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Developmental Biology

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Summary

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Abstract

A capacidade de diferenciar as células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) em hepatócitos células (HLCs) oferece novas oportunidades para estudar erros inatos do metabolismo hepático. No entanto, para fornecer uma plataforma que ofereça suporte a identificação de pequenas moléculas que potencialmente pode ser usado para tratar a doença do fígado, o procedimento requer um formato de cultura que é compatível com milhares de compostos de triagem. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando as condições de cultura completamente definidos, que permitem a diferenciação pode ser reproduzida de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Nós também fornecemos um exemplo de uso da plataforma para compostos de tela para a sua capacidade para reduzir a apolipoproteína B (APOB) produzido a partir de hepatócitos iPSC-derivados gerados a partir de um paciente de hipercolesterolemia familiar. A disponibilidade de uma plataforma que é compatível com a descoberta de medicamentos deve permitir que os investigadores a identificar novas terapêuticas para doenças que afetam o fígado.

Introduction

Sucesso na identificação de drogas que podem ser usadas para uma doença rara de destino baseia-se no desenvolvimento de ensaios que podem ser usados para a seleção. Hipótese ou telas no destino (farmacologia inversa) são úteis, mas exigem um conhecimento detalhado da base molecular da doença. Telas fenotípicas (farmacologia clássica) evitam a necessidade de uma compreensão detalhada das vias bioquímicas, mas em vez disso, contam com o desenvolvimento de modelos que espelham com precisão a fisiopatologia da doença. Apesar do entusiasmo para abordagens baseadas em alvo, análises do FDA aprovado primeiro na sua classe de drogas revelam que telas fenotípicas foram muito mais bem sucedido1. O objectivo geral deste método é estabelecer uma plataforma para alto throughput screening que pode ser usado para identificar moléculas pequenas para o tratamento da doença hepática metabólica. Vários modelos de em vitro têm sido descritos incluindo primários hepatócitos, células de hepatoma e de células progenitoras fígado2. No entanto, a maioria destes modelos têm limitações, e há uma necessidade de novos modelos com precisão pode recapitular a fisiopatologia das deficiências hepáticas metabólicas na cultura. Recentemente, as células-tronco pluripotentes humanas combinadas com a edição de gene ter oferecido uma oportunidade para modelar até os mais raros de doenças raras em cultura sem a necessidade de acesso pacientes diretamente3. Enquanto o uso de iPSCs paciente específico como uma ferramenta para descobrir pequenas moléculas para o tratamento de doenças raras do fígado é conceitualmente razoável, existem apenas alguns relatórios demonstrando a viabilidade desta abordagem4. No entanto, nós temos estabelecido recentemente uma plataforma que costumava iPSC-derivado de hepatócitos com sucesso identificar drogas que podem ser realocadas para o tratamento das deficiências no metabolismo do fígado5.

Este protocolo explica o processo de diferenciação humana iPSCs para hepatócitos células em placas de 96 poços e usá-los para selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas. Ele também descreve a análise de ponto de extremidade usando hipercolesterolemia como um exemplo de doença hepática metabólica. Esta abordagem deve ser útil para estudar o papel e a aplicação de pequenas moléculas no contexto de doenças infecciosas do fígado, doença hepática metabólica, toxicidade de drogas e outros distúrbios hepáticos.

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Protocol

1. cultura de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

  1. Revestimento recombinante humano E-caderina Fc proteína da fusão (E-cad-Fc) ou outras matrizes apropriados para cultura hPSC 6
    1. Dilua E-cad-Fc a 15 μg/mL com Phosphate-Buffered salina de Dulbecco contendo cálcio e magnésio (DPBS (+)).
    2. Casaco pratos de cultura de tecidos de suspensão de 100 mm com 5 mL de diluídos E-cad-Fc e incubar a 37 ˚ c pelo menos 1 h. substrato de remover e substituir com 5 mL de meio (por exemplo, mTeSR1 conhecido como M-médio doravante)7.
      Nota: O meio de cultura utilizado neste protocolo é preparado seguindo protocolos publicados7. No entanto, várias outras preparações de mídia têm sido descritas, ou estão disponíveis comercialmente, que são provável compatível com o procedimento.
    3. Recupere um frasco de iPSCs criopreservado de nitrogênio líquido. Descongelar em 37 ˚ c até um cristal de gelo pequeno permanece. Delicadamente, pipete células para um tubo cônico de 15 mL estéril contendo 4 mL do meio-de-M.
    4. Centrifugar a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e gentilmente re-suspender as células com 5 mL do meio suplementado com 10 µM de Y-27632, um inibidor seletivo de Rho-associado, coiled-coil contendo proteína quinase (ROCK).
    5. Remova o M-médio da etapa 1.1.2 e transferir 5ml de células da etapa 1.1.4 para pratos de cultura de tecidos E-cad-Fc-revestido-100mm suspensão.
  2. Manutenção de iPSCs humano na cultura
    1. Uma vez iPSCs chegar em torno de 80% confluência, remover o meio de cultura e lave uma vez com cálcio e magnésio livre DPBS (-). Aspirar o DPBS (-) e adicionar uma quantidade suficiente de solução de EDTA 0,02% para cobrir as placas e, em seguida, incubar por até 3 min. à temperatura ambiente.
      Nota: Na confluência de 80%, a placa deve conter em torno de 2 x 107 células. É importante não para overgrow as células e para garantir que as células retêm uma morfologia indiferenciada. A pluripotência das células pode ser determinada pela coloração com marcador de células-tronco Tra-1-60 ou equivalente8.
    2. Quando as células começam a liberar, a remoção da solução de EDTA 0,02% e inundar o prato com 10 mL do meio-M a liberar as células. Ajuda o desprendimento de iPSCs pipetando suavemente.
      Nota: O tempo de incubação médio de células desanexar é em torno de 3 min, mas isso precisa ser determinada empiricamente, para cada linha de iPSC. As células devem ser lançadas como pequenos grupos contendo em torno de 5-10 iPSCs por cluster.
    3. Transferi 1/10 das células suspensas por fresca prato de cultura de tecidos suspensão de E-cad-Fc de revestido 100 mm, contendo 5 mL do meio-de-M. Incubar as culturas a 37 ˚ c abaixo dos 4% O25% CO2 e meio de mudança diariamente.
      Nota: Embora iPSCs rotineiramente são cultivadas em condições fisiológicas de oxigênio para promover a pluripotência, iPSCs também podem ser cultivadas usando oxigênio ambiente.

2. diferenciação de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de 96 poços

Nota: Esta seção descreve a diferenciação das iPSCs em um formato que é compatível com o rastreio. Usando essa abordagem, é possível induzir iPSCs humana para diferenciar e formar células hepatócito em 20 dias. Enquanto isto é adequado para a maioria dos ensaios, o comprimento da cultura pode ser estendido para melhorar a maturidade das células.

  1. Revestimento de placas de cultura de tecidos de 96 poços com matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido
    1. Prepare o estoque diluindo a matriz a 2 mg/mL com gelada meio de cultura de tecido DMEM/F12 estéril. Dividir a matriz em 250 alíquotas μL e armazenar no-80 ˚ c Membros até necessária. Fica frio 10 mL de DMEM/F12 no gelo por 30 min. recuperar um 250 μL parte alíquota do estoque de matriz de 2 mg/mL e degelo no gelo.
    2. Combine a matriz com 10 mL de DMEM/F12 frio, misturando delicadamente com uma pipeta previamente refrigerada tornar-se uma concentração final de 0,05 mg/mL.
    3. Transferi 100 μL de matriz diluído a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Incubar a 37 ˚ c, 4% O25% CO2 pelo menos 1 h. elimine a matriz e substitua com 50 μL de M-médio por bem. Armazenar a 37 ° C, 4% O25% CO2 até que seja necessário.
  2. Células de placa para diferenciação
    1. Cultura de iPSCs em placas de 100-mm até as células aproximam confluência de 80%. Certifique-se de que o prato contém cerca de 2 x 107 células. Determine o número de células por célula citômetro de fluxo ou hemocytometer.
      Nota: Com a experiência, a qualidade das células iPSCs pode ser julgada por microscopia; no entanto, cerca de 98% das células deve expressar pluripotência marcadores como o epítopo TRA-1-60, quando medido pela FACS ou immunostaining. É importante que as células permanecem ativamente dividindo e não estão abandonadas.
    2. Para colher as iPSCs de cada prato 100mm, Aspire o meio de cultura e enxágue com 5 mL de DPBS (-). Substituir o enxágue com 3 mL de solução de desprendimento de células (por exemplo, accutase) e incube por cerca de 2 min a 37 ° C, 4% O25% CO2.
      Nota: É importante seguir o desprendimento das células por microscopia. Fazer não digerir com accutase. O objetivo é liberar as células como pequenos grupos com tratamento mínimo.
    3. Quando as células começam a desanexar, colheita, adicionando 7 mL do meio de M. Pipetar várias vezes para dissociar as colônias de células em pequenos grupos de ao redor 3-6 células (figura 1A).
    4. Colete as iPSCs em um tubo de centrífuga estéril 15 mL e centrifugar a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 5 mL M-médio.
    5. Distribua uniformemente as células em placas de 96 poços revestidos matriz por pipetagem 50 μL de células de suspensão para cada poço. Para configurar cada placa de 96 poços, use uma placa de 100-mm de iPSCs com células em aproximadamente 80% confluência que contém em torno de 5 x 106 células para configurar a diferenciação. Use uma pipeta multicanal para acelerar este processo. Cultura das células durante a noite em 37 ˚ c, 4% O25% CO2.
      Nota: É importante que um número igual de células é depositado em cada poço para garantir diferenciações podem ser reproduzidas.
  3. Induzir a diferenciação das células
    1. Examine as placas de 96 poços por microscopia para garantir que as células cobrem pelo menos 70% da superfície de cada bem. Se a cobertura é inferior a 70%, substitua o meio meio fresco e incubar por um adicional 24h em 37 ˚ c, 4% O25% CO2.
      Nota: Incubar as células para mais de 48 h após chapeamento sem induzir a diferenciação comumente reduz a eficiência de diferenciação. Diferenciação também ocorrerá usando oxigênio ambiente, embora a eficiência pode ser afetado.
    2. Para o dia 1 a dia 2 de diferenciação, substitua o meio de cultura RPMI suplementado com 2% B27 (sem insulina), 100 ng/mL Activin A 10 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL FGF2. Adicionar 100 μL de médio por bem e incubar a 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com uma mudança diária média para 2 dias.
      Nota: Lidar com grandes números de placas de 96 poços requerem o uso de uma pipeta assistida ou robô. pipetas de 12 canais e 96 canais são ideais para mudança de média diária.
    3. Por dia 3 a 5 dias de diferenciação, a substituir o meio de cultura com RPMI suplementado com 2% B27 (sem insulina) e 100 ng/mL Activin A. Culture células em 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com mudança média diária por 3 dias.
    4. No dia de diferenciação 5, antes de substituir com meio de cultura fresco, tratar cada bem com solução EDTA 100 μL 0,02% por 30 s, em seguida, remover e substituir com meio de cultura fresco.
      Nota: Se a diferenciação a endoderme é eficiente, a monocamada de diferenciar células é propensa a casca da placa. Um breve tratamento com solução de EDTA 0,02% ajuda a aliviar o desprendimento de células. Este tratamento não afeta a diferenciação de hepatócitos.
    5. Para a diferenciação entre os dias 6 a 10, substitua o meio de cultura com RPMI / 2% B27 (com insulina) suplementado com 20 ng/mL BMP4 e 10 ng/mL FGF2 e incubar a 37 ˚ c, 4% O25% de CO2 por 5 dias com mudança de média diária. Nesta fase induz células de se diferenciar em células progenitoras hepática.
    6. Para a diferenciação entre os dias 11 a 15, substitua o meio de cultura com RPMI / 2% B27 (com insulina) suplementado com 20 ng/mL HGF. Incube a 37 ˚ c, 4% O25% de CO2 por 5 dias com mudança de média diária.
    7. Para a diferenciação entre os dias 16 a 20, substitua o meio de cultura com um meio de cultura de células do hepatócito (HCM) suplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M (OSM). Incube as celulas em 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com mudança média diária por 5 dias.
      Nota: Reprodutibilidade da diferenciação entre poços individuais com eficiência pode ser determinada medindo-se o nível relativo de albumina, AFP ou APOB secretada para o meio por ELISA (ver 3.2).

3. pequena molécula triagem

Nota: A seguir descreve o procedimento usado para identificar compostos que podem ser usados para diminuir o nível de APOB no meio dos hepatócitos células derivadas de iPSCs hipercolesterolemia familiar. Uma descrição do modelo e seu uso na identificação de drogas para reduzir o colesterol tem sido descrita em detalhe anteriormente5,9. No exemplo atual, 1.000 compostos da biblioteca de coleção de compostos de Carolina do Sul (SC3) foram projectados. Cada composto foi testado em uma concentração de 2 μg/mL.

  1. Tratamento de iPSC - derivada de hepatócitos com pequenas moléculas
    1. Dilua a mestre biblioteca composta para gerar placas de ações de trabalho com compostos em uma concentração de 20 μg/mL em 2% DMSO e loja-20 ˚ c.
    2. Prepare-se bastante placas de 96 poços de iPSC-derivado de hepatócitos para permitir que cada composto a ser testado.
      Nota: O número de compostos será projectado irá ditar o número de placas de 96 poços que são necessárias. Em geral, um único bem deve estar preparado para cada composto, além de adicionais poços para qualquer controle de amostras. Os poços ultraperiféricas da placa geralmente são evitados para reduzir a possibilidade de efeitos de borda que pode corromper a interpretação. Correspondências podem ser identificadas usando o método de pontuação z sem a necessidade de usar repetições. Se réplicas estão incluídas, é mais apropriado usar o teste t.
    3. Após a conclusão da diferenciação (ver 20, do dia 2.3.7), substituir o meio de cultura com 100 μL de HCM frescosuplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M. Incubar a 37 ˚ c, 4% O25% CO2 para exatamente 24 h. recupere o meio de cultura para uma nova placa de 96 poços e loja-20 ˚ c. Use esse exemplo para calcular o nível de APOB no meio antes da adição de drogas.
    4. Adicione 90 μL do HCM fresco suplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M em cada poço. Adicione 10 μL de cada composto do estoque trabalho após a mistura por pipetagem. Adicionar DMSO para 0,2% para controlar os poços para coincidir com a concentração final nas amostras tratadas e incubar a 37 ˚ c, ambiente O25% CO2 para exatamente 24 h. recolher o meio de cultura e armazenar a-20 ˚ c. Use esse exemplo para determinar o nível de APOB após o tratamento com compostos.
    5. Opcional - as células restantes podem ser processadas por imunocoloração, viabilidade celular ou análises dos níveis de mRNA usando abordagens padrão.
      Nota: Esta tela foi projetada para identificar drogas que tinham um efeito rápido em níveis APOB. No entanto, dependendo do modelo de doença, ensaios a jusante ou mecanismo de ação de drogas, pode ser benéfico tratar a amostra por vários dias.
  2. Determinar os níveis APOB por ELISA
    1. Determine a concentração da apolipoproteína B (APOB) ambos pré e pós-drogas tratadas das amostras de usando um kit de desenvolvimento humano APOB ELISA seguindo o protocolo do fabricante.
    2. Preparando as seguintes soluções
      1. Tampão de lavagem, composto de 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4. Armazene a 4 ˚ c até o uso.
      2. Tampão de incubação, composto de 0,05% Tween 20 e 0,1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS, pH 7,4. Armazene a 4 ˚ c até o uso.
    3. Prepare o anticorpo APOB (mAB 20/17) diluindo a 2 µ g/mL de PBS, pH 7,4. Adicionar 100 μL do anticorpo diluído por bem e incubar a 4 ˚ c durante a noite.
    4. Retire o anticorpo as chapas de ensaio e lave cada uma bem duas vezes com 200 µ l de PBS, pH 7,4.
    5. Adicionar 200 μL/poço de 0,05% Tween 20, 0,1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS, pH 7,4 e incubá-los em uma plataforma de agitação por 1h à temperatura ambiente.
    6. Preparar uma curva padrão de 8 pontos usando 0,05% Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4, com as seguintes concentrações de APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL e 50 ng/mL.
    7. Dilua as amostras de teste 1:4 com 0,05% de Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4.
    8. Após 1 h de bloqueio com tampão de incubação, descartar o buffer e lave as placas de ensaio cinco vezes com 200 μL de 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4.
    9. Completamente remover qualquer tampão de lavagem residual e transferir 90 μL das amostras diluídas e os padrões APOB para as placas de ensaio. Incube a temperatura ambiente em um agitador por 1h.
    10. Descartar a amostra e lavar com 200 μL 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4 por bem. Repita as lavagens um total de 5 vezes. Adicione 100 μL por poço de mAB LDL 11-biotina 1:1,000 diluído em 0,05% Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4. Incube a temperatura ambiente em uma plataforma de agitação por 1h.
    11. Descartar o reagente e lave com 200 μL por bem buffer de lavar 5 vezes. Adicionar 100 μL por poço de anticorpo Streptavidin HRP (1:1, 000 diluição usando buffer de incubação), então incubar a temperatura ambiente em uma plataforma de agitação por 1h.
    12. Descartar o reagente e lave com 200 μL 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4 por bem. Repita as lavagens um total de 5 vezes. Completamente Retire o tampão de lavagem residual as chapas de ensaio adicionar 100 μL por poço da solução de substrato Tetramethylbenzidin (TMB) e incubar a temperatura ambiente por 8 min.
    13. Sem retirar o substrato TMB, diretamente Adicione 100 μL por poço da solução de paragem (1N HCl).
    14. Determinar a absorvância a 450 nm, utilizando um leitor de placa.
    15. Uma curva padrão pode ser estabelecida, usando o método de regressão logística de quatro parâmetro e, em seguida, usado para definir a concentração de APOB em cada amostra10.
    16. Examinar a pre-droga: pós-droga proporção de APOB em cada amostra para identificar compostos com potencial para diminuir a APOB níveis no meio.

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Representative Results

Geração de hepatócito - como células: A Figura 1 descreve a cronograma das mudanças que ocorrem durante a diferenciação das iPSCs humano para hepatócitos células. A cultura de iPSCs em E-Cad-Fc fornece aproximadamente 2mm colônias de diâmetro que expressam o marcador pluripotentes OCT4 (figura 1A-B). A morfologia das células cultivadas em uma matriz de E-caderina será ligeiramente diferente para aqueles cultivados em outras superfícies. Eles tendem a ter uma morfologia achatada com uma maior área de superfície citoplasmática (figura 1A). Embora as células-tronco pluripotentes humanas pode ser eficientemente cultivadas em um número de diferentes matrizes11, a cultura de iPSCs em uma matriz de E-caderina é acreditada para aumentar a homogeneidade da população de células pluripotentes e permite que a enzima livre manipulação das células durante a passagem de12. No entanto, várias matrizes alternativas, incluindo a matriz da membrana basal, laminins, vitronectina e fibroblastos embrionários de rato (MEF), também podem ser usadas para manter iPSCs humano e tudo deve ser compatível com o procedimento descrito13. Em todos os casos, a pluripotência celular pode ser confirmada por Tra-1-60 ou equivalente8.

Para iniciar a diferenciação, as iPSCs devem ser cobrados como pequenos grupos (figura 1A). No início da diferenciação, as células chapeadas devem cobrir cerca de 80% da superfície da placa. Após 5 dias de tratamento com fatores de crescimento, as células expressam proteínas que são caracteristicamente expressos na endoderme definitivo como SOX17 e FOXA2 (figura 1B). Nesta fase, mais de 90% das células tipicamente expressar estes marcadores. Depois de 5 dias de diferenciação, a endoderme converte para um destino hepático, e além de FOXA2, as células expressam HNF4a, que podem ser identificados durante o restante do processo de diferenciação (figura 1B). Como as células adote um destino hepático, eles devem cobrir a superfície da placa como uma monocamada. Depois da adição do HGF, as células começam a expressar as proteínas que são encontradas nos hepatócitos fetais, incluindo AFP (figura 1B). Gotículas lipídicas podem ser observadas no citoplasma das células. Após a conclusão da diferenciação, as células adotam uma morfologia cuboidal com um núcleo contendo nucléolos proeminentes e uma citoplasma grande com várias gotículas lipídicas. Um subconjunto de células do hepatócito será multi nucleado. A maioria das células expressa um extenso repertório de proteínas hepatócito incluindo albumina (figura 1B)14.

Tela de alta taxa de transferência eficaz usando hipercolesterolemia como um modelo de doença: Hipercolesterolémia reflete a concentração excessiva de lipoproteína de baixa densidade-colesterol (LDL-C) no soro. Na hipercolesterolemia familiar (FH), o aumento do nível de soro de LDL-C é devido primeiramente à mutações no receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLR) que medeia a captação de LDL-C para o afastamento pelos hepatócitos. Descrevemos anteriormente a geração de iPSCs de um paciente com hipercolesterolemia familiar homozigótica e sua utilização na geração de hepatócitos que espelhado doença hepática do paciente em cultura9. Foi demonstrado que essas células poderiam ser usadas com sucesso como uma plataforma para a descoberta de medicamentos. Quando uma biblioteca de ~ 2.500 drogas foi exibida, verificou-se que glicosídeos cardíacos tiveram uma capacidade inesperada para abaixar o LDL-C em hepatócitos de iPSC-derivado, hepatócitos humanos primários e em ratos com fígados humanizados. Além disso, mediante exames prontuários médicos, encontramos esse colesterol níveis caiu em pacientes que foram prescritos um glicosídeo cardíaco para o tratamento da doença de coração. Estes estudos confirmaram que hepatócitos iPSC-derivada podem ser usados com sucesso em telas para identificar terapêutica.

Para fornecer uma plataforma que é compatível com a triagem, é importante que as diferenciações são reprodutíveis e que a variação de poço para poço é minimizada. A Figura 2 mostra os resultados de imunocoloração em cada poço de uma placa de 96 poços para detectar HNF4a e albumina no dia 20 de diferenciação. Como pode ser visto na figura, a distribuição destas proteínas hepatócito é semelhante em todos os poços.

O componente de proteína central do LDL-C é APOB. Aqui, usamos iPSCs a tela para APOB reduzindo compostos fornecer um exemplo do uso de derivados de iPSC hepatócitos para pequena molécula de triagem (Figura 3A). APOB pode ser facilmente medido em solução por ELISA. Desde que o ELISA pode ser realizada em um grande número de amostras, pode ser usado como base para uma tela. A adequação de qualquer ensaio para rastreio de alto rendimento melhor é determinada por meio de uma medida chamada o fator Z (ou Z')15. Este parâmetro estatístico calcula a eficácia de um ensaio para distinguir entre as amostras de controlo positivo e negativo. Um ensaio com um fator de Z > 0.5 é considerado compatível com uma tela de15. Como pode ser visto na Figura 3B, o Z' do ensaio APOB = 0,73, que confirma a adequação de usar a plataforma para a descoberta de medicamentos.

Identificação de compostos que têm a capacidade de baixar os níveis APOB em meio de cultura de iPSC - derivado de hepatócitos: para determinar se a plataforma poderia ser usada para identificar novos compostos que afetam os níveis APOB, nós selecionados 1.000 pequenas moléculas da coleção de compostos de Carolina do Sul (SC3) representativo conjunto Lite (RSL). O RSL foi gerado pelo centro de Carolina do Sul MUSC para descoberta terapêutica e inclui compostos que são estruturalmente diversos e reflecte a biblioteca do pai.

A pós-droga: pre-droga relação da APOB foi determinada para cada composto (Figura 3) e identificação dos sucessos foi alcançada pelo escore z análise (Figura 3D)16. Neste caso, considera-se pequenas moléculas que reduziram APOB com um z-score ≤-2,0 como potenciais hits. Quando rastreio 1.000 pequenas moléculas, o número de potenciais hits com um z-score de ≤-2,0 normalmente é relativamente fácil. No entanto, ao conduzir uma tela maior, que contamos com um placar mais conservadora de ≤ 3,0, com base na regra de 3-sigma, para aumentar a confiança em alvos potenciais. Neste exemplo, nós identificamos 24 sucessos potenciais com uma relação APOB que variou de 0,86 a 0,44 (Figura 4A). Um ensaio secundário foi realizado em amostras de quadruplicate (n = 4 repetições biológicas) para excluir compostos que tinham um impacto negativo na viabilidade celular e determinar quais compostos reproducibly abaixasse APOB no meio. Dos compostos 24 candidato original, quatro foram encontrados para ser reprodutível (≤0.05p ) (Figura 4B-C). Após um estudo mais aprofundado, 2 destes compostos foram encontrados para negativamente afetar viabilidade celular, sugerindo que a redução observada em APOB era susceptível de um ser uma consequência da perda de células. Os restantes dois compostos seriam considerados bons candidatos para estudos de seguimento.

Figure 1
Figura 1 : Step-wise hepática diferenciação de iPSCs humana. () Morfologia das colónias de iPSC imediatamente antes da colheita (painel esquerdo) e iPSCs depois de coletar as células para diferenciação (painel direito) - após o tratamento de accutase, as células devem ser dissociadas em 3-6 células/cluster. Barra de escala = 50 µm. (B) tabela apresentando condições de cultura em cada estágio de diferenciação (superior). Immunostaining (painéis inferiores) foi realizada para identificar a expressão do marcador em cada estágio de diferenciação. Painéis mostram OCT4 e DAPI manchado núcleos em iPSCs, SOX17 e FOXA2 em definitivo endoderme, HNF4a e FOXA2 em células progenitoras hepática, HNF4a e AFP em células imaturas como hepatócitos, e HNF4a e albumina em relativamente maduras hepatócitos células. Barras de escala = 100 µm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Diferenciação hepática homogênea de iPSCs humana em placas de 96 poços. Immunostaining realizou-se em cada poço individual de uma placa de 96 poços contendo derivados de iPSC hepatócitos no dia 20 de diferenciação para detectar (A) albumina e (B) HNF4a. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Triagem de pequena molécula usando hepatócitos humanos derivados de iPSC. (A) visão geral esquemática da abordagem usada para identificar compostos que podem reduzir os níveis de ABOB no meio dos hepatócitos iPSC-derivado. (B) gráfico mostrando Resultadosdos de um ensaio de ELISA para detectar o nível de APOB a médio de 87 poços (n = 87) dos hepatócitos iPSC-derivado (azul) e/ou indiferenciado iPSCs (laranja). Estes dados foram utilizados para calcular um fator de Z (Z' = 0,73). (C) gráfico mostrando o pós-drogas: pre-drogas rácios da concentração de APOB em meio de cultura de hepatócitos de iPSC-derivado trataram durante 24 h com 998 compostos do conjunto SC3 RSL. (D) gráfico mostrando z-contagens dos dados apresentados em (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Validação de acessos primários. (A) tabela mostrando compostos identificados na tela principal como sendo capaz de reduzir a APOB. (B, C) Bar gráficos que mostram o impacto dos compostos na pós-drogas: rácio de concentração pré-droga APOB (B) e viabilidade celular (C) em hepatócitos de iPSC-derivado tratadas com compostos em análise de acompanhamento. Barras de erro refletem ± SEM (n = 4 repetições biológicas); * ≤0.05 p . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Alvo baseado descoberta de drogas, onde as moléculas pequenas são identificadas que influenciam a atividade de uma proteína específica, tem sido o foco de muitos esforços de rastreio existentes. Embora essa abordagem forneceu inúmeros produtos farmacêuticos, telas com base em reverter um fenótipo, farmacologia clássica, têm sido mais bem sucedidos na identificação de compostos de primeira classe que foram clinicamente eficaz1. Uma desvantagem para descoberta de drogas fenotípica é que ele depende da disponibilidade de modelos apropriados de doença. Isto pode ser um desafio quando modelos de celulares da doença estão indisponíveis, ou quando espécies animais de pesquisa comuns não conseguem recapitular os sintomas clínicos. No entanto, a capacidade de gerar iPSCs de células somáticas de um paciente tem proporcionado novas oportunidades para doenças humanas de modelo na cultura3. Para algumas doenças, como doenças genéticas raras, os pacientes podem ser poucos em número e de difícil acesso e consentimento. No entanto, com o advento da engenharia do genoma, é relativamente simples para introduzir mutações causais no genoma da iPSC, tornando possível modelar até os mais raros de doenças raras.

Uma vez que iPSCs estão na mão, é necessário produzir um tipo de célula apropriada no qual se manifestam os sintomas da doença. Por exemplo, doenças que afectam a função neural podem exigir a geração de neurônios ou em glia17, Considerando que aquelas que afetam o fígado podem necessitar de hepatócitos9,18 ou células epiteliais biliares para estudar19, 20 , 21. esta exigência introduz um número de advertências ao considerar o uso de iPSCs para descoberta de drogas. Em primeiro lugar, é importante compreender a base celular da doença. Isto pode ser desafiador, especialmente quando as células adotam características com base no local ou ambiente. Isso pode ser verdade para hepatócitos que têm diferenças nos perfis de expressão de gene e a função enzimática que dependem de sua localização dentro do lóbulo do fígado. Em segundo lugar, trabalhar com as células isoladamente pode impedir o estudo de doenças que refletem uma perturbação para a estrutura do tecido como cirrose, comunicação célula-célula, tais como doença neuromuscular ou aqueles que são influenciados por inflamação tais como inflamatória doença intestinal.

Para estudar a doença hepática, diversos grupos de pesquisa têm descrito protocolos para gerar células hepatócito de iPSCs13,22,23,24,25. Enquanto a maioria desses protocolos são eficientes, a limitação da técnica é que as células não totalmente recapitular a função dos hepatócitos frescos. Isto significa que é importante determinar se as células gerados de iPSCs exibir as funções necessárias para avaliar o impacto de uma determinada mutação. Entre os genes cuja expressão não é totalmente compatível com que encontrados nos hepatócitos frescos são aqueles codificação CYP450 proteínas25,26. Várias destas proteínas têm funções no metabolismo de drogas e a resposta de xenobióticas. Isto é importante quando se considera o design de uma tela, porque muitas drogas exigem a geração de metabólitos ativos, e isso poderia ser afectado em hepatócitos de iPSC-derivado. Os esforços para melhorar a qualidade dos hepatócitos estão sendo ativamente perseguido27. Apesar das ressalvas, diversos estudos têm demonstrado que iPSCs derivadas de pacientes com erros inatos do metabolismo hepático pode ser usado com sucesso para gerar células hepatócito que espelham a fisiopatologia da doença na cultura9 , 18 , 28 , 29.

Para telas para ser bem sucedido, é importante assegurar a diferenciação homogênea dos hepatócitos das iPSCs. Quando diferenciações em placas de 96 poços não conseguem produzir hepatócitos de alta qualidade, é mais comumente devido a má qualidade das iPSCs parental ou cultura de iPSCs em condições sub-ótimas. Pluripotência de iPSCs deve ser cuidadosamente mantida pela cultura em meio de alta qualidade com alterações diárias conforme descrito no protocolo 1.2. A densidade de células pluripotentes, a placa de cultura deve ser monitorada cuidadosamente, porque se as células se tornam mais confluente tendem a perder a pluripotência e diferenciar-se espontaneamente. Também descobrimos que cultivo as células em concentrações fisiológicas de oxigênio promove pluripotência e é benéfico durante alguns estágios de diferenciação. No entanto, se o equipamento apropriado não estiver disponível, é ainda possível usar oxigênio ambiente para cultura de células pluripotentes e induzir a diferenciação. Sugerimos que rotineiramente, definindo a pluripotência das iPSCs estoque medindo-se a expressão de vários marcadores de pluripotência incluindo OCT-3/4, NANOG e TRA-1-60 antes de executar a extensas diferenciações independentemente das condições de cultura. Também observamos que, quando as células formam a endoderme com alta eficiência, têm uma tendência a peal da superfície das placas como folhas de célula. Encontramos que tratando brevemente a endoderme iPSC-derivado células com solução de EDTA 0,02% podem ajudar a reduzir o desprendimento de células. Finalmente, a concentração ideal de células necessárias para diferenciações eficientes pode diferir entre linhas de iPSC e pode afetar o desprendimento de células. Por este motivo, é importante determinar empiricamente a concentração de células necessárias para diferenciações eficientes, especialmente quando se trabalha com uma nova cultura de iPSC.

Em resumo, descrevemos um protocolo passo a passo de diferenciação que gera células hepatócito de iPSCs compatíveis com telas de químicas. As células dos hepatócitos, como são produzidas como monocamadas em placas de 96 poços, e o processo é eficiente e reprodutível. Vamos demonstrar a viabilidade de triagem compostos por sua capacidade de abaixar os níveis de APOB em meio de cultura. O formato de diferenciação é compatível com vários ensaios, incluindo a imagem de conteúdo elevada, qRT-PCR e ELISA. Acreditamos que o campo irá encontrar a abordagem útil para identificar potencial terapêutica e para a identificação farmacológica das vias que afetam a diferenciação do hepatócito e função em futuras aplicações5,30.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 de S.A.D.). Gostaríamos de agradecer o Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Jing Ran pelas suas contribuições.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

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References

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Biologia do desenvolvimento edição 135 Induced Pluripotent Stem células cultura celular diferenciação de hepatócito alto Throughput triagem hepatócitos células hipercolesterolemia
Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas
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Liu, J. T., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

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