Två-foton Intravital avbildning av leukocyter under immunsvaret i lipopolysackarid-behandlade mus lever

Summary

Vi etablerade en roman kirurgiska protokollet för två-photon avbildning av levande möss lever med minimal invasion. Med denna teknik identifierat vi de detaljerade strukturen i levern under lipopolysackarid-inducerad endotoxemia. Vi räknar med att denna metod kan användas för att bestämma effektiviteten av olika reagenser behandling till nedsatt leukocytmigration.

Abstract

Sepsis är en typ av allvarlig infektion som kan orsaka organsvikt och vävnad skada. Även om dödlighet och sjuklighet priserna associerade med sepsis är extremt hög, inte direkt behandling eller orgel-relaterade mekanism har undersökts i detalj i realtid. Levern är det viktigaste organ som hanterar gifter och infektioner i kroppen. Häri, syftar vi till att utföra intravital avbildning av mus lever efter induktion av endotoxemia för att spåra motiliteten av immunceller, såsom neutrofiler och levern kapsulära makrofager (LCMs). Därför har vi utformat en ny kirurgisk metod för exponering av levern med minimalinvasiv kirurgi. Möss injicerades intraperitonealt med lipopolysackarid (LPS), en gemensam endotoxin. Med vår nya kirurgiska metod för exponering och intravital avbildning av mus lever, Vi hittade att neutrofiler rekrytering i LPS-behandlade LysM-grönt fluorescerande protein (GFP) var mus lever ökat jämfört med som i fosfatbuffrad saltlösning-behandlade levern. Efter LPS behandling ökade antalet neutrofiler signifikant med tiden. Dessutom visualiseras använder CX3Cr1-GFP möss, vi framgångsrikt lever bosatta makrofager kallas LCMs. Därför, för att undersöka effekten av nya reagenser styra immun rörlighet i vivo, fastställande av motilitet och morfologi av neutrofiler och LCMs i levern kan tillåta oss att identifiera terapeutisk effekt i orgel misslyckande och vävnad skador orsakade av leukocyter aktivering vid sepsis.

Introduction

Levern är den stora metaboliska orgeln i däggdjur. det fungerar som ett kontrolltorn för energi, hormoner och avgiftning¹. På grund av dess betydelse, har forskarna genomfört många in vitro- och in-vivo -experiment för att klarlägga förändringar i levern vid inflammation. Intravital mikroskopi har använts för att fånga livebilder från levern² . Faktiskt infört olika levern avbildningsmetoder har^2,3,4,5,6. Men för att utveckla en mer förenklad kirurgisk metod och uppnå en stabilisering av målorganet och immuncellerna har utformat vi ett enkelt protokoll som kan vägleda forskare för att minimera deras ansträngning för intravital avbildning.

I denna studie introducerade vi en stabil och romanen imaging kammare och kirurgisk teknik som kan användas för att minimera blödning och möjliga infektioner. Vi bekräftade att levern förblev intakt för mer än 2 h. Med den här metoden identifierat vi framgångsrikt morfologier av LCMs⁷ och neutrofiler septisk villkor. Eftersom denna metod minimerar fysiska och biologiska störfaktorer såsom darrande och oväntade inflammation under kirurgiska ingrepp, räknar vi med att denna metod skulle kunna användas att iaktta akuta reaktioner av immunceller i levern som svar på reagenser som LP-skivor.

Protocol

Alla förfaranden genomfördes i enlighet med riktlinjerna i den institutionella djur vård och användning kommittén Yonsei University College of Medicine, Korea. LysM-grönt fluorescerande protein (GFP; gfp / +) möss⁸ och CX3Cr1-GFP (gfp / +)⁹ möss vid 8-12 veckors ålder användes för intravital imaging. Alla kirurgiska verktyg var autoklaveras och desinficeras med 70% alkohol.

1. skräddarsydda mus lever imaging kammare med stödjande verktyg

1. Mus lever imaging kammare design
   1. Göra en kammare av följande storlek för mus lever imaging (figur 1): inre kammaren (120 mm längd × bredd 160 mm × 30 mm höjd), yttre kammaren (100 mm längd × bredd 100 mm × 24 mm höjd), bultar (Ф 3 mm × 30 mm höjd), nötter (Ф 4 mm) , och vingformad nötter (Ф 4 mm).
   2. Mät bota agent och elastomer bas i förhållandet 1:9 för att göra totalt 120 g av silikon.
   3. Lägg flytande silikon blandningen i en 250 mL-Erlenmeyerkolv och blanda väl. Sedan sätter kolven i en exsickator och avlägsna luftbubblor för ca 1 h under vakuum genom pumpen.
   4. Häll flytande silikon mixen i en specialdesignad mus kammare så hög som 10 mm höjd och låt det botemedel för ett par dagar (figur 1A).
2. Förberedelse av omslaget diabilder och levern fastställande säng
   1. På metallramen, bifoga täckglaset med silikon lim. Låt det torka 1 dygn (figur 1B).
   2. För att effektivt hålla det destillerat vattnet för vatten nedsänkning linsen, är en halvpermanenta vatten-blockerande struktur viktigt. Gör 1 mm avrundning silikon lim och härda det över natten.
   3. Blanda bota agent och elastomer bas och häll det i en 6-well platta på en höjd av ca 8-10 mm. utför härdning processen som beskrivs i 1.1.2-1.1.4.

2. beredning av LPS

1. Förbereda sterila 1 × fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att späda ut LPS pulvret från Salmonella enterica serotyp enteritidis. (1 × PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄).
2. Pre-Värm PBS i vattenbad vid 37 ° C, och öppna flaskan med pulver LPS (25 mg) försiktigt.
3. Använder en Pipettera stöd, häll den sterila PBS (5 mL) i LPS pulver flaskan och rör varsamt eller avbryta lösningen för att förbereda stamlösning.
   Obs: Efter LPS pulver är kondenserad, hårda vortexa kan orsaka bubblor. Undvik att göra bubblor för att minimera förlust när du gör alikvoter i 1,5 mL rör.
4. Lagra LPS stamlösning −20 ° C och späd det LPS, lösning 1 mg/mL injektionsvätska.
5. Injicera lösningen LPS 1 mg/mL (20 mg/kg) i bukhinnan av en icke-sövd mus med en 1 mL spruta. För kontroll djuret, injicera samma volym av PBS.
6. Vänta i 2 h för tillräcklig inflammatorisk reaktion.

3. beredning av Texas-röd Dextran att färga blodkärl

1. Förbered två 15 mL koniska rör och 10 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
2. Späd Texas-röd Dextran pulver (25 mg) 3 ml PBS och blanda väl. Överför blandningen till en tom 15 mL koniska röret.
3. Överföra de återstående PBS (7 mL) till 15 mL koniska röret innehållande dextran blandningen (3 mL).
4. Anslut ett 0,45 µm spruta filter till spetsen på en 10 mL-spruta. Sprutan filtret bör ersätta nålen.
5. Filtrera dextran blandningen (10 mL). Tryck på sprutan jämnt för att undvika spill.
6. Dispensera 500 µL 2,5 mg/mL dextran lösning i ljus-blockerad 1,5 mL röret och lagra den på −20 ° C. När tinas, förvara den vid 4° C.

4. kirurgiska processen

1. Desinficera tabellen kirurgi och alla instrument med 70% alkohol innan operationen. Sedan, ange verktyg för levern kirurgin och justera värmeplattan till 37 ° C (figur 2A, B).
2. För anestesi, intraperitonealt injicera möss med tiletamin/zolazepam 30 mg/kg och 10 mg/kg av xylazin. Dessa lösningar kan blandas och utspädd i PBS för samtidig injektion. Bekräfta anesthetization genom att försiktigt trycka tå av musen.  Fortsätt nästa steg när det finns ingen reflex.
3. Applicera liten mängd ögonsalva att förhindra torrhet av musens näthinnan.
4. Ta bort kroppsbehåring runt buken området använda hårborttagningskräm (figur 2 c).
5. Injicera 200 µL Texas-röd Dextran-lösning (koncentration av 2,5 mg/mL) via svans ven eller retro-orbital injektion med en insulinspruta (figur 2D).
6. Markera rätt subcostal området med en markör. Linjen ska dras från xiphoid process till slutet av revbenet. Skär epidermis med pincett och sax (figur 2E, F).
7. Öppna bukhålan med hjälp av mikro-sax och pincett, och exponera levern noga. Den vänstra laterala loben bör rullas ut med hjälp av bomullspinnar (figur 2 g, H).
8. Häll 500 µL sterilt PBS på bukhålan att förhindra torrhet i levern.
9. Placera musen i rätten-decubitus position i en specialdesignad kammare, och applicera en liten mängd vävnad lim till kisel sängen. Sedan Fäst försiktigt levern använder bomullspinnar (figur 2I).
   Obs: Eftersom levern vävnad är mycket spröda, mekaniskt dra inte ut levern. Försiktigt rulla ut med bomullspinnar.
10. Några sekunder senare, våt levern igen med 500 µL sterilt PBS att undvika uttorkning ur levern. Placera metallramen på levern och fixa det ordentligt med nötter (figur 2J).

5. intravital avbildning av levern med två-foton mikroskopi

1. Kör ZEN programvara (Carl Zeiss) att slå på lasern, ställa in våglängden till 880 nm, och Ställ in grön och röd kanaler. Justera lasereffekt enligt fluorescensintensiteten (figur 3A). Utsläpp filter information är följande: Green/Alexa488, 500-550 nm och röd/Alexa 555, 575-610 nm.
2. Placera kammaren på imaging scenen och placera 20 X nedsänkning i vatten objektiv nära skyddsglaset.
3. Fixa silikon gummi värmaren under musen kroppen att behålla sin kroppstemperatur (figur 3B).
4. Släppa 500 µL destillerat vatten på metallramen och dra sedan objektivet nära levern (figur 3 c).
5. Justera fokus och bestämma djup och tid av området imaging.
6. Genomföra imaging.
7. För långsiktiga imaging, injicera hälften en dos av Tiletamin/zolazepam och xylazin blandning varje timme under imaging. Det är viktigt att upprätthålla kroppstemperaturen hos möss vid 37 ° C under detta skede. Alltid hålla utkik till musen, eftersom anesthetization tid skiljer sig från varje mus.
   Obs: Denna metod är inte lämplig för återhämtning efter kirurgi och imaging. Vi offra etiskt musen genast efter operationen.
8. Kontrollera de pedal reflexerna för varje 30 min för stabila anesthetization.

6. dataanalys

1. Öppna data analys programvara Volocity och sedan importera raw-data i biblioteket till programvaran.
2. Ta bort brus från bilden för att passa situationen och ta en ögonblicksbild.
   Obs: För att erhålla jämna bilder, använda filtret 'Fina' eller 'Median'. Dessutom använda funktionen 'Kontrastförbättring' för att göra mörka eller suddiga bilder tydligare.
3. Passa de redigerade objekt till 100% och exportera som JPEG- eller TIFF-filer för stillbilder och AVI-filer för filmer.

Representative Results

En enkel och mycket stabil imaging kammare uppfanns. Kammarens botten täcktes med silikon, vilket förhindrade glider av mus kroppen och organ. Dessutom, eftersom kisel har rätt mängd elasticitet, kunde det förhindra beräknade skada inducerad av trycket av täcka bilden (figur 1A, C). Andra, vävnad-safe lim (veterinär bond) tillämpades för att fixa extraherade levern på cirkelformad silikon sängen. Denna metod gjorde det möjligt att undvika skakningar orsakade av hjärtslag eller respirational rörelse. Slutligen var en metall täcka bild placeras och fastställs av bultar och muttrar baserat på Förkroppsliga storleksanpassar av möss och utskjutande levern (figur 1B–D) ställning. När anestesi har utförts korrekt, kunde dessa imaging inställningar pågå längre än 6 h.

Innan du börjar kirurgi, kontrollerades kroppstemperaturen hos möss genom att placera djuret på en värme-kammare som angavs före till 37 ° C (figur 2A). Nästa, för att förhindra sekundär infektion, alla nödvändiga verktyg för mus kirurgi och imaging var steriliserad med 70% alkohol och/eller autoklaveras att förhindra sekundär infektion (figur 2B). Sedan togs musen kroppshår bort, särskilt från buken, med en hårborttagningskräm (figur 2 c). Innan snittet, var huden steriliserad med povidon jod. Blodflödet var märkt med Texas-röd Dextran via ven injektion (figur 2D). En linje som började vid den xiphoid processen och slutade vid högra revbenen drogs. Denna rätt subcostal snitt linje hjälpte minimera blödning. Med en skalpell eller mikro-sax startades dissektion; buken öppnades inte för mycket för att undvika utvisning av tarmarna från bukhålan (figur 2E, F). Fett och vävnaden lager togs bort med pincett och mikro-dissektion sax, och området snittet var rengöras med steriliserad PBS och bomull svabb (figur 2 g). Den vänstra laterala loben, den största av de fyra lever loberna, togs med bomullspinnar och sedan fäster på kisel sängen med en vävnad bond (veterinär bond). Eftersom levern vävnad var extremt spröda, flyttades levern med hjälp av bomullspinnar (figur 2 H, jag). Efter applicering metall skyddsglaset, utsattes levern för imaging. För att förhindra torrhet, tillämpades steriliserad PBS på utrymmet mellan levern och skyddsglaset (figur 2J). Höjden på täckglaset justerades med nötter när det behövs.

Två-foton mikroskopi utrustades med X, Y, och Z yxor mikrometer controller och skärmad med svart gardin (figur 3A). Lasern var stabilt läge-låst på Zen programvara. För att erhålla stabil imaging, bör drivande av målorganet förhindras. Därför, förutom imaging kammare och kirurgisk metod, ledningar av den elektroniska värmedyna var säkrade bort från imaging scenen och väl organiserad av klibbiga band (figur 3B). Slutligen lades en tillräcklig mängd destillerat vatten till toppen av skyddsglaset för vatten nedsänkning linsen (figur 3 c).

Blodflödet var tydligt på skärmen efter intravenös injektion av Texas-röd Dextran. För att fånga både rött och grönt samtidigt, vi utfört imaging med en våglängd av 880 nm. Enligt intravital bildanalys, ett lämpligt antal neutrofiler alltid cirkulerar blodet i PBS skick. Antalet neutrofiler i LPS behandlade möss var betydligt ökat. Observera att en hel del neutrofiler cirkulerade inuti blodomloppet men de inte migrera utanför fartyget i inflammatoriskt tillstånd. (Figur 4A, kompletterande Movie 1). Neutrofiler i LPS-behandlade möss var mer bestämt följs luminala ytan av fartyget, som gjort oftare upptäckt av neutrofiler i kärlet (figur 4A, kompletterande film 1). Förutom motiliteten av neutrofiler observerades LCMs i CX3Cr1-GFP möss på ytan av levervävnad i stället för djupt in i vävnaden (figur 4B). LCMs visade liten rörelse eller aktivering i levern även i LPS-behandlade möss.

Figur 1 . Design av levern kammare och dotterbolaget verktyg. (A) hälla silikon blandningen in i specialdesignade mus kammaren. (B) dimensioner av metall täcka bilden (1 tum = 25,4 mm, Ф = diameter). (C) bilden visar plast specialdesignade lever kammare fylld med silikonelastomerer. (D) andra delar användes att montera lever kammaren. Fastställande bultar och muttrar var gjorda av järn. Pilar anges bultar och muttrar, respektive i (C) och (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 . Kirurgiska åtgärder för levern kirurgi. (A) metall och gummi värme plattorna vid 37° C och DC temperatur styrenhet före operation. (B) övergripande kirurgi och stödjande verktyg för levern kirurgi (a. bomull svabb och container, b. 70% alkohol, c. papper vävnad, d. razor, e. Hårborttagningscreme, f. specialdesignade kammare, g. kirurgisk tejp, h. hemgjorda lever piedestal, i. vingmuttrar och nötter, j. metal cover bild, k. mikro-dissektion sax, l. pincett, m. sax, n. 3-mL spruta, o. markör, s. 0,3 mL insulinspruta, q. 1 mL spruta). Förfarandet för levern kirurgi (C-J). (C) tillämpa Hårborttagningscreme på webbplatsen buk. (D) retro-orbital injektion av möss med Texas-röd Dextran. (E) Markera webbplatsen snitt med en markör. (F) skära epidermis med pincett och sax. (G) göra ett snitt i bukhålan. (H) dra ut den vänstra laterala loben försiktigt. (I) fästa LOB till levern piedestal med veterinär bond. (J) bilden av den sista uppsättningen upp. Nötter fastställdes till metal cover bild och sedan täcka bilden var fast med fjäril nötter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 . Inställningar för två-foton mikroskopi och imaging scenen. (A) bild av 2-foton mikroskopi (LSM 7 MP) och imaging scenen, som kan flytta i x och y riktningar. (B) en lever imaging kammare med en gummi värmedyna fästes med tejp för att täcka musen. (C) släppa destillerat vatten med en pipett mellan objektiv och skyddsglaset. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 . Visualisering av neutrofiler och levern kapsulära makrofager i levern av levande möss. (A) utökat fokus ögonblicksbild av neutrofiler i levern av LysM-GFP möss. Kontroll bilden var från PBS-behandlade möss. LPS bilden var från LPS-behandlade möss. Bilder förvärvades med en 20 X / 1.0 NA-nedsänkning i vatten objektiv (synfältet [FOV] = 424.3 µm × 424,3 µm, djup = 40 µm, skiva intervall = 1 µm, tidsintervall = 60 s, cykel = 31). Skalstapeln = 50 µm. (B) inre och yta området ögonblicksbild av LCMs i levern av CX3Cr1-GFP möss. Bilder förvärvades med en 20 × / 1.0 NA nedsänkning i vatten objektiv (FOV = 424.3 µm × 424,3 µm, djup = 40 µm (inre) / 10 µm (yta), skiva intervall = 1 µm, tidsintervall = 60 s (inre) / 20 s (yta), cykel = 31). Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Kompletterande film 1. Jämförelse av PBS behandlas levern jämfört med LPS behandlas levern. Tydlig skillnad i två olika villkor är väl observeras. I LPS behandlas lever, antalet neutrofiler ökas betydligt och motiliteten minskas. Stabiliteten av filmen i båda villkoren iakttas. Blodflödet är märkt med Texas Red dextran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Levern har aktivt studerats av många grupper^3,10, på grund av betydelse för dess funktion. Exempelvis föreslog Heymann et al. en känslig metod med agarosgelelektrofores. Även om denna metod visade sig vara mycket exakt, tar agaros inställningen tid. Med vår metod, kunde dock alla förfaranden genomföras inom 30 min, minimera andra störfaktorer. Andra är stabiliserande levern oerhört viktigt eftersom hjärtslag kan störa videon. För att eliminera detta fenomen, omlokaliserade vi möss till rätt decubitus position.

Ett annat viktigt steg i detta protokoll var produktionen av metall täcka ramen och dess läge på metallregeln. Det viktigaste hindret vi inför var att fastställa hur man kan övervinna attrition av levern i enlighet med levern fixering med hjälp av en lämplig mängd tryck. Inledningsvis, när endast fjäril nötter tillämpades för att hålla locket bilden, blodcirkulationen försvårades och levern kunde inte uthärda vikten av täcka bilden. I stället utarbetade vi en metod för att rulla ner bultarna innan du placera locket bilden längs baren. Sedan täcka bilden stöddes av bultar, gav utrymme för levern tjocklek och härmed den, trycka inte ner hårt in i levern och ännu upprätthålls balansen och fixering. Använder LysM-GFP möss⁶, bekräftat vi att denna konstruktion möjliggör visualisering av neutrofiler i sinusoider och centrala vener. CX3Cr1-GFP möss⁵ användes även i denna modell för att observera LCMs. LCMs visade ofta på ytan av levern.

Höjden av levern piedestal eller silicon sängen, var också viktigt. Om det var för högt, skulle blodcirkulationen i levern störas. När levern piedestal höjd var för låg, var det svårt att upprätthålla stabil fixering av levern. Eftersom alla möss hade olikt förkroppsligar storleksanpassar, producerade vi kisel sängar som hade olika höjder med hjälp av en 6-well platta, liknande den som används för cellodling. På detta sätt kunde vi anpassa kammaren beroende på storleken på varje mus. Sammanfattningsvis utformade vi en roman och enkelt protokoll för intravital avbildning av mus lever att undersöka morfologi och motilitet av immunceller i levern under inflammatoriska tillstånd.

Detta nya protokoll kan vara mycket bra att forskare inom detta område som vill följa akut immunsvar i levern. Med den här metoden inte kan dock forskare genomföra långsiktiga imaging längre än 6 timmar på grund av levern fixering med vävnad lim. Detta protokoll är en engångs enda metoden och därför möss bör offras omedelbart efter imaging. När levern är fristående från silicon sängen, kommer levern så småningom vara klädde av från sängen, vilket resulterar i kraftig blödning. Återinförande och suturering av buken är därför omöjligt för framtida observation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Custom designed chamber	Live Cell Instruments		Custom-designed size
Metal cover slide	Live Cell Instruments		Custom-designed size
Cover glass	Electron Microscopy Sciences	#72204-03
Sylgard 184 Silicone elastomer kit	Dow Corning
Erlenmeyer flask	DURAN	21 216 36
Cell culture plate (Flat type)	HYUNDAI Micro Co.	H31006
Desiccator	ADARSH	55204
High Q BOND SE 5 mL	BJM LAB		To make semi-permanent dam
Flexible Silicone Rubber Heaters	Omega	SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC power supply	Toyotech	DP30-03A
Phosphate-buffered saline			Home-made
Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis	Sigma-Aldrich	L6011
Texas Red Dextran	Thermo Fisher Scientific	D1830
15 mL High-clarity polypropylene conical tube	FALCON	14-959-49B
0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter)	Sartorius	16555k
1.5ml Micro Tube, Amber	Axygen	MCT-150-X	For light-blocking
1 mL syringe	Korea Vaccine	KV-S01
3 mL syringe	Korea Vaccine	KV-S03
10 mL syringe	Korea Vaccine	KV-S10
0.3 mL insulin syringe	Becton Dickinson	324900
Hair removal cream 100 mL	Body natur
Cotton swab	ABDI
Zoletil 50 5 mL	Virbac
Rompun 10 mL	Bayer
Heating plate	Live Cell Instruments	PH-S-10	Custom-designed size
DC controller	Live Cell Instruments	CU-301
Microdessection Scissors	Harvard Apparatus	72-5418
Scissors	Roboz	RS-5882
Forceps	Roboz	RS-5137
Vet bond	3M	1469SB
ZEN software (Black Edition)	Carl Zeiss		Program for LSM 7 MP
LSM 7 MP	Carl Zeiss
Volocity	PerkinElmer		Analysis program