Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

Resumo

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Resumo

A capacidade de diferenciar as células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) em hepatócitos células (HLCs) oferece novas oportunidades para estudar erros inatos do metabolismo hepático. No entanto, para fornecer uma plataforma que ofereça suporte a identificação de pequenas moléculas que potencialmente pode ser usado para tratar a doença do fígado, o procedimento requer um formato de cultura que é compatível com milhares de compostos de triagem. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando as condições de cultura completamente definidos, que permitem a diferenciação pode ser reproduzida de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Nós também fornecemos um exemplo de uso da plataforma para compostos de tela para a sua capacidade para reduzir a apolipoproteína B (APOB) produzido a partir de hepatócitos iPSC-derivados gerados a partir de um paciente de hipercolesterolemia familiar. A disponibilidade de uma plataforma que é compatível com a descoberta de medicamentos deve permitir que os investigadores a identificar novas terapêuticas para doenças que afetam o fígado.

Introdução

Sucesso na identificação de drogas que podem ser usadas para uma doença rara de destino baseia-se no desenvolvimento de ensaios que podem ser usados para a seleção. Hipótese ou telas no destino (farmacologia inversa) são úteis, mas exigem um conhecimento detalhado da base molecular da doença. Telas fenotípicas (farmacologia clássica) evitam a necessidade de uma compreensão detalhada das vias bioquímicas, mas em vez disso, contam com o desenvolvimento de modelos que espelham com precisão a fisiopatologia da doença. Apesar do entusiasmo para abordagens baseadas em alvo, análises do FDA aprovado primeiro na sua classe de drogas revelam que telas fenotípicas foram muito m....

Protocolo

1. cultura de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

1. Revestimento recombinante humano E-caderina Fc proteína da fusão (E-cad-Fc) ou outras matrizes apropriados para cultura hPSC ⁶
   1. Dilua E-cad-Fc a 15 μg/mL com Phosphate-Buffered salina de Dulbecco contendo cálcio e magnésio (DPBS (+)).
   2. Casaco pratos de cultura de tecidos de suspensão de 100 mm com 5 mL de diluídos E-cad-Fc e incubar a 37 ˚ c pelo menos 1 h. substrato de remover e substituir com 5 mL de meio (por exemplo, mTeSR1 conhecido como M-médio doravante)⁷.
      Nota: O meio de cultur....

Resultados

Geração de hepatócito - como células: A Figura 1 descreve a cronograma das mudanças que ocorrem durante a diferenciação das iPSCs humano para hepatócitos células. A cultura de iPSCs em E-Cad-Fc fornece aproximadamente 2mm colônias de diâmetro que expressam o marcador pluripotentes OCT4 (figura 1A-B). A morfologia das células cultivadas em uma matriz de E-caderina.......

Discussão

Alvo baseado descoberta de drogas, onde as moléculas pequenas são identificadas que influenciam a atividade de uma proteína específica, tem sido o foco de muitos esforços de rastreio existentes. Embora essa abordagem forneceu inúmeros produtos farmacêuticos, telas com base em reverter um fenótipo, farmacologia clássica, têm sido mais bem sucedidos na identificação de compostos de primeira classe que foram clinicamente eficaz¹. Uma desvantagem para descoberta de drogas fenotípica é que ele depende .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de tecidos estéreis de 100 mm x 20 mm	Placas	Corning 430167
100 mm x 20 mm	de tecidos de		Corning
	Corning	3595
Anti-humano Albumina	Dako	A 0001
Anti-humano FOXA2 (6C12)	Novus Biológico	H00003170-M12
Anti-humano HNF4 alfa	Santa Cruz	SC-6556
Anti-humano Oct-3/4 anticorpo	Santa Cruz	SC-9081
Anti-humano SOX17	R & D	AF1924
Anti-humano TRA-1-60 FITC conjugado	Millipore	FCMAB115F
Activin A Proteína Humana Recombinante	Invitrogen	PHC9563
Suplemento B-27, menos insulina	Invitrogen	0050129SA
B-27 Suplemento, sem soro	Invitrogen	17504044
BMP4 Proteína Humana Recombinante	de Células PHC9533		Invitrogen
StemPro  Accutase	Invitrogen	A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Feasibility Assay	Promega	7572
DPBS+(cálcio, magnésio)	Invitrogen	14040-133
DPBS-(sem cálcio, sem magnésio)	Invitrogen	14190-144
DMEM/F-12, HEPES	de	APOB 11330057
Mabtech	3715-1H-20
Fator de Crescimento de Fibroblastos 2 (FGF2)	Invitrogen	PHG0023
Meio de Cultura de Hepatócitos (HCM Bullet Kit)	Lonza	CC-3198
(HGF)	Invitrogen	PHC0321
L-Glutamina	Invitrogen	25030081
MEM	Invitrogen 11140076
Oncostatina M (OSM) Proteína Humana Recombinante	Invitrogen	PHC5015
Penicilina-Estreptomicina	Invitrogen	15140163
Meio de células-tronco pluripotentes livre de alimentador: mTesR1	STEMCELL technologies	5850
Matriz de Membrana de Basement de Fator de Crescimento Reduzido	Invitrogen	A1413301
RPMI 1640 Médio, HEPES	Invitrogen	22400105
StemAdhere Matriz Definida para hPSC (E-cad-FC)	Primorigen Biosciences	S2071
TMB-ELISA Solução de Substrato	Thermo Scientific	34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugado	Millipore	FCMAB115F
Versene (EDTA) 0,02%	Lonza	17-711E
Y-27632 inibidor de ROCK	STEMCELL Technologies	72302

de cultura de suspensão estéril Placa de cultura 96 poços 430591 Reagente de Dissociação Kit desenvolvimento de ELISA humano InvitrogenFator de Crescimento de Hepatócitos Solução de Aminoácidos Não Essenciais