eine ausreichende Menge von destilliertem Wasser an die Spitze der Glasabdeckung für die Wasser-Immersion-Objektiv (Abbildung 3) hinzugefügt.
Die Durchblutung wurde auf dem Bildschirm nach intravenöser Injektion von Texas Red Dextran deutlich. Um rot und grün gleichzeitig erfassen, führten wir Bildgebung mit einer Wellenlänge von 880 nm. Nach intravitalen bildgebende Analyse wurde eine entsprechende Anzahl von Neutrophilen immer das Blut in PBS Zustand im Umlauf. In der Erwägung, dass die Zahl der neutrophilen Granulozyten in LPS behandelten Mäuse wurde deutlich erhöht. Beachten Sie, dass eine Menge der Neutrophilen im Umlauf waren, in die Blutbahn aber sie nicht außerhalb des Schiffes in entzündliche Erkrankung migriert wurden. (Abbildung 4A, ergänzende Film 1). Neutrophilen in der LPS-behandelten Mäusen wurden stärker an der luminalen Oberfläche des Schiffes, eingehalten, die häufigere Erkennung der Neutrophilen im Behälter (Abbildung 4A, ergänzende Film 1) gemacht. Abgesehen von der Motilität der Neutrophilen beobachtet LCMs in CX3Cr1-GFP Mäuse auf der Oberfläche des Lebergewebes und nicht tief in das Gewebe (Abbildung 4 b). LCMs zeigte wenig Bewegung oder Aktivierung in der Leber auch in LPS-behandelten Mäusen.
Abbildung 1 . Gestaltung der Leber Kammer und Tochtergesellschaft Werkzeuge. (A) gießen die Silikon-Mischung in die speziell angefertigte Maus Kammer. (B) Dimensionen der Metallabdeckung Folie (1 Zoll = 25,4 mm, Ф = Durchmesser). (C) das Bild zeigt den Kunststoff speziell angefertigte Leber Kammer mit Silikon-Elastomer gefüllt. (D) andere Teile wurden verwendet, um die Leber Kammer zu montieren. Befestigung Schrauben und Muttern waren aus Eisen gefertigt. Pfeile angedeutet Schrauben und Muttern, (c) und (D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . OP-Schritte für die Leberchirurgie. (A) Metall und Kautschuk Heizplatten bei 37° C und DC Temperaturregler vor der Operation. (B) allgemeine Chirurgie und unterstützende Tools für die Leberchirurgie (A. Cotton Tupfer und Container, B. 70 % Alkohol, c. Papiertaschentuch, d. Rasierer, e. Haarentfernungs-Creme, F. speziell angefertigte Kammer, g. chirurgische Band, h. Hausgemachte Leber Sockel, i. Flügelmuttern und Nüssen, Metallabdeckung j. Folie, k. Mikro-Dissektion Schere, l. Zange, M. Schere, N. 3-mL-Spritze, O. Marker, p. 0,3 mL Insulin Spritze, q 1-mL-Spritze). Verfahren für die Leberchirurgie (C-J). (C) Anwendung Haarentfernungs-Creme auf dem Bauch Gelände. (D) Retro-Orbital Injektion von Mäusen mit Texas-rot Dextran. (E) Kennzeichnung der Einschnitt-Website mit einem Marker. (F) schneiden die Epidermis mit Zange und Schere. (G) machen einen Schnitt in die Bauchhöhle. (H) herausziehen der linken seitlichen Lappen vorsichtig. (I) Befestigung des Lappens an der Leber Sockel mit Tierarzt Anleihe. (J) Bild des Finales eingerichtet. Muttern wurden an die Metallabdeckung Folie fixiert und dann wurde die Deckel Folie mit Flügelmuttern fixiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Einstellungen für zwei-Photonen-Mikroskopie und imaging Bühne. (A) Ansicht der zwei-Photonen-Mikroskopie (LSM 7 MP) und die Bildbearbeitung Bühne, die in der x und y Richtungen bewegen können. (B) eine Leber Bildgebung Kammer mit einem Heizkissen hing mit Klebeband um die Maus zu decken. (C) fallen destilliertes Wasser mit einer Pipette zwischen dem Objektiv und Deckglas. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Visualisierung von Neutrophilen und Leber Kapsel Makrophagen in der Leber von Mäusen Leben. (A) Schwerpunkt Snapshot von Neutrophilen in der Leber von Mäusen LysM-GFP erweitert. Das Kontrollbild wurde von PBS-behandelten Mäusen. Das LPS-Bild wurde von LPS-behandelten Mäusen. Bilder erworben wurden, mit einem 20 X / 1,0 NA Wasser-Immersion lens (Sichtfeld [FOV] = 424.3 µm × 424.3 µm, Tiefe = 40 µm, Slice Intervall = 1 µm, Zeitintervall = 60 s, Zyklus = 31). Maßstabsleiste = 50 µm. (B) innere und Oberfläche Bereich Momentaufnahme der LCMs in der Leber von Mäusen, CX3Cr1-GFP. Bilder erworben wurden, mit einem 20 × / 1.0 NA eintauchen in Wasser Objektiv (FOV = 424.3 µm × 424.3 µm Tiefe = 40 µm (Inner) / 10 µm (), Slice Oberflächenpause = 1 µm, Zeitintervall = 60 s (Inner) / 20 s (Oberfläche), Zyklus = 31). Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Film 1. Vergleich der PBS behandelt Leber gegen LPS behandelt Leber. Klarer Unterschied in zwei verschiedenen Bedingungen gut beobachtet. In LPS behandelt Leber, die Zahl der Neutrophilen wird deutlich erhöht und die Motilität wird verringert. Die Stabilität des Films unter beiden Bedingungen eingehalten werden. Blutfluss wird mit Texas Red Dextran gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Leber wurde aktiv von vielen Gruppen3,10, aufgrund der Bedeutung ihrer Funktion untersucht. Zum Beispiel schlug Heymann Et Al. eine empfindliche Methode mit Agarose. Obwohl diese Methode erwies sich hochpräzise, dauert die Agarose-Einstellung. Jedoch konnte alle Verfahren mit unserer Methodik innerhalb von 30 min, andere Störfaktoren zu minimieren durchgeführt. Zweitens ist die Stabilisierung der Leberzellkrebs äußerst wichtig, weil der Herzschlag der Video stören kann. Um dieses Phänomen zu beseitigen, verschoben wir die Mäuse in die richtigen Dekubitus-Position.
Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll wurde Produktion von Metall Abdeckrahmen und seiner Lage an der Metallstange. Das wichtigste Hindernis, das wir konfrontiert war zu bestimmen, wie die Sprödigkeit der Leber nach Leber Fixierung mit einer entsprechenden Menge an Druck zu überwinden. Zunächst, wenn nur die Flügelmuttern halten die Abdeckung Folie angewendet wurden, die Blutzirkulation behindert wurde, und war die Leber nicht in der Lage, das Gewicht der Abdeckung Folie zu ertragen. Stattdessen entwickelte wir eine Methode, die Schrauben vor dem Einsetzen der Titeldia entlang der Leiste Rollen. Da die Abdeckung Folie durch Bolzen unterstützt wurde, es gab etwas Platz für die Leber Dicke und hiermit, in die Leber nicht hart drücken und noch gepflegt, das Gleichgewicht und die Fixierung. Mit LysM-GFP Mäuse6, haben wir bestätigt, dass dieses Design Visualisierung von neutrophilen Granulozyten in Sinusoide und zentralen Venen ermöglichen könnte. CX3Cr1-GFP Mäuse5 wurden auch in diesem Modell verwendet, um LCMs. LCMs beobachten wurden häufig auf der Oberfläche der Leber gefunden.
Die Höhe der Leber Sockel oder Silizium-Bett, war auch wichtig. Wenn es zu hoch war, würde den Blutkreislauf in die Leber gestört werden. Wenn die Höhe des Sockels Leber zu gering war, war es schwierig, stabile Fixierung der Leber aufrechtzuerhalten. Da alle Mäuse unterschiedliche Körpergrößen hatten, produzierten wir Silizium-Betten, die verschiedene Höhen mit einem 6-Well-Platte, ähnlich wie für die Zellkultur hatte. Auf diese Weise konnten wir die Kammer entsprechend der Größe der einzelnen Maus anpassen. Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir eine neuartige und einfaches Protokoll für intravitalen Bildgebung der Maus Leber zu untersuchen, die Morphologie und Motilität von Immunzellen in der Leber unter entzündlichen Erkrankungen entwickelt.
Dieses neue Protokoll könnte sehr hilfreich für Forscher auf diesem Gebiet, die akute Immunantwort der Leber beobachten möchten. Allerdings können nicht mit dieser Methode Forscher langfristige Imaging für länger als 6 h durch Leber Fixierung mit Gewebekleber betreiben. Dieses Protokoll ist eine einmalige Methode, nur und daher Mäuse sollten sofort nach dem Imaging geopfert werden. Wenn die Leber aus dem Silizium-Bett getrennt wird, wird die Leber schließlich aus dem Bett, was zu starken Blutungen abgestreift werden. Wiedereingliederung und Nähen im Bauchbereich deshalb unmöglich für zukünftige Beobachtung.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch die Regierung von Korea (MSIP, Grant Nr. 2016R1A2B4008199 Y-m. (H.), Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (gewähren Nummer: HI14C1324).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
