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Developmental Biology

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Summary

Le protocole présenté ici décrit une plate-forme pour l’identification de petites molécules pour le traitement des maladies du foie. On présente une description étape par étape détaillant comment de CISP se différencient en cellules ayant des caractéristiques d’hépatocytes en plaques à 96 puits et d’utiliser les cellules pour dépister les petites molécules ayant une activité thérapeutique potentielle.

Abstract

La capacité de différencier les cellules souches humaines pluripotentes induites (CISP) en cellules semblables à des hépatocytes (HLCs) offre de nouvelles possibilités pour l’étude des erreurs innées du métabolisme hépatique. Toutefois, afin de fournir une plate-forme qui prend en charge l’identification de petites molécules qui peut potentiellement être utilisé pour traiter les maladies du foie, cette procédure nécessite un format de culture qui est compatible avec des milliers de composés de dépistage. Nous décrivons ici un protocole utilisant des conditions de culture entièrement définie, qui permettent la différenciation reproductible de CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits vitroplants. Nous fournissons également un exemple d’utilisation de la plateforme aux composés d’écran pour leur capacité d’abaisser l’apolipoprotéine B (APOB) produite à partir des hépatocytes iPSC dérivés produits d’un patient de l’hypercholestérolémie. La disponibilité d’une plate-forme qui est compatible avec la découverte de médicaments devrait permettre aux chercheurs d’identifier de nouveaux traitements pour les maladies qui affectent le foie.

Introduction

Succès dans l’identification des médicaments qui peuvent servir à cibler une maladie rare se fonde sur le développement de tests qui peut être utilisé pour le dépistage. Hypothèse ou écrans axée sur la cible (pharmacologie inverse) sont utiles, mais nécessitent une compréhension détaillée de la base moléculaire de la maladie. Les écrans phénotypiques (pharmacologie classique) éviter la nécessité d’une compréhension détaillée des voies biochimiques, mais reposent plutôt sur l’élaboration de modèles qui reflètent avec précision la physiopathologie de la maladie. Malgré l’enthousiasme pour les approches axées sur la cible, des médicaments de première catégorie approuvés par la FDA, les analyses révèlent que phénotypiques écrans ont été beaucoup plus de succès1. L’objectif général de cette méthode est d’établir une plateforme de criblage à haute qui peut être utilisé pour identifier de petites molécules pour le traitement d’une maladie métabolique du foie. Plusieurs modèles in vitro ont été décrits, notamment des hépatocytes primaires et cellules d’hépatome de cellules progénitrices du foie2. Cependant, la plupart de ces modèles ont des limites, et on a besoin de nouveaux modèles peuvent récapituler avec précision la physiopathologie des déficiences métaboliques de foie dans la culture. Récemment, les cellules souches pluripotentes humaines combinées avec l’édition de gène ont offert une occasion de modèle même les plus rares de maladies rares en culture sans la nécessité d’accès patients directement3. Tandis que l’utilisation du CISP spécifique au patient comme un outil à la découverte de petites molécules pour le traitement des maladies hépatiques rares est raisonnable sur le plan conceptuel, il y a seulement quelques rapports démontrant la faisabilité de cette approche4. Cependant, nous avons récemment établi une plateforme dérivés iPSC hépatocytes permettant d’identifier avec succès des médicaments qui peuvent être réutilisés pour le traitement des déficiences dans le métabolisme du foie5.

Ce protocole explique le processus de différenciation CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits et en les utilisant pour cribler une banque de petites molécules. Il décrit également l’analyse de point de terminaison utilisant hypercholestérolémie comme un exemple d’une maladie métabolique du foie. Cette approche devrait être utile pour étudier le rôle et l’application de petites molécules dans le cadre d’une maladie infectieuse du foie, hépatopathie métabolique, toxicité des médicaments et autres troubles du foie.

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Protocol

1. culture de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

  1. Revêtement recombinant humain protéine de Fusion Fc E-cadhérine (E-cad-Fc) ou autres matrices appropriés pour la culture de hPSC 6
    1. Diluer le E-cad-Fc à 15 μg/mL avec Phosphate-Buffered Saline de Dulbecco contenant du calcium et du magnésium (SPD (+)).
    2. Manteau plats de vitroplants de suspension 100 mm avec 5 mL de E-cad-Fc dilué et incuber à 37 ° c pendant au moins 1 h substrat supprimer et remplacer par 5 mL de milieu (par exemple, mTeSR1 appelé M-moyen désormais)7.
      Remarque : Le milieu de culture utilisé dans le présent protocole est établi suivant les protocoles publiés7. Toutefois, plusieurs autres préparatifs des médias ont été décrits, ou sont disponibles sur le marché, qui sont probablement compatible avec la procédure.
    3. Récupérer un flacon de CISP cryoconservés d’azote liquide. Décongeler à 37 ° c jusqu'à ce qu’un cristal de glace petit reste. Pipetez doucement les cellules dans un tube conique stérile de 15 mL contenant 4 mL du milieu-M.
    4. Centrifuger à 300 g pour 5 min. Retirez le surnageant et doucement remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu additionné de 10 µM de Y-27632, un inhibiteur sélectif de la Rho-associés, coiled-coil contenant protéine kinase (ROCK).
    5. Enlever le milieu M de l’étape 1.1.2 et transvaser 5 mL des cellules de l’étape 1.1.4 aux plats de culture de tissus enduits E-cad-Fc suspension de 100 mm.
  2. Maintenir le CISP humaines en culture
    1. Une fois que le CISP se propagent dans confluence de 80 %, enlevez le milieu de culture et laver une fois avec le calcium et magnésium libre SPD (-). Aspirer le SPD (-) et ajouter une quantité suffisante de solution d’EDTA de 0,02 % à recouvrir les plaques, puis incuber pendant jusqu'à 3 min à température ambiante.
      Remarque : Au confluent de 80 %, la plaque doit contenir environ 2 x 107 cellules. Il est important de ne pas proliférer les cellules et de s’assurer que les cellules conservent une morphologie indifférenciée. La pluripotence des cellules peut être déterminée par coloration avec marqueur de cellules souches Tra-1-60 ou équivalent8.
    2. Dès que les cellules commencent à se libérer, retirer la solution d’EDTA de 0,02 % et inonder le plat avec 10 mL de la M-moyen pour libérer les cellules. Aide au détachement de CISP en pipettant également, doucement.
      Remarque : Le temps d’incubation moyen pour détacher des cellules est environ 3 min, mais cela doit être déterminée empiriquement pour chaque ligne de l’iPSC. Les cellules doivent être libérées en petites grappes contenant autour de 5-10 CISP par grappe.
    3. Transférer 1/10 des cellules suspendues par frais E-cad-Fc couché 100 mm suspension tissu boîte de Petri contenant 5 mL de la M-moyen. Incuber les cultures à 37 ° c moins de 4 % O25 % CO2 et le changement du milieu tous les jours.
      Remarque : Bien que CISP est couramment cultivées dans des conditions physiologiques d’oxygène pour promouvoir la pluripotence, CISP peut aussi être cultivé à l’aide de l’oxygène ambiant.

2. la différenciation du CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes sur plaques à 96 puits

Remarque : Cette section décrit la différenciation de la CISP dans un format qui est compatible avec le dépistage. En utilisant cette approche, il est possible d’induire la CISP humaine à différencier et à former des cellules semblables à des hépatocytes en 20 jours. Tandis que ceci convient à la plupart des essais, la durée de la culture peut être étendue pour améliorer la maturité des cellules.

  1. Revêtement des plaques de 96 puits vitroplants avec matrice de membrane basale de facteur de croissance réduite
    1. Préparer le bouillon en diluant la matrice à 2 mg/mL avec milieu de culture tissulaire DMEM/F12 stérile glacé. Diviser la matrice en 250 parties aliquotes μL et conserver à-80 ° c jusqu'à leur utilisation. Faites refroidir 10 mL de DMEM/F12 sur glace pendant 30 min. récupérer un 250 μL partie aliquote de 2 mg/mL de bouillon de matrice et dégel sur la glace.
    2. Combiner la matrice avec 10 mL de froid DMEM/F12 en mélangeant doucement avec une pipette réfrigérée avant de faire une concentration finale de 0,05 mg/mL.
    3. Transférer 100 μL de matrice dilué dans chaque puits d’une plaque 96 puits vitroplants. Incuber à 37 ° c, 4 % O25 % CO2 pendant au moins 1 h. jeter la matrice et le remplacer avec 50 μL de M-moyen / puits. Stocker à 37 ° C, 5 % 4 % O2CO2 jusqu'à ce que nécessaire.
  2. Pour la différenciation des cellules de plaque
    1. Le CISP sur plaques de 100 mm de la culture jusqu'à ce que les cellules approchent 80 % confluence. Assurez-vous que la plaque contienne environ 2 x 107 cellules. Déterminer le nombre de cellule par cellule cytomètre en flux ou hémocytomètre.
      Remarque : Avec l’expérience, la qualité des cellules CISP peut être jugée par microscopie ; Toutefois, près de 98 % des cellules devrait exprimer pluripotence marqueurs tels que l’épitope TRA-1-60, lorsqu’elle est mesurée par FACS ou immunostaining. Il est important que les cellules restent activement démarcation et ne sont pas envahis.
    2. Pour récolter le CISP de chaque plaque de 100 mm, aspirer le milieu de culture et rincer avec 5 mL de SPD (-). Remplacer le rinçage avec 3 mL de solution de détachement de cellules (par exemple, accutase) et incuber pendant environ 2 min à 37 ° C, 4 % O25 % CO2.
      Remarque : Il est important de suivre le détachement des cellules au microscope. Ne pas trop condensé avec accutase. Le but est de libérer les cellules des groupes restreints avec traitement minimal.
    3. Dès que les cellules commencent à se détacher, récolter en ajoutant 7 mL du milieu-M. Pipetter plusieurs fois à se dissocier des colonies de cellules en petites grappes d’autour de 3 à 6 cellules (Figure 1 a).
    4. Recueillir le CISP dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL et centrifuger à 300 x g pour 5 min. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL M-moyen.
    5. Répartir les cellules sur des plaques de 96 puits enduit de matrice de pipetage 50 μL de cellules en suspension dans chaque puits. Pour configurer chaque plaque à 96 puits, utilisez une plaque de 100 mm de CISP avec cellules à 80 % environ des confluence qui contient environ 5 x 106 cellules pour configurer la différenciation. Utiliser une pipette multicanaux pour accélérer ce processus. La culture des cellules durant la nuit à 37 ° c, 4 % O25 % CO2.
      Remarque : Il est important qu’un nombre égal de cellules est déposé dans chaque puits pour assurer les différenciations reproductibles.
  3. Induire la différenciation des cellules
    1. Examiner les plaques 96 puits au microscope afin de veiller à ce que les cellules couvrent au moins 70 % de la surface de chaque individu bien. Si la couverture est inférieure à 70 %, remplacer le support avec un milieu frais et incuber pendant 24 h à 37 ° c, 4 % O25 % CO2supplémentaires.
      Remarque : Incubation des cellules pendant plus de 48 h après placage sans induire la différenciation communément réduit l’efficacité de la différenciation. La différenciation se produit également de l’oxygène ambiant, bien que l’efficacité soit affecté.
    2. Pour le jour 1 à jour 2 de différenciation, remplacer le milieu de culture par RPMI additionné de 2 % B27 (sans insuline), 100 ng/mL activine A 10 ng/mL BMP4 et 20 ng/mL FGF2. Ajouter 100 μl de milieu de chaque puits et incuber à 37 ° c, l’ambiant O25 % CO2 avec une modification moyenne quotidienne pendant 2 jours.
      Remarque : Traiter avec un grand nombre de plaques à 96 puits nécessitent l’utilisation d’une pipette assistée ou le robot. pipettes de 12 canaux et 96 voies sont idéales pour les variations moyennes quotidiennes.
    3. Pour le jour 3 à 5 jours de différenciation, remplacer le milieu de culture avec RPMI additionné de 2 % B27 (sans insuline) et 100 ng/mL Activin A. Culture des cellules à 37 ° c, l’ambiant O25 % CO2 avec une variation moyenne quotidienne pendant 3 jours.
    4. Au jour de différenciation 5, avant de remplacer par le milieu de culture fraîche, traiter chaque bien avec solution de EDTA de 100 μL 0,02 % pour 30 s, puis les retirer et les remplacer avec milieu de culture fraîche.
      Remarque : Si la différenciation à l’endoderme est efficace, la monocouche de différencier les cellules est sujette à l’épluchage de la plaque. Un bref traitement avec la solution d’EDTA 0,02 % aide à soulager le détachement cellulaire. Ce traitement n’influe pas sur la différenciation d’hépatocytes.
    5. Pour différencier les jours 6 à 10, remplacer le milieu de culture avec RPMI / 2 % B27 (avec insuline) additionné de 20 ng/mL BMP4 et 10 ng/mL FGF2 et incuber à 37 ° c, 4 % O25 % CO2 pendant 5 jours avec une variation moyenne quotidienne. Cette phase induit des cellules à se différencier en cellules progénitrices hépatique.
    6. Pour différencier les jours de 11 à 15, remplacer le milieu de culture avec RPMI / 2 % B27 (avec insuline) complétés par 20 ng/mL HGF. Incuber à 37 ° c, 4 % O25 % CO2 pendant 5 jours avec une variation moyenne quotidienne.
    7. Pour différencier les jours de 16 à 20, remplacer le milieu de culture avec un milieu de culture de la cellule de l’hépatocyte (HCM) additionné de 20 ng/mL d’oncostatine M (OSM). Incuber les cellules à 37 ° c, l’ambiant O25 % CO2 avec une variation moyenne quotidienne pendant 5 jours.
      Remarque : La reproductibilité de la différenciation entre les puits individuels peut efficacement être déterminée en mesurant le niveau relatif d’albumine, AFP ou APOB sécrétée dans le milieu par ELISA (voir 3.2).

3. petite molécule dépistage

Remarque : La section suivante décrit la procédure permettant d’identifier des composés qui peuvent servir à abaisser le niveau de l’APOB dans le milieu des cellules semblables à des hépatocytes dérivée de l’hypercholestérolémie CISP. Une description du modèle et son utilisation dans l’identification des hypocholestérolémiants a été décrit en détail auparavant5,9. Dans l’exemple actuel, 1 000 composés provenant de la bibliothèque de Collection composé de Caroline du Sud (SC3) ont été examinés. Chaque composé a été testé à une concentration de 2 µg/mL.

  1. Traitement de l’iPSC - dérivées d’hépatocytes avec petites molécules
    1. Diluer la maître bibliothèque composée pour produire les plaques des stocks de travail avec des composés à une concentration de 20 μg/mL en 2 % DMSO et les conserver à-20 ° c.
    2. Préparer suffisamment plaques à 96 puits d’hépatocytes iPSC-dérivé pour permettre à chacun des composés à tester.
      Remarque : Le nombre de composés à projeté dictera le nombre de plaques de 96 puits qui sont nécessaires. En général, un seul bien doit être préparé pour chaque composé, en plus des puits pour les échantillons de contrôle. Ultrapériphériques puits de la plaque sont généralement évités afin de réduire la possibilité d’effets de bord qui peut altérer l’interprétation. Hits peuvent être identifiés en utilisant la méthode de z-score sans la nécessité d’utiliser des répétitions. Si les répétitions sont incluses, il est plus approprié d’utiliser le test t.
    3. À la fin de la différenciation (jour 20, voir 2.3.7), remplacer le milieu de culture avec 100 μL de HCM fraisadditionné de 20 ng/mL d’oncostatine M. Incuber à 37 ° c, 4 % O25 % CO2 pendant exactement 24 h. récupérer le milieu de culture dans une plaque à 96 puits fraîche et les conserver à-20 ° c. Cet exemple permet de calculer le niveau de l’APOB dans le milieu avant l’ajout de médicaments.
    4. Ajouter 90 μL de HCM frais additionné de 20 ng/mL d’oncostatine M dans chaque puits. Ajouter 10 μL de chaque composé du stock de travail après avoir mélangé de pipetage. Ajouter le DMSO à 0,2 % pour contrôler les puits pour correspondre à la concentration finale dans les échantillons traités et incuber à 37 ° c, ambiant O25 % CO2 pendant exactement 24 h. recueillir le milieu de culture et conserver à-20 ° c. Cet exemple permet de déterminer le niveau d’APOB après traitement avec des composés.
    5. Facultatif - les cellules restantes peuvent être traitées pour immunostaining, la viabilité des cellules ou des analyses de l’ARNm en utilisant des approches standards.
      Remarque : Cet écran a été conçu pour identifier les médicaments qui ont un effet rapide sur les niveaux de l’APOB. Toutefois, selon le modèle de la maladie, les dosages en aval ou mécanisme d’action des médicaments, il peut être bénéfique traiter l’échantillon pendant plusieurs jours.
  2. Déterminer les niveaux de l’APOB par ELISA
    1. Déterminer la concentration d’apolipoprotéine B (APOB) les deux échantillons de la pré- et post-drogues traitées à l’aide d’un kit de développement humain APOB ELISA suivant les protocoles du fabricant.
    2. Préparer les solutions suivantes
      1. Tampon de lavage, composé de 0,05 % Tween 20 dans du PBS, pH 7,4. Conserver à 4 ° c jusqu'à l’utilisation.
      2. Tampon d’incubation, composé de 0,05 % Tween 20 et 0,1 % sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS, pH 7,4. Conserver à 4 ° c jusqu'à l’utilisation.
    3. Préparer les anticorps de l’APOB (mAB 20/17) en diluant à 2 µg/mL dans du PBS, pH 7,4. Ajouter 100 μL de l’anticorps dilué chaque puits et incuber pendant la nuit à 4 ° c.
    4. Retirer les plaques de dosage de l’anticorps et laver chaque bien deux fois avec 200 μl de PBS, pH 7,4.
    5. Ajouter 200 μL/puits de 0,05 % Tween 20, 0,1 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS, pH 7,4 et incuber sur une plate-forme vibrante pendant 1 h à température ambiante.
    6. Préparer une courbe standard de 8 points à l’aide de 0,05 % de Tween 20 et 0,1 % de BSA dans du PBS, pH 7,4 avec les concentrations suivantes d’APOB : 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL et 50 ng/mL.
    7. Diluer les échantillons de test 1:4 avec 0,05 % Tween 20 et 0,1 % de BSA dans du PBS, pH 7,4.
    8. Après 1 h de blocage avec tampon d’incubation, jetez le tampon et laver les plaques d’essai cinq fois avec 200 μl de 0,05 % Tween 20 dans du PBS, pH 7,4.
    9. Supprimer n’importe quel tampon de lavage résiduelle complètement et transférer 90 μL des échantillons dilués et les normes de l’APOB des plaques de dosage. Incuber à température ambiante sur un agitateur pendant 1 h.
    10. Jeter l’échantillon et laver avec 200 μL 0,05 % Tween 20 dans du PBS, pH 7,4 / puits. Répétez les lavages 5 fois au total. Ajouter 100 μL par puits de mAB LDL 11-biotine dilué 1 : 1 000 0,05 % Tween 20 et 0,1 % de BSA dans du PBS, pH 7,4. Incuber à température ambiante sur une plate-forme vibrante pendant 1 h.
    11. Jeter le réactif et laver avec 200 μL / tampon de lavage bien 5 fois. Ajouter 100 μL / puits des anticorps de la Streptavidine-HRP (1:1, 000 dilution à l’aide du tampon d’incubation), puis incuber à température ambiante sur une plate-forme vibrante pendant 1 h.
    12. Jeter le réactif et laver avec 200 μL 0,05 % Tween 20 dans du PBS, pH 7,4 / puits. Répétez les lavages 5 fois au total. Complètement retirer le tampon de lavage résiduelle sur les plaques de test et ajouter 100 μL par puits de la solution de substrat de Tetramethylbenzidin (TMB) et incuber à température ambiante pendant 8 min.
    13. Sans enlever le substrat TMB, directement ajouter 100 μL par puits de la solution d’arrêt (1N HCl).
    14. Déterminer l’absorbance à 450 nm en utilisant un lecteur de plaque.
    15. Une courbe d’étalonnage peut être établie, à l’aide de la méthode de régression logistique de quatre paramètres, puis utilisé pour définir la concentration d’APOB dans chaque échantillon10.
    16. Examiner la drogue avant : post drogue rapport APOB dans chaque échantillon d’identifier des composés susceptibles de diminuer l’APOB niveaux dans le milieu.

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Representative Results

Génération des hépatocytes - aime les cellules : La figure 1 représente le calendrier des changements qui se produisent au cours de la différenciation du CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes. La culture de la CISP sur E-Cad-Fc fournit environ 2 mm des colonies de diamètre qui expriment le marqueur pluripotentes OCT4 (Figure 1 a-B). La morphologie des cellules cultivées sur une matrice de E-cadhérine seront légèrement différente de celles cultivées sur d’autres surfaces. Ils ont tendance à avoir une morphologie aplatie avec une plus grande surface cytoplasmique (Figure 1 a). Bien que les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être efficacement cultivées sur un certain nombre de différentes matrices11, la culture de la CISP sur une matrice de E-cadhérine est censée augmenter l’homogénéité de la population de cellules pluripotentes et permet sans enzymes manipulation des cellules pendant le passage de12. Toutefois, plusieurs matrices alternatives, y compris la matrice de la membrane basale, laminines, vitronectine et fibroblastes embryonnaires de souris (force expéditionnaire des marines), peuvent également servir à maintenir le CISP humain et tous doivent être compatibles avec la procédure décrite13. Dans tous les cas, la pluripotence des cellules peut être confirmée par le Tra-1-60 ou équivalent8.

Pour lancer la différenciation, le CISP doit être prélevés des groupes restreints (Figure 1 a). Au début de la différenciation, les cellules plaqués doivent couvrir environ 80 % de la surface de la plaque. Après 5 jours de traitement par facteurs de croissance, les cellules expriment des protéines qui sont typiquement exprimées dans l’endoderme définitive telles que SOX17 et FOXA2 (Figure 1 b). À ce stade, plus 90 % des cellules expriment généralement ces marqueurs. Après 5 jours plus de différenciation, l’endoderme convertit à un destin hépatique, et en plus FOXA2, les cellules expriment HNF4a, qui peuvent être identifiés dans le reste du processus de différenciation (Figure 1 b). Comme les cellules adoptent un destin hépatique, ils devraient couvrir la surface de la plaque comme une monocouche. Après addition de HGF, les cellules commencent à exprimer les protéines que l'on retrouvent dans les hépatocytes foetales, y compris AFP (Figure 1 b). On peuvent observer des gouttelettes de lipides dans le cytoplasme des cellules. À la fin de la différenciation, les cellules adoptent une morphologie cubique avec un noyau contenant des nucléoles proéminents et un cytoplasme large avec multiples gouttelettes lipidiques. Un sous-ensemble des cellules hépatocytes semblable sera multi nucléé. La plupart des cellules exprime un large répertoire de protéines d’hépatocytes dont l’albumine (Figure 1 b)14.

Écran efficace à haut débit à l’aide de l’hypercholestérolémie comme un modèle de maladie : Hypercholestérolémie reflète des concentrations excessives de la lipoprotéine-cholestérol basse densité (LDL-C) dans le sérum. Dans l’hypercholestérolémie familiale (FH), l’augmentation du niveau de sérum de C-LDL est due principalement à des mutations dans le récepteur de lipoprotéines de basse densité (LDLR) qui intervient dans l’absorption de C-LDL pour le dédouanement dans les hépatocytes. Nous avons déjà décrit la génération de CISP d’un patient ayant une hypercholestérolémie familiale homozygote et leur utilisation dans la production d’hépatocytes qui reflétait une maladie du foie du patient dans la culture9. Il a été démontré que ces cellules pourraient être utilisées avec succès comme une plate-forme pour la découverte de médicaments. Une de ~ 2 500 médicaments a été criblée, il a constaté que des glycosides cardiaques avaient une capacité inattendue à abaisser le LDL-C dans les hépatocytes dérivés iPSC, hépatocytes humains primaires et chez des souris humanisées foie. En outre, après examen dossiers médicaux de patients, nous avons trouvé ce cholestérol niveaux sont tombés chez les patients qui ont été prescrits un glycoside cardiaque pour le traitement des maladies cardiaques. Ces études ont confirmé que dérivés iPSC hépatocytes pourraient être utilisés avec succès dans les écrans pour identifier les produits thérapeutiques.

Afin de fournir une plate-forme qui est compatible avec le dépistage, il est important que les différenciations sont reproductibles et que puits à puits variation soit minimisée. La figure 2 montre les résultats d’immunomarquage sur chaque puits d’une plaque 96 puits à détecter HNF4a et albumine au 20e jour de différenciation. Comme peut être vu dans la figure, la distribution de ces protéines hépatocytaire est semblable dans tous les puits.

La composante protéique central de C-LDL est APOB. Ici, nous avons utilisé CISP à écran pour APOB abaissement composés de fournir un exemple d’utilisation des dérivés iPSC hépatocytes pour petite molécule dépistage (Figure 3 a). APOB peut être facilement mesuré en solution par ELISA. Depuis ELISA peut être réalisée sur un grand nombre d’échantillons, il peut être utilisé comme base pour un écran. L’aptitude d’un test de criblage à haut débit est mieux placée en utilisant une mesure appelée le facteur Z (ou Z')15. Ce paramètre statistique calcule l’efficacité d’un test à faire la distinction entre échantillons témoins positifs et négatifs. Un test avec un facteur Z > 0,5 est considérée comme compatible avec un écran15. Comme peut être vu dans la Figure 3 b, le Z' du test de l’APOB = 0,73, qui confirme la pertinence de l’utilisation de la plate-forme pour la découverte de médicaments.

Identification des composés qui ont la capacité d’abaisser des niveaux d’APOB dans le milieu de culture de l’iPSC - dérivé des hépatocytes: pour déterminer si la plate-forme pourrait être utilisée pour identifier de nouveaux composés qui ont une incidence les concentrations d’APOB, nous avons projeté de 1 000 petites molécules de la Collection composé de Caroline du Sud (SC3) représentant la valeur Lite (RSL). La RSL a été générée par le centre de Caroline du sud de MUSC pour découverte thérapeutique et comprend des composés qui sont structurellement diverses et reflète la bibliothèque parent.

Le médicament après : médicament pré taux des APOB a été déterminé pour chaque composé (Figure 3) et l’identification des grands succès a été atteint par le z-score analyse (Figure 3D)16. Dans ce cas, les petites molécules qui réduit l’APOB avec un z-score ≤-2.0 comme hits potentiels étaient considérés comme. Lorsque le dépistage 1 000 petites molécules, le nombre de coups possibles avec un z-score de ≤ 2,0 est généralement relativement facile à gérer. Toutefois, lorsqu’il procède à un écran plus grand, on compterait sur une note plus prudente de ≤-3.0, basée sur la règle 3-sigma, d’accroître la confiance dans des cibles potentielles. Dans cet exemple, nous avons identifié 24 hits potentiels avec un ratio APOB qui variait de 0,86 à 0,44 (Figure 4 a). Une analyse secondaire a porté sur quatre échantillons (n = 4 réplicats biologiques) d’exclure les composés qui ont un impact négatif sur la viabilité cellulaire et pour déterminer quels composés pourraient réduire reproductible APOB dans le milieu. L’origine composés de 24 candidats, quatre ont été jugés pour être reproductibles (p ≤ 0,05) (Figure 4 b-C). Après une étude plus approfondie, 2 de ces composés ont été trouvés à négativement affecter la viabilité cellulaire, ce qui suggère que la réduction observée APOB risquait d’un être une conséquence de la perte de cellules. Les deux autres composés seraient bons candidats pour les études de suivi.

Figure 1
Figure 1 : Lavage hépatique différenciation des humains CISP. (A) La morphologie des colonies iPSC immédiatement avant la récolte (panneau de gauche) et CISP après avoir recueilli des cellules pour la différenciation (panneau de droite) - après le traitement de l’accutase, les cellules doivent être dissociés en 3 à 6 cellules/cluster. Echelle = 50 µm. (B) tableau indiquant les conditions de culture à chaque étape de la différenciation (en haut). Immunomarquage (panneaux inférieurs) a été réalisée afin d’identifier l’expression du marqueur à chaque étape de la différenciation. Panneaux montrent OCT4 et DAPI teinté de noyaux dans la CISP, SOX17 et FOXA2 en définitive endoderme, HNF4a et FOXA2 dans les cellules progénitrices hépatique, HNF4a et AFP en cellules hépatocytes immatures, et HNF4a et albumine dans relativement mature cellules semblables à des hépatocytes. Barreaux de l’échelle = 100 µm (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Homogène différenciation hépatique du CISP humaine dans des plaques de 96 puits. Immunomarquage a été effectuée sur chaque puits individuels d’une plaque de 96 puits contenant des dérivés iPSC hépatocytes au 20e jour de différenciation pour détecter (A) albumine et (B) HNF4a. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Dépistage de petites molécules à l’aide des hépatocytes humains dérivés iPSC. (A) aperçu schématique de l’approche utilisée pour identifier des composés qui peuvent réduire les niveaux de ABOB au milieu des hépatocytes iPSC-dérivé. (B) graphe montrant saisissants d’un test ELISA pour détecter le niveau d’APOB dans le milieu de 87 puits (n = 87) des hépatocytes iPSC-dérivé (bleu) ou indifférencié CISP (orange). Ces données ont été utilisées pour calculer un facteur Z (Z' = 0,73). (C) graphique montrant la drogue après : ratios de drogue avant de la concentration de l’APOB dans le milieu de culture des hépatocytes iPSC dérivés traitement pendant 24 h avec 998 composés de l’ensemble RSL SC3 . Graphique (D) z-scores des données présentées au point C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Validation des hits primaires. (A) le tableau montrant les composés identifiés dans l’écran principal comme étant en mesure de réduire l’APOB. (B, C) Graphiques à barres montrant l’impact des composés sur des drogues après : ratio de concentration APOB pré médicament ()B) et la viabilité cellulaire (C) dans les hépatocytes iPSC dérivés traités avec des composés dans l’analyse de suivi. Barres d’erreur représentent ± SEM (n = 4 réplicats biologiques) ; * p ≤ 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Découverte de médicaments cible basé, où les petites molécules sont identifiées qui influent sur l’activité d’une protéine spécifique, a fait l’objet de nombreux efforts de dépistage existants. Bien que cette approche a fourni de nombreux produits pharmaceutiques, écrans, basés sur l’inversion d’un phénotype, la pharmacologie classique, ont eu plus de succès dans l’identification des composés de première catégorie qui ont été cliniquement efficace1. Un inconvénient à la découverte de médicaments phénotypique est qu’il repose sur la disponibilité des modèles appropriés de la maladie. Cela peut être un défi lorsque des modèles cellulaires de la maladie ne sont pas disponibles, ou lorsque les espèces animales communes de recherche ne pas récapituler les symptômes cliniques. Toutefois, la capacité de générer le CISP de cellules somatiques du patient a fourni des nouvelles opportunités à des maladies humaines en culture3modèle. Pour certaines maladies, comme des maladies génétiques rares, les patients peuvent être peu nombreuses, et difficile d’accès et de consentement. Cependant, avec l’avènement de l’ingénierie du génome, il est relativement facile d’introduire des mutations causatifs dans le génome de l’iPSC, ce qui permet de modéliser même les plus rares de maladies rares.

Une fois que le CISP est dans la main, il est nécessaire produire un type de cellule appropriée qui manifestent les symptômes de la maladie. Par exemple, maladies affectant la fonction neurale peuvent exiger la production de neurones ou cellules gliales17, alors que ceux qui affectent le foie peuvent besoin d’hépatocytes9,18 ou des cellules épithéliales biliaires pour étudient le19, 20 , 21. cette exigence introduit un certain nombre de mises en garde lors de l’examen de l’utilisation du CISP pour la découverte de médicaments. Tout d’abord, il est important de comprendre la base cellulaire de la maladie. Cela peut être difficile, surtout lorsque les cellules adoptent des caractéristiques basées sur l’emplacement ou l’environnement. Cela pourrait être vrai pour les hépatocytes qui présentent des différences dans les profils d’expression génique et la fonction enzymatique qui dépendent de leur position dans le lobule hépatique. Ensuite, travaillez sur des cellules d’isolement peut empêcher l’étude des maladies qui reflètent une perturbation de la structure des tissus tels que la cirrhose, communication de cellules telles que les maladies neuromusculaires ou ceux qui sont influencés par l’inflammation tels qu’inflammatoires maladie de l’intestin.

Afin d’étudier une maladie du foie, plusieurs groupes de recherche ont décrit des protocoles afin de générer des cellules semblables à des hépatocytes de CISP13,22,23,24,25. Alors que la plupart de ces protocoles est efficace, la limitation de la technique est que les cellules ne récapitulent complètement la fonction des hépatocytes frais. Autrement dit, qu'il est important de déterminer si les cellules générées de CISP affichage les fonctions nécessaires pour évaluer l’impact d’une mutation donnée. Parmi les gènes dont l’expression ne correspond pas entièrement à celle trouvée dans les hépatocytes fraîches sont ceux codant CYP450 protéines25,26. Plusieurs de ces protéines ont un rôle dans le métabolisme des médicaments et la réponse de xénobiotique. Ceci est important lorsque l'on considère la conception d’un écran, car de nombreux médicaments nécessitent la production de métabolites actifs, et cela pourrait être affectée dans les hépatocytes iPSC-dérivé. Efforts visant à améliorer la qualité des hépatocytes est étant activement poursuivi27. Malgré les mises en garde, plusieurs études ont démontré que CISP provenant de patients présentant des erreurs innées du métabolisme hépatique peut servir avec succès pour générer des cellules semblables à des hépatocytes qui reflètent la physiopathologie de la maladie dans la culture9 , 18 , 28 , 29.

Pour les écrans réussir, il est important de s’assurer la différenciation homogène des hépatocytes de la CISP. Lorsque les différenciations dans les plaques à 96 puits ne parviennent pas à produire des hépatocytes de haute qualité, il est le plus souvent due à la mauvaise qualité de la CISP parental ou culture de la CISP dans des conditions moins qu’optimales. Pluripotence de CISP doit être maintenue avec soin par la culture dans un milieu de haute qualité avec change tous les jours tel que décrit dans le protocole 1.2. La densité des cellules pluripotentes dans le plat de la culture doit être surveillée attentivement, car si les cellules deviennent plus anastomosé, ils tendent à perdre la pluripotence et spontanément se différencient. Nous trouvons aussi que cultivant les cellules en concentrations physiologiques d’oxygène favorise la pluripotence et est bénéfique au cours de certains stades de différenciation. Toutefois, si un équipement approprié n’est pas disponible, il est toujours possible d’utiliser l’oxygène ambiant à la fois la culture des cellules pluripotentes et induire la différenciation. Nous proposons systématiquement définir la pluripotence de la CISP stock en mesurant l’expression des marqueurs de pluripotence multiples y compris OCT-3/4, NANOG et TRA-1-60, avant d’effectuer des différenciations quelles que soient les conditions de culture. Nous avons également observé que lorsque les cellules forment l’endoderme à haute efficacité, ils ont tendance à peal de la surface des plaques comme les feuilles de la cellule. Nous avons découvert que traiter brièvement l’endoderme iPSC dérivées des cellules avec la solution d’EDTA 0,02 % peuvent aider à réduire le détachement cellulaire. Enfin, la concentration optimale de cellules nécessaires à la différenciation efficace peut différer entre les lignes de l’iPSC et peut avoir un impact détachement cellulaire. Pour cette raison, il est important de déterminer empiriquement la concentration de cellules nécessaires pour les différenciations efficaces, surtout si vous travaillez avec une nouvelle culture de l’iPSC.

En résumé, nous avons décrit un protocole de différenciation progressive qui génère des cellules semblables à des hépatocytes de CISP qui sont compatibles avec les écrans chimiques. Les cellules hépatocytes sont produites comme monocouches en plaques à 96 puits, et le processus est efficace et reproductible. Nous avons démontré la faisabilité de criblage de composés pour leur capacité à réduire les concentrations d’APOB dans le milieu de culture. Le format de différenciation est compatible avec plusieurs essais y compris ELISA, qRT-PCR et l’imagerie contenu élevé. Nous croyons que le domaine trouveront l’approche utile pour identifier les agents thérapeutiques potentiels et pour l’identification pharmacologique des voies d’exposition affectant la différenciation des hépatocytes et fonction dans les futures applications5,30.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 et HG006398 de Sad). Nous tenons à remercier le Dr Behshad Pournasr, Dr. James Heslop et Ran Jing pour leurs contributions.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

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References

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Biologie du développement numéro 135 provoquée par des souches pluripotentes cellules Culture cellulaire différenciation des hépatocytes High Throughput Screening cellules semblables à des hépatocytes hypercholestérolémie
À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery
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Liu, J. T., Lamprecht, M. P.,… More

Liu, J. T., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

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